Identifikacija Geni sata vezani za hipertenziju u bubregu od spontano hipertenzivnih štakora
Feb 20, 2022
POZADINUPostoji diurnalna varijacija fluktuacije krvnog tlaka hipertenzije, a abnormalnost fluktuacije krvnog tlaka smatra se nezavisnim faktorom rizika za oštećenje organa uključujući kardiovaskularne komplikacije. U trenutnoj studiji pokušali smo identificirati molekule odgovorne za formiranje cirkadijana krvnog tlaka pod kontrolombubregbiološki sat u hipertenziji.
METODE Dnk mikroarray analiza je izvršena ububreziod 5-sedmično spontano hipertenzivnih štakora (SHRS)/Izm, moždanih shr pacova (SHRSP)/Izm, i Wistar Kyoto (WKY)/Izm štakora. Da bi se detektirala varijacija, tubularne ćelije miša (TCMK-1) su stimulirane deksa- metazonom. Obavili smo imunostaining i zapadnu analizu blot ububregmedulla odbubregod 5-tjednih WKY pacova i SHRS- a.
REZULTATEIzvađeno je 1032 gena sa E-boxom, vezanim nizom za BMAL1 i CLOCK pomoću Gene Set Obogaćivanja Analize. U mikroarray analizi, identificirali smo 12 gena povećanih kao više od 2 puta ububreziSHRS i SHRSP u odnosu na WKY pacove. U periodičkoj regresionoj analizi, fosforibosil pirofosfat amidotransferaza (Ppat) i krhka X mentalna retardacija, autosomni homolog 1 (Fxr1) pokazao je cirkadijanski ritam. Imunocitohemija je otkrila PPAT-pozitivnost u nukleusima i cistoplazmi u tubulama, i FXR1-pozitivnost u cistoplazmi TCMK-1. U 5-tjednom WKY štakoru i SHR-ububrezi, PPAT je lokaliziran u nukleusu i cistoplazmi proksimalnih i distalnim tubulama, a FXR1 je lokaliziran na cistoplazmu proksimalne i distalne tubule.
ZAKLJUČCIPPAT i FXR1 su pivotalne molekule u kontroli cirkadijan ritma krvnog tlaka od stranebubregu hipertenziji.
Ključne reci:krvni pritisak;; hipertenzija; bubrega; nefrotubul; spontano hipertenzivni pacov
Različite biološke pojave, uključujući ciklus spavanja, otkucaje srca i krvni pritisak, imaju cirkadijanski ritam. Za cirkadijanski ritam otkriveno je prisustvo biološkog sata, tada je ustanovljeno da cirkadijanritm postoji u svim živim organizmima od arhebakterija do ljudskih bića. 1
Suprahijasmatski nukleus (SCN), za koji se smatra da funkcioniše kao centralni sat, je centar koji izvrši autonomnu oscilaciju cirkadskog ritma. Osim toga, unutrašnji satovi prisutni u perifernim organima su kontrolisani centralnim satovima, i označavaju odgovarajući ritam za svaki organ. 2 Centralni sat kontrolira periferne satove preko neurona i humoralnih faktora. SCN se sastoji od velikog broja neurona koji osciliraju autonomno, kada su te ćelije bile izolirane i raspršene u štakorima i miševima, pokazale su cirkadijanski ritam sa blagim razlikama u njihovoj frekvenciji paljbe i ekspresiji gena. Tako su pojedinačni neuroni u SCN-u satne ćelije sa vlastitim cirkadijanim oscilatorima. 3
Nedavno su pojašnjeni molekularni mehanizmi u podlošnosti ritma bioloških sakova. Biološki sat se sastoji od glavne petlje u kojoj mozak i mišićni arnt-like 1 (BMAL1), Circadian lokomotorni izlazni ciklusi kaput (CLOCK), Period (PER), i Cryptochrome (CRY) rade kao jezgreni proteini. Sat i BMAL1 formiraju dimer da djeluju kao transkripcioni faktor i vežu se za E-box sekvencu (CACGTG). 4 Ciljni geni uključuju druge gene sata, kao što su Per i Cry. Generirani PROTEINI PER i CRY translociraju u nukleus i potiskuje BMAL1 i CLOCK gene. Naknadno, PER i CRY se vremenom rješavaju putem multistep fosforilacije kazinom kinaze (CKIε), glikogen sintaze (GSK-3β), i AMP- aktivirane proteinske kinaze (AMPK). