Utjecaj gestacijskog niskog unosa proteina na ekspresiju mikroRNA u bubregu embriona i na progenitorske ćelije nefrona muškog fetusa
Mar 08, 2022
Uvod
Nedostatak nutrijenata može dovesti do signalnih promjena u ključnim putevima tokom različitih faza fetalnog razvoja, što može uzrokovati ireverzibilne poremećaje organa i sistema u odrasloj dobi [1]. Fetalno programiranje se odnosi na svaku uvredu tokom razvoja, koja uzrokuje dugoročne efekte na strukturu ili funkciju organizma [2]. Poremećaji u fetalnom programiranju rezultiraju niskom porođajnom težinom, manjim brojem nefrona i povećanim rizikom od kardiovaskularnih ibubrežniporemećaji u odrasloj dobi [3–6]. Studije drugih autora i nas su pokazale manju porođajnu težinu, 28 posto manje nefrona, smanjenububrežniizlučivanje soli, kroničnozatajenje bubregai arterijska hipertenzija u gestacijskom niskom unosu proteina (LP) u poređenju sa potomcima koji su uzimali standardni (NP) protein u odrasloj dobi [3–7]. Nefrogeneza uključuje strogu kontrolu ekspresije gena, sinteze proteina i remodeliranja tkiva. Studije su pokazale da je broj nefrona određen interakcijama između pupoljaka uretera (UB) i progenitornih ćelija metanefros mezenhima (MM) [8-10]. Signali iz MM indukuju UB-stimulisan rast i grananje sistema tubula. Zauzvrat, MM proliferacija i diferencijacija, koja čini mezenhimsku kapicu (CM), je posredovana UB krajevima [11].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA
Pojavio se ozbiljan interes za ulogu epigenetskih promjena, u vezi s dugoročnim efektima prenatalnog stresa, na razvoj fetusa [12]. MikroRNA (miRNA) su genomski kodirane male nekodirajuće RNK od približno 22 nukleotida dužine i igraju bitnu ulogu u post-transkripcijskoj regulaciji ekspresije ciljnog gena [13-16]. miRNA kontroliraju ekspresiju gena nakon transkripcije regulacijom translacije mRNA ili stabilnosti u citoplazmi [17, 18]. Funkcionalne studije pokazuju da su miRNA uključene u kritične biološke procese tokom razvoja i u ćelijskoj fiziologiji [13, 16]. Promjene u njihovoj ekspresiji uočene su kod nekoliko patologija [16, 19]. Dakle, karakterizacija miRNA pomogla je razumjeti regulaciju gena i ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu i objasniti patofiziološke poremećaje, uključujućibubregporemećaji [20–22]. Studije su objavile da je tokombubregontogene miRNA su neophodne za razvoj nefrona [23-26]. Štaviše, nedovoljna ekspresija nekih miR NA u MM progenitornim ćelijama smanjuje ćelijsku proliferaciju, što dovodi do rane diferencijacije, a samim tim i do smanjenja broja nefrona [27, 28]. Ovaj fenomen karakterizira povećana apoptoza i visoka ekspresija Bim u progenitornim stanicama [27]. Dakle, miRNA moduliraju ravnotežu između apoptoze i proliferacije ovih metanefričnih primarnih ćelija [29].
Pretpostavili smo da su nepoznate epigenetske promjene i profiliranje ekspresije miRNA povezani sbubregrazvojni poremećaji kod majčinih potomaka ograničenih proteinima. Stoga smo imali za cilj procijeniti obrasce miRNA i predviđenu ekspresiju gena u fetusububregu 17 dana gestacije (17-DG) muško potomstvo ograničeno na proteine kako bi se identificirali molekularni putevi i poremećaji uključeni ububrežnićelijska proliferacija i diferencijacija tokombubregrazvoj.
