Snimanje bubrega: od svjetla do mikroskopije super rezolucije
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelotti1,2, Giulia Antonelli1,2 Carolina Conte1,2i Paola Romagnani1,2
SAŽETAK
Važna dostignuća ububregfiziološki i patofiziološki mehanizmi se u velikoj mjeri mogu pripisati napretku u tehnologiji mikroskopije. Mnogo toga što znamo o arhitekturibubregtemelji se na osnovnim opisima anatomskih mikroskopista koji koriste svjetlosnu mikroskopiju i kasnije ultrastrukturnu analizu koju daje elektronska mikroskopija. Ove dvije tehnike korištene su za prve sisteme klasifikacije bolesti bubrega i za njihovo stalno ažuriranje. U novije vrijeme, serija novih tehnika snimanja dodala je analizu u daljnjim dimenzijama vremena i prostora. Konfokalna mikroskopija nam je omogućila da sekvencijalno vizualizujemo optičke preseke duž z-ose, a dostupnost specifičnog softvera za analizu omogućila je trodimenzionalni prikaz debljih uzoraka tkiva. Multifotonska mikroskopija nam je omogućila da istovremeno istražujemobubregfunkcija i struktura u realnom vremenu. Fluorescentna mikroskopija snimanja omogućila nam je proučavanje prostorne distribucije metabolita. Mikroskopija super-rezolucije povećala je osjetljivost i rezoluciju do nivoa nano-skale. Uz krioelektronsku mikroskopiju, istraživači su mogli vizualizirati pojedinačne biomolekule na atomskim razinama direktno u tkivima i razumjeti njihovu interakciju na subćelijskom nivou. Konačno, masena spektrometrija uz pomoć laserske desorpcije/jonizacije pomoću matriksa omogućila je mjerenje stotina različitih molekula u isto vrijeme na dijelovima tkiva u visokoj rezoluciji. Ova recenzija daje pregled dostupnihbubregstrategije snimanja, sa fokusom na mogući uticaj najnovijih tehnoloških poboljšanja.
Ključne riječi:imunohistohemija,bubregbiopsija, podociti,proksimalnitubul, matične ćelije
Cistanche herba za bolest bubrega, kliknite ovdje za uzorak
UVOD
Thebubregapotrebna je fascinantna strukturalna složenost da bi se ispunile njene različite fiziološke funkcije. U početku, proučavajućibubregbila ograničena na makroskopska opažanja, a njihov doprinos dijagnozi bolesti bubrega bio je nedvojbeno ograničen. Opisane su kliničke manifestacije, ali osnovni patogenetski mehanizmi nisu poznati. Postignuća u razumijevanju fiziologije bubrega i patofiziologije mogu se u velikoj mjeri pripisati kontinuiranom napretku u polju mikroskopije. Pokušaji nabubregsnimanje je počelo davno [1]. Godine 1666. anatom Malpigi je pregledaobubregtkiva sa svjetlosnim mikroskopom koji je imao snagu procijenjenu na 25-30 i po prvi put je opisao glomerul kao 'žlijezdu u kojoj je urin odvojen od krvi'[2]. Ovaj doprinos je ignorisan sve do 1842. godine kada je Sir William Bowman razotkrio strukture nefrona pomoću 10 puta snažnijeg svjetlosnog mikroskopa. Bowman je otkrio periglomerularnu kapsulu (kasnije nazvanu Bowmanova kapsula) kao anatomski povezanu s prvim dijelom tubula [3]. Godine 1862, Jacob Henle je opisao segment tubula nalik petlji koji je dobio njegovo ime, povezujući kortikalni tubul i bubrežnu papilu.
Zahvaljujući uvođenju svjetlosne mikroskopije, histomorfološka klasifikacijabubregbolestipostalo moguće [1]. Prilika da se posmatra šta se dešava u bolesnim bubrezima omogućila je da se shvati da su patološke promene značajno varirale između pacijenata sa sličnim kliničkim manifestacijama. Međutim, prve studije o patološkim promjenama u bubrežnom tkivu rađene su na obdukcijskim uzorcima, koje su dovele uglavnom do opisa kroničnih bolesti. Nedostatak informacija o evoluciji bubrežnih patologija i tehničkom problemu autolitičkih fenomena, u korelaciji sa upotrebom postmortalnih tkiva, ograničio je znanje o ljudskim bolestima. Godine 1951. uvođenjebubregbiopsija je omogućila direktno posmatranje i proučavanje ne samo hroničnih već i akutnih bolesti bubrega. U međuvremenu, mikroskopija je postepeno postajala sve sofisticiranija s progresivno povećanom osjetljivošću i rezolucijom sve do nivoa nanoskala. U ovom pregledu ćemo dati pregled fundamentalnih otkrića bubrega koja su omogućena napretkom u mikroskopskoj tehnologiji, s fokusom na mogućnosti koje se razvijaju iz najnovijeg tehničkog razvoja.
VIZUALIZACIJA IMUNOPATOLOGIJE BUBREGA
Imunoobilježavanje i fluorescentna mikroskopija
Mogućnost da se dobije reprezentativni fragment živog tkiva omogućila je primjenu novih tehnika koje zahtijevaju maksimalno očuvanje tkiva, kao što su imunohistohemijske metode (prvo fluorescentne, a zatim enzimske). U stvari, 1950. godine, Coons je razvio metodu obeležavanja antitela fluorescein izocijanatom, odnosno imunofluorescenciju, bez uništavanja sposobnosti da specifično reaguju sa njihovim tkivnim antigenima. Od tada je imunofluorescencija uključena u dijagnostičku proceduru za procjenu zamrznutih uzoraka za biopsiju bubrega. Po prvi put, ove tehnike su omogućile promatranje intrarenalnih imunoglobulina (Igs) i depozita komplementa kod pacijenata zahvaćenih glomerulonefritisom, doprinoseći diskriminaciji različitih patofiziologija koje su u osnovi određenih nespecifičnih lezija tkiva, na primjer, kod glomerulonefritisa polumjeseca [4]. Osim toga, mogućnost da se uoči karakteristični obrazac bojenja i spajanje fluoresceina na antitijela koja nisu imunoglobulin G (IgG) dovela je do prepoznavanja depozita imunoglobulina A (IgA) u IgA nefropatiji, kao i depozita komplementa u postinfektivnom glomerulonefritisu. i membranoproliferativni glomerulonefritis [4].
Konfokalna mikroskopija
Fluorescentna mikroskopija je doživjela značajno tehničko poboljšanje uvođenjem konfokalne mikroskopije kasnih 1980-ih. Ključni elementi u konfokalnoj mikroskopiji su osvetljenje tačke fokusirano i skenirano preko uzorka i promenljivi konfokalni otvor (rupa) ispred detektora koji omogućava prikupljanje svetlosti samo iz tankog preseka oko fokalne ravni (koji se naziva optički presek). Konfokalna mikroskopija omogućila je prve in vivo studije bubrega na eksperimentalnim modelima i posmatranje preuzimanja i transporta fluorescentnih molekula kroz tubule u netaknutombubrezinakon mikropunkcije. To je omogućilo proučavanje tubularne funkcije u fiziološkim i patološkim stanjima [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, zbog granice difrakcije vidljive svjetlosti, fotoizbjeljivanja i fototoksičnosti.
RAZUMIJEVANJE BARIJERE GLOMERULARNE FILTRACIJE: ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA
Prvi pokušaj prevazilaženja granice rezolucije svjetlosnih i fluorescentnih mikroskopa bio je 1931. godine kada su Ernst Ruska i Max Knoll izumili elektronski mikroskop (EM), koji koristi snop ubrzanih elektrona, umjesto snopa svjetlosti, kao izvor pobude, i ima veću moć razlučivanja od svjetlosnih mikroskopa (do 0.2 nm). Za ovu inovaciju Ernst Ruska je 1986. godine dobio Nobelovu nagradu za fiziku. Zahvaljujući povećanoj moći rezolucije, ubrzo je postalo očigledno da glomerul nije samo mehanički filter, već izuzetno složen organ sastavljen od tri sloja: endotelnih ćelija, glomerularne bazalne membrane (GBM) i podocita [9]. Transmisija EM (TEM) je omogućila vizualizaciju glomerularnih ćelija iznutra [10] i otkrila da endotelne ćelije imaju tanka fenestrirana ćelijska tijela, dok podociti imaju velika ćelijska tijela, te da se protežu primarni i sekundarni 'nožni' procesi usidreni za GBM i međusobno povezani putem linearni spojevi (blaga dijafragma) (slika 1B). Nadalje, skeniranje EM (SEM), hvatanje povratno raspršenih elektrona, omogućilo je vizualizaciju glomerularnih stanica s njihove vanjske površine [10] i otkrilo da su se nožni procesi susjednih podocita preplitali i prekrivali GBM (slika 1C). EM je ostao moćan instrument ne samo za razumijevanje normalne glomerularne ultrastrukture već i za razumijevanjebubregfiziologija i patofiziologija [11]. Brojne studije sprovedene na ljudskim uzorcima ili na eksperimentalnim modelima otkrile su da su različiti procesi bolesti povezani sa skupom karakterističnih obrazaca ultrastrukturnih promena, što implicira dalja ažuriranja evoluirajućeg sistema klasifikacijebubregbolesti. Tehnička sposobnost vizualizacije dalje složenosti ultrastrukture bubrega podržala je specijalizaciju 'nefro'patologa.
Nedavna SEM tehnika, zasnovana na visoko osjetljivom detektoru, omogućila je proučavanje najdubljeg dijela prorezane dijafragme i otkrila da ga karakteriziraju pore različitih veličina [12]. Kod štakora je početak proteinurije bio povezan s velikim porama, što je povećalo mogućnost da ultrastrukturne promjene prorezane dijafragme mogu biti uzroci promjena u glomerularnoj permselektivnosti [12]. Kao daljnji tehnički napredak, blok-face SEM omogućio je prijelaz sa 2D na 3D prikaz barijere glomerularne filtracije sa rezolucijom dovoljnom da prati nanostrukturu najtanjih ćelijskih procesa kod zdravih miševa, bolesnih miševa i tokombubregrazvoj [13, 14].
Konačno, spajanje EM sa sistemom za mikroanalizu rendgenskih zraka (rendgenska mikroskopija) omogućilo je elementarnu analizu ćelija ili dijelova ćelija na ultrastrukturnom nivou. Rentgenska mikroskopija koristi skenirajući TEM sa uskim snopom elektrona da pobuđuje uzorak. Udar visokoenergetskih elektrona iz zraka na atome u uzorcima proizvodi energiju u obliku rendgenskih fotona. Ovaj rendgenski signal, prikupljen detektorom poluprovodnika sa disperzijom energije, koristi se za identifikaciju elemenata prisutnih u uzorku, sa rezolucijom od, u najboljem slučaju, 30 nm. Ububregpolju, mikroanalizu rendgenskih zraka uspješno su koristili Beck i Thurau za proučavanje transporta jona u transepitelnim tubulima [15] i intracelularne koncentracije elemenata u tubularnim stanicama [16].
VIZUALIZACIJA FIZIOLOGIJE BUBREGA MULTIFOTONOM MIKROSKOPOM
Višefotonska mikroskopija (MPM) omogućila je dalji napredak ububregistraživanje, odnosno mogućnost istovremenog istraživanja bubrežne funkcije i odnosa strukture u realnom vremenu [17]. Za razliku od konvencionalnih svjetlosnih mikroskopa, dvofotonska ekscitacija ovisi o istovremenoj apsorpciji dva fotona sa dvostruko većom talasnom dužinom pobuđivanja koja je neophodna za pobuđivanje fluorofora u klasičnoj jednofotonskoj ekscitaciji (slika 1D). Upotreba komercijalno dostupnih impulsnih infracrvenih, niskoenergetskih ekscitacionih lasera povećala je duboko prodiranje tkiva i minimizirala fototoksičnost (slika 1D). Ovo je omogućilo istraživačima da vizualizuju dinamičke ćelijske procese direktno u živim životinjama, što se ranije nije moglo postići bilo kojom drugom tehnikom. MPM dozvoljava kvantifikaciju osnovnih bubrežnih funkcija i patoloških promjena kao što su glomerularna permeabilnost, vaskularni protok krvi, brzina glomerularne filtracije jednog nefrona i tubularni protok [17] (Slike 1E i F). Osim toga, MPM dozvoljava proučavanje intracelularnih procesa kao odgovor na ozljedu, uključujući smrt i odvajanje ćelija, kotrljanje leukocita i regrutaciju i poremećaje GBM-a [17]. Dalja tehnička poboljšanja omogućila su produženo intravitalno snimanje tokom dana do sedmica [18] koje je, u kombinaciji s transgenim miševima koji eksprimiraju fluorescentne proteine, korišteno za praćenje sudbine pojedinačnih stanica direktno in vivo u zdravim i ozlijeđenim bubrezima [19] i za bolje razumjeti mehanizme obnavljanja i regeneracije bubrežnih stanica.
Tehnike snimanja bez oznaka bile su moguće i sa MPM, koristeći prirodnu autofluorescenciju nikotinamid adenin dinukleotid hidrata (NADH) za proučavanje redoks stanja tubularnih ćelija nakon ozljede [20]. Osim toga, generiranje drugog harmonika iz fibrilarnog kolagena korišteno je za kvantifikaciju taloženja kolagena, markera renalne fibroze [21]. Generacija drugog harmonika je nelinearni optički proces u kojem dva pobuđujuća fotona iste valne dužine stupaju u interakciju sa necentrosimetričnim strukturama u biološkim tkivima, kao što su kolagen ili mikrotubule, i stvaraju novi foton sa polovinom valne dužine.
Nedavna inovacija intravitalne mikroskopije bila je uvođenje minijaturiziranog multifotonskog endoskopa koji se uspješno koristi za snimanje bubrega kod živih anesteziranih miševa [22]. Ovaj minimalno invazivni MPM može utrti put za in vivo dijagnozu u stvarnom vremenu, bez uklanjanja tkiva iu vrlo kratkom vremenu.
BUBREG U 3D: TEHNIKE ČIŠĆENJA TKIVA I MIKROSKOPIJA EKSPANZIJE
Uprkos tehnološkim poboljšanjima, jedno od glavnih ograničenja za dublje volumetrijske slike je neprozirnost bubrežnog tkiva, što činibubregjedan od optički najizazovnijih organa. To je razlog zašto su tehnike čišćenja tkiva izazvale veliko interesovanje [23]. Cilj ovih pristupa je pretvaranje neprozirnog tkiva u prozirno, očuvanje proteina i eventualno fluorescentnih markera, kako bi se snimili debele kriške tkiva. Kombinacija optičkog čišćenja sa najsavremenijom mikroskopijom pruža mogućnost morfometrijske analize, kao što je kvantifikacija volumena i broja glomerula, u debelim tkivima ili čak u intaktnom bubregu [24]. Druge primjene uključuju analizu različitih segmenata tubula [25], njihove funkcije [26] i kvantificiranje gubitka podocita [27].
