U sinergističkim kombinacijama lijekova na bazi silikona iz biljnih lijekova: slučaj upotrebe Cistanche Tubulosa

Molimo pošaljite emailtina.xiang@wecistanche.comili kontaktirajte WhatsApp: plus 8618283608063 za više informacija

Neuroinflamacijakarakteriše je razrađen repertoar upalnih odgovora tkiva centralnog nervnog sistema. Ograničenja trenutnih tretmana za neuroinflamaciju su dobro poznate nuspojave u kliničkim ispitivanjima monoterapije. Kombinovane terapije lijekovima su obećavajuće strategije za prevazilaženje kompenzacijskih mehanizama i efekata izvan cilja. Međutim, otkriće sinergističkih kombinacija lijekova iz biljnih lijekova rijetko je. Ohrabreni uspešno primenjenim slučajevima prelazimo na istraživanje efikasnih kombinacija lekova zasnovanih na sistemskoj farmakologiji između jedinjenja iz Cistanche tubulosa (SCHENK) R. WIGHT. Prvo, 63 potencijalna bioaktivna jedinjenja, srodnih 133 direktne i indirektne mete su skrinirane procenom sličnosti leku u kombinaciji sa procesom ciljanja leka. Drugo, mreža Compound-Target je izgrađena da prikupi skup podataka za predviđanje kombinacija lijekova. Navodimo 10 najboljih kombinacija lijekova koje koristi algoritam Probability Ensemble Approach (PEA), a mreža spojeva-cilja-puta se zatim konstruira od 12 spojeva kombinacija, ciljeva i puteva kako bi se otkrila odgovarajuća farmakološka djelovanja. Konačno, razvijen je integrirajući pristup kako bi se razjasnili terapeutski efekti biljke u različitim patološkim karakteristikama relevantnim biološkim procesima. Sve u svemu, ova metoda može pružiti produktivan put za razvoj kombinirane terapije lijekova.

Neurogenineuroinflamacijedefinira se kao orkestrirano djelovanje urođenih i adaptivnih imunoloških ćelija, vaskularnih ćelija i neurona izazvano patološkim stanjima i pojačanom neuronskom aktivnošću u centralnom nervnom sistemu (CNS). Vjerovatno će igrati ulogu u pokretanju CNS-ainflamatornoreakcije na stanja kao što su bol, psihološki stres i epilepsija ili postaju patogeni faktor neurodegenerativnih bolesti. Trenutni agens za liječenje neuroinflamacije uglavnom pripada monoterapiji, uključujući dopamin, somatostatin, neuropeptid, adenozin i tako dalje. Međutim, na primjer, dugotrajna upotreba uobičajenih, ali starih lijekova inhibitora COX-a, nesteroidnih protuupalnih lijekova (NSAID), može uzrokovati štetne nuspojave, gastrointestinalne lezije ili kardiovaskularne rizike1,2 a rezultati kliničkih ispitivanja ostaju nezadovoljavajući posebno3, 4, tako da postoji nezadovoljena potreba za novim tretmanima neuroinflamacije.

Nova terapija kombinatorikom lijekova može biti strategija koja se naglo povećava za zadovoljavanje potreba razvoja novih lijekova, kao i za prevazilaženje prepreka u liječenju složenih bolesti. Kombinacija višekomponentne terapije mogla bi ispuniti gore navedene zahtjeve, u kojoj se dva ili više lijekova koriste zajedno5, sa navedenim prednostima: veća efikasnost, minimalna unakrsna rezistencija, niska doza uz manje nuspojava i manja toksičnost u odnosu na pojedinačni lijek agent6. U liječenju složenih bolesti7,8 koristi se skoro 30 godina. Intrigantno, kombinovana terapija lijekovima također se primjenjuje u istraživanju neuroloških bolesti, na primjer, kombinacija glimepirida i ibuprofena može efikasno smanjiti upalu kod Alchajmerove bolesti (AD)9 ili ketamin/atropin može smanjiti ekspresiju proupalnih proteina kod epileptičnih miševa10. Sinergističke kombinacije lijekova stoga mogu donijeti novu inspiraciju za praćenje efikasnih tretmana zaneuroinflamacije. Dakle, kako možemo slomiti tvrd orah da bismo postigli optimalne kombinatorne lijekove?

1Ključna laboratorija za biologiju resursa i biotehnologiju u zapadnoj Kini, Ministarstvo obrazovanja, Škola prirodnih nauka, Univerzitet Northwest, Xi'an, Kina. 2Laboratorija sistemske farmakologije, Centar za bioinformatiku, College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling, Kina. 3 Državna ključna laboratorija za nove tehnologije za kinesku medicinu, farmaceutski proces, Jiangsu Kanion Parmaceutical Co. Ltd, Lianyungang, Kina. Jianling Liu i Jinglin Zhu podjednako su doprinijeli ovom radu. Prepisku i zahtjeve za materijale treba uputiti na CZ

Jianling Liu1, Jinglin Zhu1, Jun Xue1, Zonghui Qin1, Fengxia Shen1, Jingjing Liu1, Xuetong Chen2, Xiaogang Li1, Ziyin Wu2, Wei Xiao3, Chunli Zheng1 i Yonghua Wang1

Danas su postojeći pristupi skriningu kombinacija lijekova sljedeći: sistematska istraživanja parova lijekova in vitro, kao što je metoda skrininga visoke propusnosti11 i 'Multipleksni skrining interacting Compounds' (MuSIC)12 ili evaluacije kombinacija lijekova u paru sa velikim -eksperimenti na skali13,14. Ipak, prekomjerna potrošnja radne snage, prirodnih resursa i vremena mukotrpnog empirijskog testiranja može biti neizbježan problem u evaluaciji učinkovitih kombinacija lijekova. Kao odgovor na prevazilaženje nedostataka, pristupi zasnovani na mrežnoj analizi, posebno mrežama genetskih interakcija15, podacima o biologiji hemijskih sistema16, i molekularnim i farmakološkim podacima17, takođe su se pojavili za kombinatorno otkrivanje lekova. Nadalje, sve veći broj istraživača18,19 predložio je nove mrežne pristupe za predviđanje optimalnih kombinacija i ponudio odgovarajuću eksperimentalnu validaciju u međuvremenu, tako da integracija mrežnog predviđanja s eksperimentalnom validacijom može biti novi trend u polju kombinacijskog predviđanja.