Ključne riječi:zatajenje bubrega; bubrežni tubularni; bubrežni poremećaji; razvoj bubrega; bubreg
Materijal i metodologija
Životinje i dijetaEksperimenti su provedeni kako je prethodno detaljno opisano [5, 6] na ženkama i mužjacima pacova Wistar HanUnib pacova iste starosti (250–300 g) porijeklom iz priplodne stoke koju je nabavio CEMIB/UNICAMP. , Campinas, SP, Brazil. Životna sredina i stanovanje predstavljali su prave uslove za vođenje svog zdravlja i dobrobiti tokom eksperimentalnog postupka. Odmah nakon odbića u dobi od tri sedmice, životinje su držane pod kontroliranom temperaturom (25˚C) i uvjetima osvjetljenja (07:00–19:00h) sa slobodnim pristupom vodi iz slavine i standardnoj laboratorijskoj hrani za glodare (Purina Nuvital , Curitiba, PR, Brazil: Na plus sadržaj: 135 ± 3 μEq/g; sadržaj K plus: 293 ± 5 μEq/g), 12 sedmica prije uzgoja. Institucionalni etički komitet za korištenje životinja na Državnom univerzitetu São Paulo (#446-CEUA/UNESP) odobrio je eksperimentalni protokol, a opće smjernice koje je ustanovio Brazilski koledž za eksperimentiranje na životinjama slijedile su se tijekom istrage. Označen je kao 1. dan trudnoće kao dan kada je vaginalni razmaz pokazao spermu. Zatim su majke održavane ad libitum tokom cijele trudnoće na izokalnoj laboratorijskoj hrani za glodare sa standardnim sadržajem proteina [NP, n=36] (17 posto proteina) ili niskim sadržajem proteina [LP, n=51 ] (6 posto proteina). NP i LP potrošnja hrane majke određivana je dnevno (naknadno normalizovana za tjelesnu težinu), a tjelesna težina majki je bilježena sedmično u obje grupe. 17 dana gestacije (17-DG), majke su anestezirane ketaminom (75 mg/kg) i ksilazinom (10 mg/kg), a materica je otkrivena. Fetusi su uklonjeni i odmah eutanazirani dekapitacijom. Fetusi su izvagani, a rep i udovi su sakupljeni za određivanje spola. Metanefros je sakupljen za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS), RT-qPCR i imunohistohemijske analize.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREZU/BUBREZU
Određivanje spolaOva studija je provedena samo na muškim 17-DG potomcima, a spol je određen Sry konvencionalnom PCR analizom sekvence (Polymerase Chain Reaction). DNK je ekstrahovan enzimskom lizom proteinazom K i fenol-hloroformom. Za reakciju je korištena Master Mix bezbojna—Promega, uz uslove ciklusa proizvođača. Integrisane DNK tehnologije (IDT) sintetizirale su prajmer sljedeće sekvence: Naprijed: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Revers: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Totalna ekstrakcija RNKRNA je ekstrahirana iz NP (n=4) i LP (n=4) cijelebubrezikorištenjem Trizol reagensa (Invitrogen), prema uputama koje je naveo proizvođač. Ukupna količina RNK određena je apsorbancijom na 260 nm pomoću nanoVue spektrofotometra (GE Healthcare, USA). Integritet RNK je osiguran dobijanjem broja integriteta RNK—RIN > 8 pomoću Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Njemačka) [30].
miRNA-Seq i analiza podatakaSekvenciranje je obavljeno na platformi MiSeq (Illumina). Protokol je slijedio uputstva proizvođača dostupna uUkratko, sekvenciranje uključuje izgradnju biblioteke, a za to je korišteno 1 ug ukupne RNK. U ovom koraku, adapteri su povezani, 3 'i 5'. Nakon ligiranja adaptera, izvedena je reakcija reverzne transkripcije kako bi se stvorila cDNK. Zatim je amplificiran standardnom PCR reakcijom, koja koristi prajmere koji sadrže indeks sekvence za identifikaciju uzorka - ovu cDNK biblioteku, podvrgnutu elektroforezi u agaroznom gelu za izolaciju miRNA. Nakon kvantifikacije, koncentracija biblioteke je normalizovana na 2 nM upotrebom 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, a sekvenciranje transkriptoma je izvedeno pomoću MiSeq Reagent Kit v2 (50 ciklusa).
Analiza podataka obavljena je u saradnji sa Tao Chenom, dr. sa Odsjeka za genetičku i molekularnu toksikologiju, Nacionalni centar za toksikološka istraživanja, Jefferson, AR, SAD. Podaci iz sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) miRNA su generirani u FASTA formatu i uvezeni u BaseSpace.com (Illumina, SAD). Kvalitet podataka je procijenjen korištenjem bazičnog softvera CASAVA koji je razvio proizvođač (Illumina). Analize su urađene pomoću BaseSpace miRNA Analysis (sa Univerziteta u Torinu, Kanada) i mapiranje sekvenci različitih miRNA pomoću Small RNA (Illumina, SAD) za genom pacova. Diferencijalno izražena miRNA studija je analizirana pomoću softvera Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, SAD).