Za snimanje velikih količina tkiva i, u isto vrijeme, rješavanje finih strukturnih detalja, nedavno je uveden novi tehnički pristup, odnosno ekspanziona mikroskopija (ExM). Ideja je da se fizički proširi cijeli organ 4- na 5-savijanje uz očuvanje cjelokupne arhitekture i 3D sadržaja proteoma. Koristeći ekspandirajući polimer, direktno sintetiziran unutar uzorka, molekule bliže od granice difrakcije svjetlosti su izotropno odvojene u prostoru na veće udaljenosti i stoga se mogu optički razlučiti čak i konvencionalnim fluorescentnim mikroskopom. Osim toga, ExM pruža veću optičku transparentnost i smanjuje rasipanje svjetlosti, omogućavajući vizualizaciju veće količine tkiva. Koristeći ovaj pristup, lokalizacija više proteina u prorezanoj dijafragmi i GBM može se secirati čak i normalnim konfokalnim mikroskopom [28]. Na primjer, može otkriti brisanje procesa stopala kod proteinuričnih miševa, kako u 2D tako iu 3D, na nanometarskoj rezoluciji koja nikada prije nije postignuta [29]. Nedavno se ExM koristio za kliničku histopatologiju uzoraka umetnutih u parafin koji su već obojeni hematoksilinom i eozinom [30]. Ova tehnika može vizualizirati brisanje procesa stopala na nanorazini što je ranije bilo moguće samo s EM. Napredak u volumetrijskom snimanju omogućava 3D analizu u visokoj rezoluciji cijelog organa na način da glavno ograničenje dubokog snimanja sada predstavlja sposobnost antitijela da prodru u tkivo.
PROUČAVANJE METABOLIČKOG PROFILA: FREKVENCIJSKA-DOMENA FLUORESCENCIJE-ŽIVOTNA MIKROSKOPIJA IMAGING
Thebubregje metabolički organ sa visokim sadržajem mitohondrija. Redukovani oblik NADH i drugi metaboliti su prirodno fluorescentni i ova autofluorescencija se može koristiti kao indeks redoks stanja [20]. Međutim, emisioni spektri ovih endogenih fluorofora se preklapaju, a njihovo odvojeno identifikovanje bilo je nemoguće. Međutim, utvrđeno je da se životni vijek fluorescencije (tj. vremensko opadanje fluorescencije) značajno razlikuje. Stoga fluorescentna mikroskopija za životni vijek (FLIM) omogućava proučavanje metaboličkih profila [31]. Nedavno je, koristeći kombinaciju MPM i FLIM, postalo moguće karakterizirati metaboličke potpise specifične za ćeliju i pratiti metaboličke promjene in vivo tokombubregbolest [32]. Očekuje se da će FLIM pružiti dalji uvid u tobubregmetabolizam in vivo u zdravlju i bolesti.
POTISANJE REZOLUCIJE IZNAD GRANICA: Snimanje bubrega u SUPER REZOLUCIJI
Standardna svjetlosna mikroskopija suočava se s ograničenjem optičke rezolucije preko 200 nm. Nove tehnologije, koje se nazivaju imidžing u super rezoluciji, sada omogućavaju fluorescentnoj mikroskopiji da slika izvan svoje granice difrakcije kao početne tačke ere nanoskopije [33]. Ovi pristupi kombinuju nanoskopsku rezoluciju s prednostima višebojnog fluorescentnog označavanja. U znak priznanja potencijalnog uticaja ovih inovacija, Nobelova nagrada za hemiju 2014. dodeljena je Eriku Betzigu, Stefanu Helu i Vilijamu Moerneru 'za razvoj super-razlučive fluorescentne mikroskopije. Za rješavanje različitih bioloških pitanja mogu se primijeniti različite strategije snimanja u super rezoluciji. Ovi pristupi se mogu grupisati u dvije glavne kategorije, ovisno o tome da li se super-rezolucija koristi na nivou pojedinačnih molekula ili na ansamblima [33].