Biljni lijekovi uključuju znatan broj formula (Fang-Ji na mandarinskom) i hemijskih sastojaka, koji formiraju bazu podataka prirodnih proizvoda, tako da mogu priuštiti inovativne tragove, osnovne biološke podatke za razvoj kombinacija lijekova, kako kažu profesor Li20,21 i prof. Liu22 je uveo metode holističke analize zasnovane na integriranoj biologiji kako bi dešifrirao molekularne mehanizme biljnih lijekova: Liu-Wei-Di-Huang pilula ili Reducing Injection. U našem prethodnom radu otkrili smo ne samo da dvije reprezentativne biljke Lonicera japonica i Fructus Forsythia pokazuju sinergističke efekte na gripu ili upale23, već i jedinjenja rutin i amentoflavon imaju sinergističke efekte u prevenciji depresije24.

U našem trenutnom radu razvijamo sistemski farmakološki pristup kako bismo otkrili sinergističke kombinacije lijekova između spojeva iz biljke.Cistanche tubulosa(SCHENK) R. WIGHT, predlažu se sljedeći koraci: prvo, odabiremo bioaktivna jedinjenja kroz predviđanje sličnosti s lijekovima, koja se koriste kao mamac za pecanje srodnih ciljeva. A zatim, inspirisani paradigmom zasnovanom na "mrežnom metu" da dajemo prioritet kombinacijama sinergijskih agenasa na način visoke propusnosti25, dobijamo efikasne kombinacije lekova među potencijalnim jedinjenjima zasnovanim na internom algoritmu koji se naziva pristup ansambla verovatnoće (PEA)26 sa visoka efikasnost treninga, široka primjenjivost i dva kvantitativna indeksa za opisivanje svojstva kombinacije lijekova. Konačno, koristimo dobijene ciljeve i spojeve parova kandidata za izgradnju mreže/puta, a zatim pružamo analizu kako bismo kodirali mehanizamCistanche tubulosaonneuroinflamacijeholistički. Kao primjer, ovo je prvi put da se odstrane efikasne kombinacije lijekova iz prirodnih proizvoda zasnovanih na sistemskoj farmakologiji kroz integraciju računskih metoda i eksperimentalne validacije kako bi se potvrdila pouzdanost predviđanja. Vjerujemo da ovo može pomoći u personalizacijitretman neuroinflamacije, poboljšati naše razumijevanje efikasnog neuroprotektivnog razvoja i pomoći će budućim pretkliničkim istraživanjima.

Rezultati

Meta Cistanche tubulosa.

Da biste dobili ciljeve u vezineuroinflamacijeprvo postižemo sastojkeCistanche tubulosa(SCHENK)R. WIGHT pretraživanjem TCMSP baze podataka (http://lsp.nwu.edu. cn/), što rezultira 103 jedinjenja (Dopunska tabela S1, vidi materijale i metode). Zatim analiziramo njihovu sličnost s lijekovima primjenom DL modela predviđanja konstruisanog u našem prethodnom radu (Vidi Materijali i metode). Na ovaj način postižemo 63 potencijalna bioaktivna jedinjenja (Dopunska tabela S2) sa DL indeksom većim ili jednakim 0.18. Nakon toga, pomoću Sys DT i WES algoritama, identifikujemo 117 meta ovih potencijalnih bioaktivnih jedinjenja. Konačno, 43 potencijalna cilja (Dopunska tabela S3) usko povezana s neuroinflamacijom se preuzimaju nakon brisanja šuma i grešaka, mapiranjem 117 ciljeva spojeva u CTD bazu podataka.

GOBP analiza obogaćivanja za ciljeve.

Provjeriti da li su proteini na koje ciljaju potencijalna bioaktivna jedinjenja usko povezanineuroinflamacije, vršimo analizu obogaćivanja GOBP-a kroz mapiranje ciljeva na DAVID. Slika 1 prikazuje GO stablo koje predstavlja rezultate značajno obogaćenih GOBP termina (P vrijednost manja ili jednaka 0.05), gdje su mete kategorizirane u 20 različitih grupa, kao što je pozitivna regulacija glatkih mišića krvnih sudova proliferaciju ćelija i pozitivnu regulaciju migracije leukocita. Među ovim grupama, hemijski sinaptički prenos,inflamatornoodgovor, signalizacija stanica-ćelija i tako dalje su usko povezanineuroinflamacije. Na primjer, sinaptičke promjene koje se javljaju tokom neuroinflamatornih bolesti su uglavnom posredovaneinflamatornocitokini koji se oslobađaju iz infiltrirajućih T ćelija i iz aktivirane mikroglije i odgovorni su, barem djelomično, za ireverzibilnu dendritsku patologiju (zajedno, ova zapažanja sugeriraju da predviđeni ciljevi vjerovatno mogu doprinijeti liječenjuneuroinflamacije.

Izgradnja i analiza složene ciljne mreže.

Generalno, izvodljive i efikasne kombinovane terapije su kombinacije bioaktivnih jedinjenja sa idealnim farmakokinetičkim svojstvima, koje mogu uravnotežiti mrežu bolesti regulacijom specifičnih ciljeva. Stoga dalje konstruiramo statičku složenu-ciljnu mrežu da provjerimo njihove topološke odnose. Kao što je prikazano na slici 2, bipartitna mreža jedinjenja-cilja(CT) pokazuje 482 interakcije između 63 jedinjenja i 43 mete na vizuelno privlačan način. Analiziramo stepen čvorova u mreži složeno-cilj, što rezultira prosječnim stepenom po spoju od 11,209 i 7,651 po meti, respektivno. Uočavamo da među 63 jedinjenja, njih 38 prilagođava više od 7 ciljeva (veći od prosječnog stepena), manifestirajući potencijalne sinergističke efekte među njima.

Na primjer, syringin (mol30) stupa u interakciju s najvećim brojem meta, koje mogu igrati ulogu čvorišta u mreži. Zanimljivo, studija dokazuje da je fenolni sastojak syringin izolovan iz Euonymus alatus(Thunb.) Sieb. (Celastraceae) ima anti-neuroinflamatorni efekat tako što inhibira proizvodnju NO 2.2'-acetilakteozid (mol42) kontroliše 10 različitih ciljeva (stepen=10). Među ovim ciljevima, HSPB1 (također poznat kao HSP27), kao primjer je molekularni šaperon koji pokazuje neuroprotektivna svojstva kod mnogih bolesti i modela ozljeda. Za verbaskozid (mol33), neuroprotektivna svojstva ovog bioaktivnog jedinjenja uključuju modulaciju transkripcionih faktora i posljedično promijenjenu ekspresiju gena, što rezultira smanjenjem regulacije upale30. Vrijedi napomenuti da iako topološka osobina mreže nije pristrasna prema ehinakozidu (mol41, stepen=7), to je potencijalno novo oralno aktivno jedinjenje za regulaciju neuroinflamacije i povezanih signala kod Parkinsonove bolesti i može pružiti novu mogućnost kliničkog liječenja. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da su svi testirani potencijalni aktivni spojevi povezani s neuroinflamacijom i mogu se smatrati skupom podataka za predviđanje kombinacija lijekova.

Izgradnja i analiza mreže složenih-cilja-puta.

Primenom PEA algoritma dobijamo 10 različitih kombinacija lekova (Tabela 1.), koje uključuju 12 jedinjenja. Sve ove kombinacije lijekova imaju veliku vjerovatnoću sinergije, što predstavlja mogućnost izazivanja sinergije između dva spoja. Stoga se u određenoj mjeri ovi spojevi smatraju farmakološkim osnovnim supstancama Cistanche tubulosa. Na osnovu ciljnih informacija ovih jedinjenja i puteva izvedenih od DAVID-a, konstruisali smo mrežu jedinjenja-cilja-puta (CTP) kako bismo preliminarno osvetlili molekularne mehanizme ovih jedinjenja. Rezultirajuća mreža složeni-cilj-puta sastoji se od 47 čvorova i 99 rubova. Kao što je ilustrovano na slici 3, ova jedinjenja mogu da deluju ne samo na proteine ​​uzvodno, već i nizvodno od puteva povezanih sa neuroinflamacijom, posebno na direktne indikatore markera upale.

Konkretno, velika većina spojeva cilja na uzvodne proteine ​​kao što su HSPB1, HTR2A, NTSRl i drugi, što ukazuje na makroregulaciju ovih spojeva za liječenje neuroinflamacije. Na primjer, spoj ehinakozid (mol41) cilja na VEGF put kroz protein HSPB1 (dodatna slika 1). Na sreću, studije pokazuju da HSPB1 ima značajna citoprotektivna svojstva u nekoliko modela neuroloških bolesti in vivo ili in vitro i da može igrati ulogu u protuupalnim efektima regulacijom signalnog puta nuklearnog faktora-KB(NF-KB)435. Osim toga, studija takođe pokazuje da R-Ras može regulisati angiogene aktivnosti endotelnih ćelija delimično putem inhibicije p38 mitogen-aktivirane protein kinaze (p38 MAPK)-HSPB1 ose VEGF signalnog puta*.

Možemo dobiti da jedinjenje tubulozid A (mol56) cilja na signalni put kalcijuma kroz protein NTSRl u mreži. Poznato je da su joni kalcijuma (Ca² plus) univerzalni drugi glasnik u ćelijama imunog sistema. Smanjenje sinaptičke aktivnosti ili povećana signalizacija receptora ekstrasinaptičke N-metil-D-asparaginske kiseline (NMDA) može dovesti do nuklearne kalcijeve dishomeostaze37,38, čime se povećava pojava neurodegeneracije i kognitivne disfunkcije. Nadalje, ciljni protein NTSRl je član velike superfamilije receptora vezanih za G-protein, a signalizacija se generiše kroz vezivanje G-proteina koji može aktivirati fosfatidilinozitol-kalcijum sekundarni sistem glasnika i nizvodne MAP kinaze9.

Drugi primjer je da jedinjenje 2'-acetilakteozid (mol42) cilja GnRH signalni put kroz protein PRKCD. PRKCD, jedna od izoformi PKC, glavni je posrednik aktivacije ekstracelularno reguliranih proteinskih kinaza1/2 MAPK(ERK1/2 MAPK), c-Jun N-terminalnih protein kinaza MAPK(JNK MAPK) i p38 MAPK od strane gonadotropina- oslobađajući hormon (GnRH)0. I, kao ključni procesi u GnRH-stimuliranoj signalnoj mreži, nizvodne MAPK kaskade i metaboliti arahidonske kiseline (AA) mogu proizvestiinflamatornoprotein, COX{0}}. Što se tiče kankanozida O (mol18) i siringina (mol30), oni stupaju u direktnu interakciju sa nizvodnim proteinima PTGS2, NOS2 i drugiminflamatornoindikatori, što je intuitivan odraz efikasnosti jedinjenja. Studija pokazuje da bi siringin mogao potisnuti proizvodnju faktora tumorske nekroze-c (TNF-c) u ćelijama RAW264.7 stimuliranim lipopolisaharidima (LPS)42. I druge studije pokazuju da svringin također može smanjiti koncentraciju NO i aktivnost NOS ili proizvodnju prostaglandina E2. Izoakteozid (mol43) ciljani MMP9, važan je igrač u centralnom nervnom sistemu i bio bi potencijalno posredujući enzim za neuropsihijatrijske poremećaje kao što su šizofrenija i bipolarna bolest5, degradacija NF-KB i fosforilacija p38, ERK1/2, JNK MAPK ili Akt (protein kinaza B) uzvodnih signalnih puteva može modulirati ekspresiju gena MMP9 i inhibiciju MMP9 što može smanjiti ekspresiju inducibilne sintaze dušikovog oksida (iNOS) inaktiviranih stanica46-48

Analiza puta.

Inkorporirani "neuroinflamacijski put" je konstruiran integracijom ključnih puteva dobivenih analizom mreže spojeva-cilja, uključujući put Alchajmerove bolesti, signalni put kalcija, signalni put GnRH, signalni put VEGF i serotoninergičku sinapsu. Od 43 cilja, 19 se može mapirati na "put neuroinflamacije". Kao što je prikazano na slici 4, Cistanche tubulosa predstavlja mete aktivnih spojeva koji se distribuiraju u "putu neuroinflamacije". "Neuroinflamacijski put" je klasifikovan u 13 različitih terapeutskih modula, kao što su smrt ćelije, apoptoza, upala i neuroprotekcija. U ovoj studiji uzimamo module za smrt ćelije, upalu i neuro-zaštitne module kao primjere za razjašnjavanje mehanizma Cistanche tubulosa za neuroinflamaciju.

Modul smrti ćelije. Ciljevi koji se nalaze na putu Alchajmerove bolesti uglavnom su uključeni u proces smrti ćelije, što sugeriše da je ćelijska smrt usko povezana sa neuroinflamacijom. Studije pokazuju da neuroinflamacija posredovana mikrogijom doprinosi smrti neuronskih stanica, koja nije ograničena na određenu bolest, već je implicirana u različitim bolestima kao što su ishemija4, Parkinsonova bolest i Alchajmerova bolest5l. Kao što je prikazano na sl.4,

cilja APP, GRIN2B i MAPT reguliraju aktivni spojevi iz Cistanche tubulosa što ukazuje da oni mogu inhibirati ćelijsku smrt i na taj način ponuditi tretman za neuroinflamaciju. Zanimljivo je da APP intracelularna domena narušava neurogenezu odraslih kod transgenih miševa izazivanjem neuroinfamacije52. Nesposobnost MAPT-a pravilno reguliše dinamiku neuronskih mikrotubula i na taj način posreduje smrt neuronskih ćelija53. Sve ovo ukazuje da Cistanche tubulosa može liječiti neuroinflamaciju inhibiranjem ćelijske smrti.

Inflamacijski modul.

Termin neuroinflamacija je inflamatorna reakcija u CNS-u kao odgovor na neuronsku aktivnost1. U ovoj studiji otkrivamo GnRH signalni put i VEGF signalni put koji je uključen u inflamatorni modul (slika 4). Na primjer, MMP2 u GnRH signalnom putu pripada porodici MMP, koji se izražavaju u fiziološkim situacijama i patološkim stanjima koja uključuju upalu. A MMP reguliraju nekoliko funkcija povezanih s upalom, uključujući bioraspoloživost i aktivnost upalnih citokina i hemokina54. Osim toga, VEGF signalni put može dovesti do stvaranja NOS2, štoviše, on učestvuje u akutnom inflamatornom odgovoru na LPS višestrukim mehanizmima: uključivanjem u signalizaciju proinflamatornih citokina i promjenom ekspresije različitih gena koji utječu na inflamatorno-imune odgovore na LPS55. Sve ovo zajedno ukazuje da Cistanche tubulosa može izliječiti neuroinflamaciju regulacijom inflamatornog sistema.

Neuroprotection modul.

Neuroprotekcija su mehanizmi i strategije koje se koriste za zaštitu od neuronskih ozljeda ili degeneracije u CNS-u nakon akutnih poremećaja (npr. moždanog udara ili ozljede/traume nervnog sistema) ili kao posljedica hroničnih neurodegenerativnih bolesti (npr. Parkinsonova, Alchajmerova, multipla skleroza). Cilj neuroprotekcije je ograničiti neuronsku disfunkciju/smrt nakon povrede CNS-a i pokušati održati najveći mogući integritet ćelijskih interakcija u mozgu što rezultira neometanom neuralnom funkcijom. Kao što se može vidjeti sa slike 4, neke mete na putu serotoninergičke sinapse uključene su u funkciju neuroprotekcije. Na primjer, proizvodnja prostaglandina putem PTGS1 i PTGS2 (također poznatih kao COX-1 i COX-2) je suštinski posrednik u izazivanju protuupalnih i novih mehanizama za rješavanje problema56. Nedavna studija je pokazala da je ekspresija gena ADCY5, enzima koji katalizuje stvaranje cAMP57, smanjena metilacijom promotora u COX{10}}indukovanim ljudskim HCC ćelijskim linijama58. Na osnovu gornje analize, spekulišemo da akumulacija COX-2 može uticati na lučenje sAPP, cijepanje APP-a cijepanog -sekretazom koja je modulirana cAMP-om i dalje vršiti neuroprotektivni efekat59,60. Naši rezultati pokazuju da neuroprotekcija igra važnu ulogu u liječenju neuroinflamacije.

Eksperimentalna validacija

Vijabilnost BV2 mikroglijalnih ćelija tretiranih ovim jedinjenjima.

BV2 mikroglijalne ćelije (8×104 ćelije/ml) se hrane koncentracijama od 37,5 do 300 uM po mililitru medija za kulturu bez seruma od četiri jedinjenja tokom 24 h. Vijabilnost ćelija kontrolne grupe kultivisane u odsustvu seruma sa manje od 0,1 procenata DMSO smatramo 100 procenata (slika 5(ad)). Očigledno, nije uočena značajna ćelijska citotoksičnost pri propisanim dozama grupa.

Validacija sinergije lijekova i potencijalnog protuupalnog djelovanja in vitro.

Za daljnju procjenu dobivenih rezultata u siliconusu, odabrana su četiri spoja koji pokrivaju tri sinergistička para, a to su izoakteozid, 2'-acetilakteozid, ehinakozid i verbaskozid, kako bi se ispitali njihovi sinergistički efekti lijekova i potencijalni protuupalni učinak korištenjem BV2 ćelija tretiranih LPS-om. Konkretno, provodimo Western blot analizu za ekspresiju proteina iNOS i COX-2 kako bi se uskladili sa sinergijskim i antiinflamatornim efektima predviđenih kombinacija lijekova.

Kao što je prikazano na slici 5(npr.), prikazani su nivoi iNOS i COX-2 proteina u panelu testiranih BV2 ćelijskih linija. Uočavamo da se, bilo tretmanom izoakteozidom ili 2'-acetilakteozidom, ekspresija proteina iNOS i COX-2 u BV2 ćelijama značajno smanjuje pri različitim nivoima doze. Međutim, tretman kombinacijom izoakteozida i 2'-acetilakteozida izaziva značajno povećanje inflamatornih faktora iNOS i COX-2(Sl.5(e)). Slika 5(1) ilustruje da tretman ehinakozidom ili verbaskozidom, kao pojedinačnim agensom, uzrokuje smanjenje ekspresije iNOS i COX-2. Štaviše, očekivano, tretman ehinakozidom u kombinaciji sa verbaskozidom u koncentraciji od 150 μM rezultirao je izraženijim smanjenjem nivoa ekspresije proteina (iNOS i COX-2), što ukazuje na sinergističko protuupalno djelovanje ovog kombinacija lijekova. Slično, kao što je prikazano na slici 5(g), kombinacija ehinakozida i 2'-acetilakteozida pokazuje značajan sinergistički efekat na inhibiciju COX-2 u koncentraciji od 75 μM ili 300 μM. Međutim, za iNOS, u dozi od 300 μM, kombinacija predstavlja izraženu supresiju proteina. Nasuprot tome, nalazimo da nema očiglednih inhibicijskih efekata na iNOS i COX-2 u vezi sa kombinacijom izoakteozida i 2'-acetilakteozida ili ehinakozida i verbaskozida u koncentraciji od 75 μM (dopunska slika 2), osim tretmana sa drugim parovima pokazuje mnogo slabiji efekat u poređenju sa pojedinačnim agensima u dozama od 150 ili 300 μuM što se može videti na slici 5 (npr.).

Ukratko, in vitro studija pruža dodatne informacije za skrining kombinacija lijekova sa snažnim protuupalnim efektima i pokazuje pouzdanost strategije in silico screeninga.

Diskusija

Neuroinflamacija je uključena u većinu neuroloških, psihijatrijskih i neurorazvojnih bolesti jer nije samo posljedica već može biti i okidač patologije6!. Međutim, trenutni tretmani za neuroinflamatorne bolesti su uglavnom monoterapije, ograničene dobro poznatim nuspojavama kao što znamo. COX-2 inhibitori mogu dovesti do kardiovaskularnih defekata koji reaguju na dugotrajno liječenje, a liječenje usmjereno na TNF može uzrokovati infekciju putem imunosupresije62. Kombinatorni terapijski pristupi mogu biti imperativ za poboljšanje liječenja složenih bolesti sa sljedećim prednostima: otpornost mreže i kompenzacija zaobilaznice. povećana klinička efikasnost uz održavanje minimalne toksičnosti za ljude i smanjena doza svakog spoja63. Međutim, istraživanje sinergističkih kombinacija lijekova između spojeva izvedenih iz biljnih lijekova na osnovu sistemske farmakologije je malo ograničeno mogućim glavnim razlogom velikih količina jedinjenja.

In the work, we firstly gain 63 potential bioactive compounds from the herb Cistanche tubulosa, fulfilling the criteria (DL>0.18) za dalju analizu uz pomoć predviđanja koje je neophodno da bi se izdvojili perspektivniji molekuli sa poželjnim svojstvima. Nakon mapiranja 133 cilja od 63 potencijalna bioaktivna jedinjenja u bazu podataka, dobijamo 43 cilja koji se odnose na neuroinflamaciju, a zatim GOBP klasterska analiza predviđenih ciljeva vjerovatno može doprinijeti liječenju neuroinflamacije. Analitički rezultat CT mreže pokazao je prosječan stepen po spoju od 11,209 i 7,651 po meti, respektivno, a njih 38 prilagođava više od 7 ciljeva (veći od prosječnog stepena). Na primjer, ehinakozid (mol41)4- predviđen sa 7 meta, verbaskozid (mol33)3067 sa 9 ciljeva, ili tubulozid B(mol57)686 sa 8 meta mogu igrati ključnu ulogu u neuroprotekciji u skladu sa sve većom literaturom.

Postižemo direktne terapeutske ciljeve kao što su APP, MAPT (također poznat kao Tau), PPARG70, MMP9, MMP27172 i HTR2A (takođe poznat kao 5-HT2A), GRIN2B (glutamatni jonotropni receptor NMDA tip podjedinica 2B) i GRIA1( glutamatni jonotropni receptor AMPA podjedinica 1) ili nizvodno potencijalne mete kao što su PTGS274 ili NOS27 koje su povezane s neuroinflamacijom ili raznim bolestima nervnog sistema,

Analiza mreže Compound-Target-Pathway prikazuje 12 spojeva iz prvih 10 parova lijekova kroz PEA algoritam, povezanih sa 43 potencijalna cilja i putevima povezanim s neuroinflamacijom, na primjer, signalni put kalcija, interakcija neuroaktivnog liganda i receptora ili TNF signalni put, i tako dalje. U sistemu, ova predviđena jedinjenja mogu delovati ne samo na proteine ​​uzvodno, već i nizvodno od puteva povezanih sa neuroinflamacijom i inflamatornim biomarkerima. posebno, osim toga, date su dodatne informacije za skrining kombinacija lijekova s ​​potencijalnim protuupalnim efektima, a pouzdanost in silico screen strategije je potvrđena eksperimentalnom validacijom. Neuroinflamacijski put se sastoji od puta Alchajmerove bolesti, signalnog puta kalcijuma, signalnog puta GnRH, signalnog puta VEGF i serotoninergičke sinapse. Analitički rezultati jasno su nam objasnili da su moduli smrti ćelije, upale i neuroprotekcije prikazani kao primjer za dešifriranje mehanizma Cistanche tubulosa za liječenje neuroinflamacije.

Neuroinflamacije prate različite neurodegenerativne bolesti koje mogu biti ne samo posljedica već i okidač patologije, pa se antiinflamatorne terapije predlažu kao obećavajući pristup liječenju! Na naše razočaranje, iako smo shvatili ograničenost monoterapije, evaluacija i osnovni mehanizmi kombinovanih terapija i dalje su glavni izazovi u razvoju nove alternativne strategije. Stoga bi ovaj rad mogao ponuditi nove terapeutske mogućnosti za neuroinflamaciju i otvoriti novi put za otkrivanje kombinacija lijekova iz prirodnih proizvoda.

Materijali i metode

Zbirka spojeva.

Ukupno 66 hemijskih sastojaka Cistanche tubulosa ručno je prikupljeno iz TCMSP (http://lsp.nwuedu.cn/)6, uključujući 26 feniletanoidnih glikozida, 22 iridoida, 4 lignana, 7 mono-terpenskih glikozida, 2 azotne supstance, 3 benzena akriloil šećeri, 1 sterol, 1 ketol. S obzirom da se glikozidi u Cistanche tubulosa obično hidroliziraju kako bi se oslobodio aglikon koji se zatim apsorbira u crijevnoj sluznici, stoga u obzir uzimamo molekule bez glikola, koji su označeni kao qt. To je dovelo do stvaranja 103 jedinjenja. Ovi molekuli su dati u Dodatnoj tabeli S1.

Procjena sličnosti sa drogom. Da bismo dobili potencijalna bioaktivna jedinjenja iz Cistanche tubulosa, procenjujemo sličnost ovih sastojaka sa lekovima izračunavanjem Tanimoto sličnosti77 između biljnih jedinjenja i prosečnih molekularnih svojstava svih hemikalija u bazi podataka Drugbank8. I, DL model predviđanja je uspješno primijenjen u mnogim studijama98 za odabir bioaktivnih spojeva. U radu je DL indeks veći od ili jednak 0.18 kandidata definiran kao vrijednost praga kako bi bolje odgovarao kasnijoj analizi.

Predviđanje cilja za drogu.

Identifikacija ciljeva efikasnosti za vodeća jedinjenja ostaje ključni korak za napredak jedinjenja u razvoju lekova. Ovdje se izvode dva interna alata: SysDT i WES kako bi se izvukle informacije o molekularnom cilju za lov na droge. Sys DT je ​​in silio model koji se izvodi kombinacijom hemijskih, genomskih i farmakoloških informacija zasnovanih na dva moćna matematička alata: Random Forest (RF) i Support Vector Machine (SVM) za efikasno rješavanje problema identifikacije cilja2. Dobijeni model služi kao vrijedna platforma za predviđanje interakcija lijek-meta sa ukupnom preciznošću od 97,3 posto, tačnosti aktiviranog predviđanja od 87,7 posto i inhibiranom preciznošću predviđanja od 99,8 posto. kriterijum filtriranja je definisan kao RF vrijednost veća ili jednaka 0.7 ili SVM veća ili jednaka 0.8 u ovoj studiji.