validacija ekspresije miRNAČetiri muška potomstva iz različitih legla korištena su u svakoj grupi za miRNA (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p, i -199a-5p) analiza izraza. Ukratko, 450 ng RNK je reverzno transkribirano, bez prethodnog pojačavanja, korištenjem kompleta za reverznu transkripciju TaqMan1 Micro RNA, prema uputama proizvođača. Komplementarna DNK (cDNK) je amplificirana korištenjem TaqMan MicroRNA testova (Life Technologies, SAD) sa TaqMan1 univerzalnim PCR Master Mixom, bez AmpErase1 UNG (2x) na StepOnePlusTM Real-Time PCR sistemu (Applied BiosystemsTM), prema uputama proizvođača. Analiza podataka je izvršena korišćenjem relativne genske ekspresije procenjene korišćenjem komparativne metode kvantifikacije (Pfaffl, 2001). Na osnovu analize stabilnosti, U6 snRNA i U87 scaRNA su korištene kao referentni gen. Sve relativne kvantifikacije su procenjene korišćenjem softvera DataAssist, v 3.0, korišćenjem ΔΔCT metode. miRNA podaci su generirani u skladu s MIQE smjernicama [31].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
RT-qPCR predviđenih ciljnih genaZa sintezu cDNK korišćen je komplet za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Life Technologies, SAD). RT-qPCR reakcije za Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 i IGF1 gen je izveo SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA ) koje pruža IDT1 Integrated DNK Technologies (Tabela 1). Reakcije su obavljene u ukupnoj zapremini od 20 μL upotrebom 2 μL cDNA (razblaženog 1:30), 10 μL SYBER Green Master Mixa (Life Technologies, SAD) i 4 μL svakog specifičnog prajmera (5 nM). Amplifikacija i detekcija su izvedeni korišćenjem StepOnePlusTM PCR sistema u realnom vremenu (Applied BiosystemsTM). Vrijednosti Ct su konvertovane u relativne vrijednosti ekspresije korištenjem ΔΔCt metode sa podacima o potomstvu metanephros normaliziranim sa GAPDH kao referentnim genom [32].
imunohistohemija,Fetus (n {{0}} po grupi) je uklonjen i odmah fiksiran u 4 posto paraformaldehida (0,1 M fosfat, pH 7,4). Materijali su dehidrirani, dijafanizirani i uključeni u paraplast, a blokovi su izrezani na dijelove debljine 5- μm. Histološki rezovi su deparafinizirani i obrađeni na imunofluorescenciju i imunoperoksidazu. Sekcije su bile
inkubirano sa rastvorom za blokiranje (8 posto fetalnog goveđeg seruma, 2,5 posto goveđeg albumina i 2 posto obranog mlijeka u prahu u PBS). Nakon toga, postavite primarno antitijelo (anti-Six-2) razrijeđeno u PBS-u koji sadrži 1 posto obranog mlijeka preko noći u hladnjaku. Nakon ispiranja sa PBS, sekcije su inkubirane sa specifičnim sekundarnim antitelom, konjugovanim sa Alexa 488 fluoroforom, razblaženim u istom puferu koji je sadržao 1 procenat mleka tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon uzastopnih ispiranja sa PBS, stakalca su postavljena pokrovnim stakalcima koristeći Vectashield fluorescentni montažni medij (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Fluorescencija u uzorku je otkrivena laserskom konfokalnom mikroskopom. Slike su dobijene pomoću sistema Focus Imagecorder Plus. Za c-Myc, Ki{11}}, Bcl-2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, cijepanje kaspaze 3, ciklin A i WT1 proteine, urađena je imunohistohemija. Stakalca su hidratizirana, a nakon ispiranja u PBS pH 7,2 tokom 5 minuta, antigenski oporavak je napravljen citratnim puferom pH 6.0 tokom 25 minuta u ekspres loncu. Stakalca su isprana u PBS. Nakon toga je izvršena blokada endogene peroksidaze vodonik peroksidom i metanolom 10 minuta u mraku. Sekcije su ponovo isprane u PBS-u. Zatim je praćeno blokiranje nespecifičnog vezivanja, a pločica su inkubirana sa rastvorom za blokiranje (5 procenata obranog mleka u prahu, u PBS) tokom 1 sata. Sekcije su inkubirane sa primarnim antitelom (Tabela 2), razblaženim u 1% BSA preko noći u frižideru. Nakon ispiranja sa PBS, sekcije su bile izložene specifičnom sekundarnom antitelu 2 sata na sobnoj temperaturi. Stakalca su isprana sa PBS. Rezovi su otkriveni sa DAB (3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorid, Sigma—Aldrich CO1, SAD). Nakon uzastopnog ispiranja u tekućoj vodi, stakalca su obojena hematoksilinom, dehidrirana i postavljena pokrovnim stakalcem, koristeći Entellan1. Slike su dobijene pomoću fotomikroskopa (Olympus BX51) ili Zeiss LSM 780-NLO konfokalnog na mikroskopu Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Njemačka) sa Nacionalnog instituta za nauku i tehnologiju za fotoniku primijenjenu na ćeliju Biologija (INFABIC) na Državnom univerzitetu Campinas.
Morfološka kvantifikacijaParafin 5 μmbubregsekcije su analizirane pomoću softvera CellSens Dimension sa fotomikroskopa (Olympus BX51). Thebubregpristupljeno je rezovima radi određivanja nefrogenog područja, CM i UB proteina i broja ćelija, hematoksilin-eozin obojen u 17-DG LP fetus(n=5) u poređenju sa NP potomcima koji odgovaraju starosti (n {{4 }}) od različitih majki. Kvantifikovali smo sve CM i UB svakog analiziranog metanefrosa (4NP i 4LP od različitih majki), a statistička analiza je izvršena t-testom, a vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SD. P�0.05 se smatra značajnim. Za statističku analizu i konstrukciju figure korišten je GraphPad Prism v01 Software, Inc., SAD.
Statistička analizaKorišten je t-test, a vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). P�0.05 se smatra značajnim. Za statističku analizu i konstrukciju figure korišten je softver GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., SAD).
Rezultati
Ekspresija miRNA pomoću miRNA-SeqRazumjeti promjene mikroRNA povezane s majčinim niskim sadržajem proteinabubrežniprogramiranja, izvršili smo ekspresiju globalne analize miRNA profiliranja. Identificirano je 44 deregulirane miRNA (p � 0.05), od kojih je 19 odnosno 25 miRNA regulirano gore ili dolje (Tabela 3). Najveće eksprimirane miRNA i njihove funkcije, putevi i mreže identificirani su pomoću softvera Ingenuity (Tabela 4).
Validacija ekspresije miRNAKod životinja LP grupe, Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p su povećane, dok su miR-127-3p, miR-144-3p i miR-199a-5p bili smanjeni u odnosu na NP životinje. Rezultati ne pokazuju nikakvu razliku u ekspresiji miR-298, upoređujući obje grupe (slika 1). Tabela 5 otkriva vrijednosti dobijene sekvenciranjem miRNA s podacima validacije RT-qPCR. Iako je uočena značajna razlika u ekspresiji miRNA u LP u odnosu na potomstvo NP, promjena nabora (FC) validiranih miRNA bila je slična objema tehnikama.
miRNA-gen mete
Ekspresijski geni predviđenih ciljeva različitih miRNA kao što su Six-2, Bcl-2, PRDM1, ciklin A, PCNA, GDNF, kolagen 1, kaspaza 3 i Bim u LP nisu se značajno razlikovali od NP fetus. Međutim, ekspresija gena Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 i IGF1 bila je pojačana u {{15 }}DG LP grupa u poređenju sa kontrolnom skupinom koja odgovara uzrastu. Suprotno tome, c-Myc i NOTHC1 su bili smanjeni kod potomaka ograničenih na proteine majke (slika 2).
Tjelesna masa fetusa i morfometrija metanefrosa17-DG LP tjelesna masa nije se razlikovala od NP potomaka iste dobi. Međutim, LP-ov metanefros mezenhim pokazao je 7,6 posto smanjenu površinu i 29 posto smanjenje debljine korteksa u odnosu na NP grupu (slika 3).ImunohistohemijaU ovoj studiji, LP fetus je pokazao značajno smanjenje (oko 69 posto) fluorescencije Six-2 kapa u odnosu na potomke NP (slika 4).
Analiza imunoperoksidaze Six-2 pokazala je smanjen broj ćelija (14 procenata) u LP CM u odnosu na 28 procenata smanjenih ćelija Six-2 plus u odnosu na područje kape u poređenju sa potomcima NP (slika 4). Ova studija je takođe pokazala značajno smanjenje procenta c-Myc CM i UB imuno obojenih ćelija (manje 14 procenata) u LP u odnosu na NP potomke (slika 4). Dodatno, postotak Ki-67 označenog područja u CM je bio 48 posto manji u LP u odnosu na NP fetus, dok se imunoreaktivnost Bcl-2 i cijepane kaspaze-3 nije razlikovala od obje grupe (sl. 5 i 6). Ova studija je takođe pokazala značajno smanjenje procenta c-Myc CM i UB imuno obojenih ćelija (manje 14 procenata) u LP u odnosu na NP potomke (slika 4). Dodatno, postotak Ki-67 označenog područja u CM je bio 48 posto manji u LP u odnosu na NP fetus, dok se imunoreaktivnost Bcl-2 i cijepane kaspaze-3 nije razlikovala od obje grupe (sl. 5 i 6). S druge strane, u LP, područja označena CM i UB-kateninom su bila 154 odnosno 85 posto povišena, u poređenju sa onima dostupnim kod NP potomaka (slika 7). Istovremeno, distribucija imunoreaktivnosti mTOR-a takođe zauzima značajno veće područje u LP CM (139 posto) i UB (104 posto) nego u NP fetusu (slika 7). Kod LP potomaka, TGF -1 u bojenju UBS ćelija se povećao (oko 30 posto), dok u CM, imuno obojene ćelije nisu bile različite u odnosu na NP grupu (slika 8). ZEB1 metanefros obojen, lociran u ćelijama jezgara CM, povećao se za 30 posto u LP u poređenju sa NP fetusom (slika 8). Istovremeno, imunofluorescencija ZEB2, iako prisutna u cijelim metanefros strukturama, bila je slična u obje eksperimentalne grupe (slika 8). Trenutna studija, uzimajući u obzir ekspresiju miRNA i mRNA i proteine
Diskusija
Povećano je znanje o ćelijskim i molekularnim mehanizmima nefrogeneze [33–37]. Međutim, mnogi regulatorni faktori i signalni putevi uključeni su ububrežniontogeneza ostaje nejasna [38]. miRNA igraju ključnu ulogu u regulaciji ekspresije gena tokombubrežnirazvoj [25, 39–41]. Prema našim saznanjima, analize ekspresije miRNA i mRNA u ćelijama LP kod majke 17-DG muškog mezenhima nisu rađene. Predlažemo novi molekularni mehanizam uključen u inhibiciju rane nefrogeneze, što rezultira smanjenim brojem nefrona. Koristili smo NGS za procjenu ekspresije miRNA i otkrili da je 19 miRNA regulirano nagore i 25 na niže u 17-DG LP u poređenju sa NP metanephros. Među 10 najboljih dereguliranih miRNA, odabrali smo 7 miRNA s biološkim ciljevima uključenim u proliferaciju, diferencijaciju i ćelijsku apoptozu. I miRNA-Seq i TaqMan analiza podataka otkrile su konzistentne i specifične promjene u ekspresiji miRNA kod LP životinja u odnosu na kontrolne NP životinje iste starosti.
Porodica miR-181 sastoji se od četiri visoko očuvana člana, odnosno miR-181a, miR-181b, miR-181c i miR-181d [ 42]. U neoplastičnim ćelijama, miR-181a djeluje kao supresor tumora, inhibirajući ćelijsku proliferaciju i migraciju i indukujući ćelijsku apoptozu [43]. Ova studija je otkrila povećanu ekspresiju miR-181a-5p u 17-DG LP u odnosu na NP potomke iste starosti. Iako ekspresija mRNA kaspaze nije promijenjena, dvostruko povećanje omjera Bax/Bcl-2 mRNA u LP u poređenju sa potomcima NP sugerira povećanu apoptozu u CM, što ukazuje da je apoptoza regulirana post-transkripcijskim putem. Studije su pokazale da BCL porodica potiče oslobađanje citokroma iz mitohondrija, a zatim inhibira aktivaciju Casp3, čime inhibira ćelijsku apoptozu [44]. Li et al. koristio model akutne ozljede pluća kako bi otkrio da je prekomjerno izražena miR-181a povezana sa smanjenim nivoom Bcl-2 proteina; obrnuto, miR-181a inhibicija je povećala nivoe Bcl-2 [45]. Ova studija je potvrdila rezultate Lv et al., koji su pokazali da miR-181c negativno reguliše ekspresiju Six-2 i proliferaciju ćelija, paralelno sa gubitkom fenotipa mezenhimskih ćelija tokombubregrazvoj u LP 17-DG potomcima [25].