Tehnike zasnovane na ansamblu
Tehnike zasnovane na ansamblima probijaju granicu difrakcije vremenski i prostorno modulirajući ekscitacijski svjetlosni snop. Među njima, snimanje iscrpljivanja stimulisane emisije super-rezolucije (STED) koristi dva lasera, ekscitacioni laser i superponirani, crvenim pomakom, laser za iscrpljivanje (STED laser), sa oblikom krafne, za suzbijanje fluorescentne emisije iz fluorofora koji se nalaze izvan centar ekscitacije. Ovo potiskivanje se postiže stimulisanom emisijom i omogućava prikupljanje samo signala koji potiče iz žarišne tačke čija je dimenzija ispod granice difrakcije (slika 2A). STED snimanje je korišteno za snimanje prorezane dijafragme u optički pročišćenojbubregtkiva (Slika 2B–c') i omogućio lokalizaciju prostorne distribucije podocina i nefrina na nanometarskoj skali do najmanje 30 lm dubine [34]. Osim toga, mogućnost promatranja i kvantifikacije brisanja procesa stopala u eksperimentalnom modelu može učiniti STED snimanje korisnim za proučavanje barijere glomerularne filtracije [34].
STED mikroskopija zahtijeva posebne protokole za pripremu uzoraka, posebne fluorofore i tehničku obuku. Iz tog razloga, u posljednjih nekoliko godina više pažnje je posvećeno drugoj tehnici super-rezolucije, strukturiranoj iluminacijskoj mikroskopiji (SIM), koja može produžiti granicu difrakcije za faktor dva i bočno i aksijalno. SIM koristi postavu mikroskopa širokog polja sa finim prugastim uzorkom osvjetljenja, omogućavajući hvatanje visokofrekventnih informacija (koje odgovaraju finim detaljima u uzorku) na nižim prostornim frekvencijama. Pribavljanjem više slika sa uzorcima osvjetljenja različitih faza i orijentacija, može se rekonstruirati slika visoke rezolucije (slika 3A). SIM je kompatibilan sa standardnim fluoroforima, ne zahtijeva posebnu pripremu uzorka i dozvoljava 3D vizualizaciju. S obzirom na sve ove prednosti, provedene su različite studije kako bi se procijenila mogućnost korištenja SIM-a kao brzog dijagnostičkog alata [35], na primjer, s potencijalno kraćim vremenom obrade od EM-a. Nedavno su 3D SIM i automatizirana obrada slike korišteni kao brzi dijagnostički alat za brisanje procesa stopala koristeći rutinske parafinske rezove iz biopsija pacijenata sa bolešću minimalnih promjena [36] (Slike 3B i C). Ova sposobnost da se uspešno identifikuju promene u bolestima za koje se zna da pokazuju nanorazmernu patologiju potvrdio je SIM kao obećavajući alat za rutinsku dijagnostiku.
Metode snimanja zasnovane na lokalizaciji jedne molekule
Ove tehnike se oslanjaju na mogućnost cikličkog uključivanja i isključivanja pojedinačnih fluorescentnih molekula koji su preblizu da bi se mogli razlučiti. U ovim pristupima, molekuli unutar područja ograničenog difrakcijom mogu se aktivirati u različitim vremenskim točkama tako da se mogu pojedinačno snimiti i naknadno lokalizirati s nanometarskom preciznošću kompjuterskim pronalaženjem njihovih centara (Slika 3D). Među ovim pristupima, stohastička optička rekonstrukcijska mikroskopija (STORM) je prvi put uvedena ububregistraživanje 2013. godine, sa studijom koja je otkrila zamršenu molekularnu organizaciju GBM nanometarskom preciznošću, uključujući orijentaciju molekula unutar [37]. U mišjem modelu rijetkog kongenitalnog nefrotskog sindroma, STORM je otkrio integraciju i ispravnu orijentaciju laminina 521 unutar GBM nakon intravenske injekcije, otvarajući put naprednim terapijskim opcijama za pacijente [38]. Druga studija je opisala organizaciju aktinskog citoskeleta u podocitima u rezoluciji molekularne skale [39] (Slika 3E-I). Kao novi nalaz, podociti sadrže kontraktilne aktinske snopove povezane sa nekontraktilnim aktinskim snopovima u procesima stopala. U modelima povrede podocita, aktinska struktura u procesima stopala se rastavlja, što dovodi do kolapsa kontraktilne strukture u glavnom tijelu [39].