Ponderisana sličnost ansambla (WES) je novi moćni računarski model za preciziranje direktnih ciljeva leka stvarnih bioaktivnih sastojaka. Kao novi alat, dobijeni model ima dobre rezultate u predviđanju vezivanja sa prosječnom osjetljivošću od 85 posto (SEN) i neobavezujućih obrazaca sa 71 posto (SPE) sa prosječnim površinama ispod operativnih krivulja prijemnika (ROC, AUC) od 85,2 posto i prosječna podudarnost od 77,5 posto . Dobijeni ciljevi se dalje mapiraju u Uniprot (http://www,uniprot.org) kako bi se njihova imena i organizmi naknadno normalizirali. Ovdje biramo samo mete Homo sapiensa za dalju analizu. Kandidati za mete odabranih jedinjenja mapiraju se u CTD bazu podataka (http://ctdbase.org/) kako bi dobili srodne bolesti, a mi konačno izdvajamo potencijalne mete povezane sa neuroinflamacijom.

GO obogaćivanje i analiza za ciljeve. Da bismo ispitali uključene biološke procese dobijenih ciljeva, mapiramo mete u DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)8 i termini sa P-vrijednošću manjom od 0.05 su odabrani u ovaj odeljak.

Analiza kombinacije lijekova.

U našem prethodnom radu, sistemski farmakološki okvir je korišten za predviđanje kombinacija lijekova na novodizajniranom modelu, nazvanom Probability Ensemble Approach (PEA) sa svrhom analize kliničke efikasnosti i štetnih efekata kombinacija lijekova. Detaljno, Bayesova mreža koja se integriše sa algoritmom sličnosti je razvijena za modeliranje kombinacija iz molekularnog i farmakološkog efekta jedinjenja. Tada je predstavljena kombinovana evaluacija koja je umanjila kliničku efikasnost i štetne efekte za predviđene parove26. Ukratko, pokazuje da PEA može predvidjeti efikasnost parova sa visokom specifičnošću i osjetljivošću (AUC=0.90) u našem radu. U ovom radu biramo prvih deset kombinacija lijekova na osnovu njihove vjerovatnoće sinergije, koje predstavljaju mogućnost induciranja sinergije između dva spoja.

Izgradnja i analiza mreže/puta.

Da bi se istražili odnosi između aktivnih sastojaka i upalnih bolesti, Cytoscape 2.8.1, popularni bioinformatički paket za vizualizaciju biološke mreže i integraciju podataka generira mrežu spojeva-cilja (CT) i mrežu spojeva-cilja (CTP). Kvantitativna svojstva mreže analiziraju dva sljedeća dodatka Network Analyzer i CentiScaPe 1.2. U grafičkoj mreži čvorovi označavaju ili spojeve, mete ili puteve, dok rubovi kodiraju interakciju lijek-meta. Da bi se dalje istražili biološki efekti kako ćelijski ciljevi funkcioniraju kroz modulaciju višestrukih metaboličkih puteva, a ugrađeni "put" se sklapa u skladu sa najnovije informacije o patologiji neuroinflamacije. Prvo, pomoću njihovog mapiranja u KEGG bazu podataka (http://www.genome.jp/kegg/), postignuti ciljni profili se agregiraju u nekoliko puteva. Nakon napuštanja indirektnih sekcija, relativno sintetizovani put se ručno integriše na osnovu patoloških i kliničkih podataka.

Eksperimentalna validacija

Priprema uzoraka.

Ehinakozid, verbaskozid, izoakteozid i 2'-acetilakteozid se kupuju od Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kina). Testni uzorci se rastvore u dimetil sulfoksidu (DMSO) (Sigma, SAD) da se dobije 100 mM, kao osnovni rastvor, a zatim se čuvaju na 4°C. Konačna razblaženja DMSO dodatog u medijum kulture nikada nisu prelazila 0,1 posto koji je osigurao da nema uticaja na vitalnost ćelije.

Ćelijska kultura. BV2 ćelije mikroglije miša su originalno razvijene od strane Kineske akademije nauka u Šangaju i uzgajane u bocama od 25 ili 75 cm2 sa Dulbeccovim modifikovanim orlovim medijumom (DMEM/25mM HEPES) (Gibco BRL, SAD) sa dodatkom 10 procenata (FBS) goveđeg seruma Gibco BRL, SAD), penicilin G (100 jedinica/mL) i streptomicin (100 mg/mL) u vlažnom inkubatoru sa 5% CO,/95% O, na 37 stepeni ,5% CO2.

Western blot analiza. Ćelijski protein se ekstrahuje iz ćelijskih linija koristeći QproteomeMammalian Protein Prep Kit (Qiagen, Nemačka) nakon naznačenih procedura u skladu sa protokolom proizvođača. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, SAD) se primjenjuje na kvantifikaciju proteina. Ekvivalentne količine proteina (50ug) se denaturiraju ključanjem na 100 stepeni 10 minuta sa 2*laemmli puferom za punjenje uzoraka (Bio-Rad, USA) plus 5 posto 3-merkaptoetanola u omjeru 1:1 i napunjen po traci na 12% SDS-PAGE (natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid mini gelovi), elektrotransfer na 0,45um poliviniliden fluoridne membrane (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, SAD) tokom 150 min na 2. Nakon toga, membrane se blokiraju u 3 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) na sobnoj temperaturi i inkubiraju sa primarnim antitijelima iNOS i COX-2 (Abcam) na 4 stepena preko noći. Nakon tri temeljna ispiranja u Tris-puferiranom fiziološkom rastvoru-Tween (TBST) svako po 5 minuta, membrane se ispituju sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena (HRP) (1:10000 razrjeđenja; Abcam) 1,5 h na sobnoj temperaturi. Imunoreaktivne trake se zatim vizualiziraju korištenjem ECL kompleta za detekciju hemiluminiscencije (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornija, SAD) nakon dva puta ispiranja u TBST i jednom u TBS, svaki put po 5 minuta. Denzitometrijske vrijednosti su normalizirane korištenjem -aktina kao unutrašnje kontrole opterećenja.

Statistička analiza. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost± standardna greška, Western blot analiza se ponavlja tri nezavisna eksperimenta sa istim rezultatom. Jednosmjerna analiza varijanse se koristi za poređenje razlika srednjih vrijednosti za tri ili više grupa, statistička značajnost se analizira Studentovim testom između dvije grupe. Oprema i postavke. Excel iz Microsoft Office2013 je korišten na sl.1.

Cytoscape 2.8.1 je korišćen na Sl.2. Cytoscape 2.8.1 je korišten na Sl.3.

Visio iz Microsoft Office2013 je korišten na slici 4.

Graphpad Prism 6 i Visio iz Microsoft Office2013 korišćeni su na Sl.5.

Dostupnost podataka. Skupovi podataka generisani tokom i/ili analizirani tokom tekuće studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

Reference

1.Xanthos,DN& Sandkühler,J. Neurogena neuroinflamacija: upalne reakcije CNS-a kao odgovor na neuronsku aktivnost

Nature Reviews Neuroscience 15,43-53(2014).