Xiang et al. pokazao da povećana ekspresija miR-144 potiskujebubrežniproliferaciju karcinoma, što rezultira kraćom G2/M fazom. Štaviše, Xiang et al. otkrili su da prekomjerna ekspresija miR-144 inhibira ekspresiju mTOR gena i proteina [46]. Nijland et al. pokazali su da je povećanje mTOR signalizacije ključno za određivanje broja nefrona u embrionima čije su majke bile podvrgnute restrikciji nutrijenata [47]. Cilj rapamicinskog kompleksa 1 (mTORC1) kod sisara je od suštinskog značaja za razvoj embriona; međutim, kako ovaj kompleks reguliše ravnotežu između rasta i autofagije u fiziološkim uslovima i stresu okoline ostaje nepoznato [48]. Stoga, mTOR signalizacija može biti uključena u ćelijske odgovore kod životinja izloženih unosu LP tokom gestacije; u percepciji, indukciji i prestanku autofagije; i kao odgovor na intracelularnu dostupnost nutrijenata [46]. Hipotetički, tokom ozbiljne restrikcije proteina, smanjena ekspresija miR-144-3p može biti povezana s povećanom ekspresijom mTOR, otprilike 139 posto i 104 posto u CM ćelijama i UB, respektivno, kako bi se kompenzirao gubitak nefrona u {{ 11}}DG LP potomci Chen et al. definisao miR-127 kao novi regulator starenja ćelija preko Bcl-6 [49]. Pan et al. izvijestili su da nedovoljna ekspresija miR-127 korelira sa povećanom proliferacijom ćelija u ćelijama jetre [50]. Ova studija je pokazala smanjenje proliferacije ćelija i značajno smanjenje ćelija pozitivno obilježenih za Ki{17}} u CM životinja sa ograničenim unosom proteina. Štaviše, uočeno je smanjenje nefrogene površine i proliferacija u potomstvu LP, što je u skladu sa rezultatima Menendez-Castro et al. kod 8,4 posto proteina ograničenog potomstva [51, 52]. Dakle, povećana ekspresija Ki-67 i Bcl-6 mRNA, praćena smanjenom ekspresijom miR-127-3p u 17-DG LP kapici, može biti povezana sa kontraregulatornim mehanizmima za održavanje proliferacija.
Sun et al. pokazali su da prekomjerna ekspresija miR-199a-5p smanjuje proliferaciju cističnih ćelija i inducira apoptozu, pored kontrole ćelijskog ciklusa [53]. U ovoj studiji, ekspresija miR-199a-5p je smanjena u 17-DG LP praćena je povećanom transkripcijom Ki-67, markera ćelijske proliferacije, i Map2k2 je povezan sa smanjenom Ki-67 reaktivnošću u LP 17-DG metanephros. Dakle, gestacijska pothranjenost promoviše diferencijaciju kroz post-transkripcijski mehanizam. Primjetno, naši rezultati otkrivaju represivnu ulogu homeobox-a 1 (ZEB1) koji vezuje E kutiju cinkovog prsta, EMT induktora, koji održava pluripotentnost matičnih stanica tokom diferencijacije embrionalnih matičnih stanica. -katenin je poznato da aktivira nuklearnu transkripciju ZEB1 što rezultira ekspresijom ZEB1 [34]. TGF signalni put, jedan od najbolje proučavanih puteva, može izazvati EMT tokom embrionalnog razvoja. Za embrionalni razvoj potrebno je nekoliko liganada sličnih TGF-u. Međutim, ne zavise svi TGF posredovani efekti na EMT od ZEB1/2, nokaut ćelije mogu inducirati ekspresiju mezenhimskih gena fibronektina i N-kadherina. Međutim, E-kadherin se više ne smanjuje, a formiraju se i aktinska vlakna [54]. Karner et al. prijavio da je tokombubrežnirazvoj, Wnt9b/ -catenin
signalna staza, izražena i u UB i u CM, neophodna je i za obnavljanje i diferencijaciju nefrona progenitorskih ćelija, što je od suštinskog značaja za formiranje nefrona tokom embriogeneze [55]. Evolucijski očuvan put Wnt9b/-katenina igra ključnu ulogu u razvoju organa, tkiva i popravljanju ozljeda u višećelijskim organizmima. Studija je pokazala da je c-Myc meta transkripcije -katenina, koji reguliše proliferaciju i diferencijacijububrežnitubularni epitel [56]. Ekspresija -katenina na nivou gena i proteina povećana je tokom proučavanih periodabubrežnirazvoj u 17-DG LP fetusu. Pan et al. izvijestili su da Myc sarađuje sa -cateninom kako bi promovirao obnavljanje nefronskih progenitor ćelija [10]. Ovdje u poređenju sa NP potomcima koji odgovaraju starosti, LP je pokazao nižu ekspresiju c-Myc. Stoga, ove životinje mogu imati nižu rezervu obnovljivih ćelija neophodnih za proliferaciju i preživljavanje i mogu odražavati manji broj nefrona u LP modelu. Štaviše,
Wnt/-catenin i Notch signalni putevi mogu koordinirati regulaciju ekspresije Six-2 i uključeni su u regulaciju ekspresije Six-2 u nefronskim progenitorskim ćelijama. Studije su pokazale da bi niski nivoi -katenina mogli biti potrebni za održavanje ekspresije Six-2 i CM progenitornih ćelija u nediferenciranom stanju; štaviše, povišeni nivoi katenina određuju sudbinu nefronskih progenitornih ćelija [57, 58]. Stoga pretpostavljamo da je smanjena cMyc i Notch signalizacija, praćena povećanom ekspresijom -catenina, smanjila ekspresiju Six-2 za 28 posto kod 17-DG LP potomaka i bila je u korelaciji s ranom diferencijacijom CM stanica i smanjenim matičnim stanicama i broj nefrona u odrasloj dobi. Štaviše, naši podaci mogu potvrditi da, u ćelijama MM potomaka LP, povećana ekspresija Let-7a-5p i -catenin i smanjeni Notch signal mogu modulirati c-Myc, Six-2, i Ki{17}} ekspresije, što dovodi do smanjenja samoobnavljanja progenitorskih ćelija. Iscrpljenost preostalih CM progenitorskih stanica dovodi do smanjenja broja nefrona i razvoja arterijske hipertenzije ibubrežniporemećaji u odrasloj dobi (slika 10). U skladu sa rezultatima Boivina et al., naši rezultati pokazuju da povećani CM-katenin remeti rast UB i nefrogenezu [59]. Studije su pokazale da neurotrofni faktor (GDNF) koji potiče od faktora rasta, ključni regulator rasta UB, signalizira preko c-Ret receptora tirozin kinaze i Gfra1 ko-receptora [60, 61]. U 17-DG LP potomstvu, značajno
povećanje mRNA koja kodira c-Ret receptor bi teoretski dovelo do porasta rasta UB. Međutim, u ovoj studiji, ekspresija GDNF je bila nepromijenjena, što sugerira da je uprkos povećanju cRet mRNA, grananje UB smanjeno. Ranije smo primijetili smanjenje od 28,3 posto u granama mokraćovoda nakon 14,5 dana gestacijske restrikcije proteina [4], što bi moglo biti povezano sa smanjenjem od 28 posto u Six-2 označavanju MM stanica, uprkos tome što nema promjene u GDNF-u. transkripcija. -katenin verovatno stupa u interakciju sa c-ret receptorom i transportuje se do jezgra UB ćelije, promovišući ekspresiju TGF -1 u epitelnim ćelijama, inhibirajući grananje UB i izazivajući preranu diferencijaciju CM progenitornih ćelija, kao što se vidi u {{11} }DG LP potomci [62–64]. Stoga, GDNF možda nije od suštinskog značaja za posredovanje mezenhimskih signala do ureternog pupoljka; međutim, mehanizam ostaje da se razjasni. Zaista, pokazali smo da je MM iz 17-DG LP potomaka pokazao specifično povećanje u Let-7 miRNA ekspresiji, što je rezultiralo značajnim oštećenjembubregrazvoj, čime se potvrđuje modulaciona uloga ovih gena u vremenskom razvoju nefrogeneze [65].
U početnim studijama faktora rasta sličnog insulinu (IGF), dominantne uloge IGF-1 i -2 u rastu fetusa razjašnjene su brojnim, ali uglavnom indirektnim dokazima. Utvrđeno je da IGF djeluju kao faktori proliferacije i diferencijacije u kultiviranim fetalnim stanicama i preimplantacijskim embrionima. Štaviše, otkriveno je da IGF luče kultivisane fetalne ćelije i eksplanti in vitro [66]. Faktori rasta, uključujući IGF, mogu uzrokovati djelomičnu ili potpunu epitelno-mezenhimsku tranziciju. Aktivacija IGF puteva dovodi do regulacije EMT-a indukcijom ekspresije ZEB1 [67]. Iako je uključeno nekoliko faktora rasta kandidatabubregrazvoj, da li su uključeni u nefrogenezu nije poznato. Različiti faktori rasta mogu biti potrebni u različito vrijeme. Neki faktori rasta mogu biti suvišni u ovom kontekstu. Tokom embrionalnog razvoja, potrebni su uzastopni krugovi EMT i MET da bi se razlikovali specijalizovani tipovi ćelija i stvorila trodimenzionalna struktura. U ovoj studiji je utvrđeno da mezenhimsko-epitelna interkonvertibilnost održava plastičnost ćelije, što ukazuje na prisustvo visoko inducibilnog sistema u uslovima LP za embrion. Ekspresija porodice Let-7 miRNA je opsežno proučavana u različitim fetalnim tkivima. Povećanje ekspresije Let-7 miRNA povezano je sa smanjenom