VIZUALIZACIJA 3D STRUKTURA FUNDAMENTALNIH BIOMOLEKULA NA ATOMSKOM NIVOU: KRIO-ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA
Donedavno je mogućnost proučavanja strukture osnovnih biomolekula bila ograničena na elektronsku mikroskopiju, sa rezolucijom od nekoliko nanometara. Tehničke prepreke, kao što su oštećenje uzorka intenzivnim elektronskim snopom, niski kontrast slike i kretanje molekula nakon interakcije s elektronima ili poteškoće u očuvanju vode u biološkim uzorcima u vakuumu primijenjenom unutar EM komore, što onemogućuje razlučivanje molekula ispod ove veličine . Hlađenje uzorka može smanjiti isparavanje vode i oštećenje izazvano elektronima [40]. Iz ove ideje, krio-EM je uveden 1950-ih. Prije nekoliko godina, uvođenje novog detektora za brojanje jednog elektrona konačno je pomaknulo rezoluciju izvan prethodnih granica. Godine 2017. Nobelovu nagradu za hemiju dobili su Jacques Dubochet, Joachim Frank i Richard Henderson za „razvoj krio-elektronske mikroskopije za određivanje strukture biomolekula u otopini visoke rezolucije“. Ovaj napredak sada omogućava strukturno određivanje biomolekula u otopini [41].
Ububregistraživanja, strukture osnovnih proteina su određene na atomskom nivou [42, 43]. Među njima je i struktura ljudskog policistina-2, čije su mutacije odgovorne za autosomno dominantne policističnebubregbolesti [44], a struktura kanonskih 6 jonskih kanala prolaznog potencijalnog receptora, čije mutacije izazivaju FSGS kod ljudi [43], određena je rezolucijom od nekoliko angstroma [44].
RAZUMIJEVANJE MOLEKULARNE OSNOVE BOLESTI BUBREGA: INTEGRATIVNA MIKROSKOPIJA BUBREGA
U posljednjih nekoliko godina došlo je do povećanog interesa za pristupe bez oznaka koji mogu specifično i istovremeno mapirati ukupan spektar molekula u tkivima [45]. Među njima, masena spektrometrija sa laserskom desorpcijom/jonizacijom uz pomoć matriksa (MALDI-IMS) omogućava mjerenje stotina različitih molekula u isto vrijeme direktno na dijelovima tkiva u visokoj rezoluciji. U MALDI-IMS eksperimentu, tanak presek tkiva, zamrznut ili umetnut u parafin, obložen je matriksom koji apsorbuje lasersku energiju i potiče jonizaciju analita tkiva. Analiza u masenom spektrometru generiše spektar za svaku x/y koordinatu. Nakon MALDI mjerenja, isti dio tkiva može biti obojen tradicionalnim histohemijskim i imunohistohemijskim postupcima kako bi se molekularni uzorak integrirao sa histološkim detaljima. U istraživanju bubrega, MALDI-IMS se koristi za proučavanje lijekova, metabolita, lipida, peptida i proteina u normalnim i bolesnim tkivima [45].
Jedna od najčešćih primjena MALDI-IMS-a je identifikacija molekularnih markera za klasifikaciju karcinoma bubrežnih stanica [46] i utvrđivanje prave granice između kanceroznog i normalnog tkiva na molekularnom i histološkom nivou [47]. MALDI-IMS se također uspješno koristi za proučavanje bubrežne toksičnosti lijekova kako bi se omogućilo rano otkrivanje toksičnostibubregmehanizmi oštećenja posredovani farmaceutskim kandidatima [48]. Štaviše, MALDI-IMS se koristi za proučavanje lipida i njihove uloge u bubrežnim patologijama, kao što su dijabetička nefropatija [49], akutna ozljeda bubrega [50] i policističnibubregbolesti [51], kao i za otkrivanje endogenih metaboličkih profila za dublje razumijevanje mehanizama povezanih s bolešću [52]. Identifikacija molekularnih profila je također završena za moguće biomarkere koji bi mogli biti novi potencijalni dijagnostički i prognostički biomarkeri [53, 54].