2. Funk, CD&FitzGerald, GACOX-2 inhibitori i kardiovaskularni rizik. Časopis za kardiovaskularnu farmakologiju 50,470-479 (2007).

3. Reines, S. et al. Rofecoaxib Nema efekta na Alchajmerovu bolest tokom 1- godine, randomizirana, slijepa, kontrolirana studija. Neurology 62, 66-71 (2004).

4. Trepanier, CH& Milgram, NW Neuroinflamacija kod Alchajmerove bolesti: da li su NSAIL i selektivni inhibitori COX{1}} sljedeći

linija terapije? Časopis za Alchajmerovu bolest 21,1089-1099 (2010).

5. Fitzgerald, JB, Schoeberl, B., Nielsen, UB& Sorger, biologija PKSystems i kombinovana terapija u potrazi za kliničkom efikasnošću. Prirodna hemijska biologija 2,458-466 (2006).

6. Sun,X. Vilar,S.& Tatonetti.NPH Metode velike propusnosti za kombinatorno otkrivanje lijekova.Si TranslMed5,205rv201-205rv201 (2013).

7. Manchado, E. et al. Kombinatorna strategija za liječenje KRAS-mutantnog karcinoma pluća. Priroda (2016).

8. Musumeci, G. et al. Kombinacija M48U1 i tenofovira sinergistički inhibiraju HIV infekciju u aktiviranim PBMC i humanim cervikovaginalnim histokulturama. Naučni izvještaji 7, 41018 (2017).

9. Anastasio, TJ Računarska identifikacija potencijalnih kombinacija više lijekova za smanjenje mikroglijalne inflamacije kod Alchajmerove bolesti. Front Pharmacol 6 (2015).

10. Dhote, F. et al. Kombinacije ketamina i atropina su neuroprotektivne i smanjuju neuroinflamaciju nakon toksičnog epileptičnog statusa kod miševa. Toxicol Appl Pharm 259, 195–209 (2012).

11. Lehár, J. et al. Sinergističke kombinacije lijekova imaju tendenciju poboljšanja terapijski relevantne selektivnosti. Prirodna biotehnologija 27, 659–666 (2009).

12. Tan, X. et al. Sistematska identifikacija sinergističkih parova lijekova koji ciljaju HIV. Prirodna biotehnologija 30, 1125–1130 (2012).

13. Cokol, M. et al. Sistematsko istraživanje sinergističkih parova lijekova. Molecular system biology 7, 544 (2011).

14. Winter, GE et al. Sistemsko-farmakološka disekcija sinergije lijekova u CML rezistentnoj na imatinib. Hemijska biologija prirode 8, 905–912 (2012).

15. Wang, Y.-Y., Xu, K.-J., Song, J. & Zhao, X.-M. Istraživanje kombinacija lijekova u mreži genetskih interakcija. BMC bioinformatika 13, S7 (2012).

16. Ryall, KA & Tan, AC Systems biološki pristupi za unapređenje otkrića efikasnih kombinacija lijekova. Časopis za heminformatiku 7, 7 (2015).

17. Zhao, X.-M. et al. Predviđanje kombinacija lijekova integracijom molekularnih i farmakoloških podataka. PLoS računalna biologija 7, e1002323 (2011).

18. Sun, Y. et al. Kombinacija genomskih i mrežnih karakteristika za proširenu sposobnost u predviđanju sinergijskih lijekova za rak. Komunikacije u prirodi 6, 8481 (2015).

19. Jaeger, S. et al. Kvantifikacija unakrsnog razgovora otkriva nove sinergističke kombinacije lijekova za rak dojke. Istraživanje raka 77, 459–469 (2017).

20. Li, S., Zhang, B., Jiang, D., Wei, Y. & Zhang, N. Konstrukcija mreže biljaka i analiza ko-modula za otkrivanje pravila kombinacije tradicionalnih kineskih biljnih formula. BMC bioinformatika 11, S6 (2010).

21. Liang, X., Li, H. & Li, S. Novi pristup mrežne farmakologije za analizu tradicionalnih biljnih formula: Liu-Wei-Di-Huang pilula kao studija slučaja. Mol. BioSyst. 10, 1014–1022, https://doi.org/10.1039/c3mb70507b (2014).

22. Liu, J. et al. Put kao farmakološka meta za biljne lijekove: istraživanje smanjenja injekcija. PLoS One 10, e0123109, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123109 (2015).

23. Wang, X. et al. Sistemska farmakologija otkriva Janusove funkcije botaničkih lijekova: aktivaciju odbrambenog sistema domaćina i inhibiciju replikacije virusa gripe. Integrativna biologija 5, 351–371 (2013).

24. Huang, C. et al. Sistemska farmakologija u otkrivanju lijekova i terapijski uvid u biljne lijekove. Brifinzi iz bioinformatike 15, 710–733 (2014).

25. Li, S., Zhang, B. & Zhang, N. Mrežni cilj za skrining sinergističkih kombinacija lijekova s ​​primjenom u tradicionalnoj kineskoj medicini. BMC sistemska biologija 5, S10 (2011).

26. Li, P. et al. Istraživanje i analiza kombinacija lijekova velikih razmjera. Bioinformatika 31, 2007–2016 (2015).

27. Jeong, EJ et al. Inhibicijski sastojci listova i grančica Euonymus alatus na proizvodnju dušikovog oksida u BV2 mikroglija ćelijama. Hrana i hemijska toksikologija 49, 1394–1398 (2011).

28. Read, DE & Gorman, AM Protein toplotnog šoka 27 u preživljavanju neurona i izrastanju neurita. Biohemijske i biofizičke istraživačke komunikacije 382, ​​6–8 (2009).

29. Sharp, P. et al. Protein toplotnog šoka 27 spašava motorne neurone nakon ozljede živca i čuva funkciju mišića. Exp Neurol 198, 511–518 (2006).

30. Esposito, E. et al. Zaštitni učinak verbaskozida u aktiviranim ćelijama glioma C6: mogući molekularni mehanizmi. Farmakološki arhiv Naunyn Schmiedeberg 381, 93–105 (2010).

31. Sharp, PS et al. Zaštitni efekti proteina toplotnog šoka 27 u modelu ALS javljaju se u ranim fazama progresije bolesti. Neurobiol Dis 30, 42–55 (2008).

32. Chang, KH et al. Potencijal spojeva indola/indolilkinolina u smanjenju tau pogrešnog savijanja povećanjem HSPB1. Cns Neurosci Ter 23, 45–56 (2017).

33. Evgrafov, OV i dr. Mutantni mali protein toplotnog šoka 27 uzrokuje aksonalnu Charcot-Marie-Tooth bolest i distalnu nasljednu motoričku neuropatiju. Prirodna genetika 36, ​​602–606 (2004).

34. Voegeli, TS & Currie, RW siRNA uništava Hsp27 i povećava nivoe fosforilisanog NF-κB p65 izazvanog angiotenzinom II u ćelijama glatkih mišića aorte. Infamm Res 58, 336–343 (2009).

35. Lim, W. et al. Modulacija signalnog puta NF-κB izazvanog lipopolisaharidom zračenjem od 635 nm preko proteina toplotnog šoka 27 u ljudskim ćelijama fibroblasta gingive. Fotohemija i fotobiologija 89, 199–207 (2013).

36. Sawada, J., Li, F. & Komatsu, M. R-Ras inhibira VEGF-indukovanu aktivaciju p38MAPK i fosforilaciju HSP27 u endotelnim stanicama. Časopis za vaskularna istraživanja 52, 347–359 (2015).

37. Feske, S. Kalcijum signalizacija u aktivaciji limfocita i bolesti. Nature Reviews Immunology 7, 690–702 (2007).

38. Bading, H. Nuklearna kalcijeva signalizacija u regulaciji moždane funkcije. Nature Reviews Neuroscience 14, 593–608 (2013).

39. Heakal, Y. et al. Palmitoilacija inducibilna neurotenzinskim receptorom-1 potrebna je za efikasnu mitogenu signalizaciju posredovanu receptorima unutar strukturiranih mikrodomena membrane. Biologija i terapija raka 12, 427–435 (2011).

40. Naor, Z. Signalizacija pomoću G-protein-coupled receptora (GPCR): studije o GnRH receptoru. Granice u neuroendokrinologiji 30, 10–29 (2009).

41. Mugami, S., Dobkin-Bekman, M., Navi, LRB & Naor, Z. Diferencijalne uloge PKC izoforma (PKC) u GnRH stimulaciji fosforilacije MAPK u ćelijama izvedenim iz gonadotropa. Molekularna i ćelijska endokrinologija (2017).

42. Cho, JY et al. In vitro i in vivo imunomodulatorni efekti syringina. J Pharm Pharmacol 53, 1287–1294 (2001).

43. Cui, Y., Zhang, Y. & Liu, G. Syringin može ispoljiti efekte koji potencira san kroz NOS/NO put. Fond Clin Pharmacol 29, 178–184 (2015).

44. Yamazaki, T. et al. ( plus )-Syringaresinol-di-O- -d-glukozid, fenolno jedinjenje iz Acanthopanax senticosus Harms, potiskuje proinflamatorne medijatore u ćelijama humanog sinovijalnog sarkoma SW982 inhibicijom aktivacije proteina-1 i/ili nuklearnog faktora- κB aktivnosti. Toxicology in Vitro 21, 1530–1537 (2007).

45. Rybakowski, JK Matrix metaloproteinase-9 (MMP9)—posredujući enzim kod kardiovaskularnih bolesti, raka i neuropsihijatrijskih poremećaja. Kardiovaskularna psihijatrija i neurologija 2009 (2009).

46. ​​Suh, S.-J. et al. Deoksipodofilotoksin, favolignan, iz Anthriscus sylvestris Hofm. inhibira migraciju i MMP-9 putem MAPK puteva u HASMC izazvanom TNF- -. Vaskularna farmakologija 51, 13–20 (2009).

47. Lee, E.-J. & Kim, H.-S. Inhibicijski mehanizam ekspresije MMP-9 gena etil piruvatom u BV2 mikroglijalnim ćelijama stimulisanim lipopolisaharidom. Neuroscience letters 493, 38–43 (2011).

48. Kim, S.-S. Na 4. međunarodnoj konferenciji o biomedicinskom inženjerstvu u Vijetnamu. 238–243 (Springer).

49. Gehrmann, J., Bonnekoh, P., Miyazawa, T., Hossmann, K.-A. & Kreutzberg, GW Imunocitokemijska studija rane mikroglijalne aktivacije u ishemiji. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 12, 257–269 (1992).

50. Le, W.-d. et al. Aktivacija mikroglija i ozljeda dopaminergičkih stanica: in vitro model relevantan za Parkinsonovu bolest. J Neurosci 21, 8447–8455 (2001).

Istraživanje zahvalnosti je finansijski podržano od strane Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (NO. U1603285, NO. 81373892 i NO. 31540008) i industrijalizacija pilot projekta u Odeljenju za obrazovanje provincije Shaanxi: industrijalizacija zelene hrane bez zagađenja aditivi mikroorganizmi fermentacija (BR. 2010JC22).

Prilozi autora

Autorski doprinosi koncepciji i dizajnu: JLL, YHW i CLZ su osmislili i dizajnirali studiju. Predviđanje cilja lijeka i GO obogaćivanje i analiza za mete: XTC i ZHQ Analiza kombinacije lijekova i izgradnja i analiza mreže/puta: JLZ, ZHQ, FXS i JJL Eksperimenti i prikupljanje podataka JLZ, JX i ZHQ Analiza i interpretacija podataka JLZ , JX, ZYW i WX Nacrt rukopisa: JLZ i CLZA su odobrili konačnu verziju predatog rukopisa: J.LL, CL.Z. i YH.W. Revidirali CLZ, JLZ i XGL

Dodatne informacije

Dodatne informacije prate ovaj rad na https://doi.org/10.1038/s41598-017-16571-3. Konkurentni interesi: Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljenih interesa.

Napomena izdavača: Springer Nature ostaje neutralan u pogledu jurisdikcijskih zahtjeva u objavljenim mapama i institucionalnim vezama.

Otvoreni pristup Ovaj članak je licenciran pod Creative Commons Attribution 4.0 međunarodnom licencom, koja dozvoljava korištenje, dijeljenje, prilagođavanje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju ili formatu, sve dok originalnom autoru date odgovarajuće priznanje (s) i izvor, navedite vezu do Creative Commons licence i naznačite da li su promjene napravljene. Slike ili drugi materijal treće strane u ovom članku uključeni su u Creative Commons licencu za članak osim ako nije drugačije naznačeno u kreditnoj liniji za materijal. Ako materijal nije uključen u Creative Commons licencu za članak i vaša namjeravana upotreba nije dozvoljena zakonskim propisima ili premašuje dozvoljenu upotrebu, morat ćete dobiti dozvolu direktno od nositelja autorskih prava. Da vidite kopiju ove licence, posjetite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. © Te Autor(i) 2017

© 2017. Ovo djelo je objavljeno pod http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ („Licenca“). Bez obzira na ProQuest odredbe i uslove, ovaj sadržaj možete koristiti u skladu sa uslovima licence.