proliferacijom i ranim povećanjem diferencijacije MM ćelija, a samim tim i smanjenim brojem nefrona [27, 15, 68–71]. Veća ekspresija Let-7 je demonstrirana kod viših organizama tokom posljednje faze cerebralne embriogeneze kod glodara [72, 73]. Nagalakshmi et al. otkrili su da je ekspresija miRNA Let-7 promijenila sudbinu epitelnih ćelija UB iz prekursora u diferencirano stanje [71]. Nasuprot tome, Yermalovich et al. pokazalo je da je prekomjerna ekspresija Lin28b, proteina koji se vezuje za RNK, povezana sa supresivnim Let-7 miRNA. Iako su lin28 i Let{17}} poznati regulatori ontogenog vremena kod beskičmenjaka, njihova uloga u razvoju organa sisara nije shvaćena [65]. U ovoj studiji, povećanje ekspresije Let{19}}a-5p miRNA u LP fetusu moglo bi biti povezano sa smanjenom proliferacijom CM ćelija, kompromitujući nefrogenezu u odnosu na NP grupu. Stoga pretpostavljamo da se supresija proliferacije CM ćelija i rani prekid nefrogeneze uzrokovane povećanom Let-7 miRNA mogu dogoditi direktno ili indirektno kroz prolazno smanjenu ekspresiju Lin28b u 17-DG LP. Ovaj efekat može značajno umanjitibubregrazvoj u 17-DG LP, što potvrđuje da ovaj gen reguliše vrijeme razvoja tokom nefrogeneze. U ovoj studiji, povećana Let{1}}a-5p ekspresija miRNA poklapa se sa smanjenjem ekspresije c-Myc. Myc je uključen u proliferaciju, rast, apoptozu i diferencijaciju ćelija tokombubrežniorganogeneza [74–76]. Kod potomaka LP 17-DG, ekspresija gena MM c-Myc je smanjena, a područje CM c-Myc imunoreaktivnosti bilo je 14 posto manje u poređenju sa onim kod NP potomaka. Istovremeno, uočeno je smanjenje broja CM ćelija za 14 procenata i smanjenje imunoreaktivnosti Ki{8}} za 48 procenata u LP u odnosu na NP potomke. Dosljedno, studije su pokazale da c-Myc igra važnu ulogu u završnoj fazi grananja UB i u stimulaciji proliferacije CM progenitornih ćelija [74].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI INFEKCIJU BUBREGA/BUBREGA
smanjen nivo u matičnim ćelijama, održavajući ih u nediferenciranom stanju. Međutim, u ovoj studiji, jaka ekspresija Let-7a-5p miRNA u CM-u smanjila je ekspresiju c-Myc, čime je smanjila proliferaciju progenitornih ćelija i ranu diferencijaciju ćelija u LP 17-DG potomstvo (slika 10). Studije obubrezic-Myc transgenih miševa otkrili su istovremeno smanjenje c-Myc i S-ix-2 imunopozitivnih CM ćelija povezano sa smanjenom proliferacijom matičnih ćelija [74]. Ova studija pokazuje značajno (28 posto) smanjenje broja šest-2 pozitivnih ćelija, specifičnihbubrežnimarker matičnih ćelija, poput smanjenja uočenog broja nefrona, u CM potomaka 17-DG LP u poređenju sa onim kod NP potomaka. Godine 2009. Fogelgren et al. pokazalo da je ekspresija gena Six-2 smanjena tokom fetalne ontogeneze kada je povezana sa smanjenim brojem nefrona, hipertenzijom i hroničnimzatajenje bubrega[77]. Dakle, smanjena ekspresija gena Six-2 u CM progenitorskim ćelijama ukazuje na supresiju diferencijacije izazvane signalom tokombubrežnirazvoj u 17-DG LP potomstvu. Ipak, redundantnost treba koristiti s oprezom – suptilni defekti u nefrogenezi mogu postati evidentni detaljnijom analizom ili pod različitim uvjetima. Nivoi IGF1 mRNA bili su najviši tokom inicijalnog perioda metanefričkog razvoja, sa transkriptima koji su detektovani tokom MM, dok su njihovi nivoi opadali tokom daljeg razvoja. Međutim, tokombubregembriogeneza, delikatan balans između faktora rasta koji olakšavaju nefron (IGF1) i inhibitornih faktora rasta (TGF -1) reguliše grananje UB.
Zaključak
Iako je nekoliko autora proučavalo nefrogenezu [34, 37, 78], malo se zna o mehanizmima koji određuju broj nefrona. Ova studija pokazuje da su mnoge miRNK, mRNA i proteini MM progenitornih ćelija izmijenjeni u 17-DG LP potomcima, što dovodi do smanjene proliferacije i rane ćelijske diferencijacije (Slika 11). Ova delikatna ravnoteža između obnavljanja progenitora nefrona i diferencijacije je neophodna zabubregrazvoj jer je neuspjeh da se postigne adekvatan broj nefrona faktor rizika za kroničnububrežniporemećaj.