ZAKLJUČCI I BUDUĆE PERSPEKTIVE
Stalna poboljšanja u tehnikama snimanja progresivno su riješila mnoge kritične tehničke preprekebubregistraživanja i omogućili su dinamičan prikaz strukture i funkcije normalnih i bolesnih bubrega. Zaista, pojava novih mikroskopskih tehnologija omogućila je fundamentalna naučna otkrića i naknadno promijenila naš pogled na fiziologiju i patofiziologiju bubrega koji se sada može vizualizirati u 3D, pa čak i snimati u video zapisima, gdje vrijeme predstavlja četvrtu dimenziju. Sa nedavnom tehnološkom inovacijom mikroskopije super rezolucije i napretkom tehnika molekularnog snimanja, istraživači sada mogu vizualizirati pojedinačne biomolekule direktno u tkivima i odrediti njihovu interakciju na ćelijskom i subćelijskom nivou.
Mogućnost primjene ovih alata na patološkebubreguzorci, fokusirajući se na molekularne i subcelularne detalje u kliničkim biopsijama, trebali bi pomoći u ponovnoj klasifikaciji bolesti. Trenutno je nejasno da li će i kada to uticati na dijagnozu bolesti bubrega ili čak na vođenje pacijenata.
FINANSIRANJE
Finansiranje je obezbijedio Evropski istraživački savjet u okviru programa za istraživanje i inovacije Europske unije Horizon 2020 (sporazum o grantu 648274).
REFERENCE
1. Weening JJ, Jennette JC. Historijske prekretnice u bubrežnoj patologiji. Virchows Arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666
3. Bowman W. O strukturi i upotrebi Malpigijevih tijelabubreg, sa zapažanjima o cirkulaciji kroz tu žlijezdu. Philos Trans R Soc A 1842; 132:57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. Porast bubrežne patologije u nefrologiji: struktura osvjetljava funkciju. Am JBubregDis 2013; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija i mikropunkcija kod intaktnih štakora. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25
6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 blokada prvenstveno regeneriše izgubljene podocite u kortikalnim nefronima ciljajući intrinzični mehanizam povratne sprege podocit-progenitor.BubregInt 2018; 94:1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. Hipertrofija tubularnih stanica povezana s endociklom i proliferacija progenitora obnavljaju funkciju bubrega nakon akutnogbubregpovreda. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Novi uvidi u strukturne obrasce koji se susreću u glomerulosklerozi. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–{4}}. Tisher CC. Funkcionalna anatomijabubreg. Hosp Pract 1978; 13
10. Liapis H. Elektronska mikroskopija ububregistraživanje: vidjeti je vjerovati. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. Strong ML, Evers P. Treća dimenzija u dijagnozi bubrega. Skenirajuća elektronska mikroskopija normalnih i abnormalnih bubrega. S Afr Med J 1979; 55:174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. Snimanje porozne ultrastrukture filtracionog proreza glomerularnog epitela. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et al. Vinkulin je neophodan za održavanje integriteta glomerularne barijere.BubregInt 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. Morfološki proces razvoja podocita otkriven elektronskim mikroskopskim skeniranjem blok-face. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rick R, Dorge A, Beck FX et al. Rentgenska mikroanaliza transepitelnog transporta jona elektronskom sondom. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Intracelularne koncentracije elemenata u bubrežnim tubularnim stanicama. Analiza elektronskom mikroprobom. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Nove in vivo tehnike za vizualizacijububreganatomiju i funkciju. Kidney Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. Dugovalna multifotonska ekscitacija je korisna za intravitalnobubregimaging.BubregInt 2016; 89: 712–719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. Praćenje sudbine glomerularnih epitelnih stanica in vivo korištenjem serijskog multifotonskog snimanja u novim modelima miševa s fluorescentnim oznakama loze. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, et al. Multifotonsko snimanje otkriva razlike u mitohondrijskoj funkciji između segmenata nefrona. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302
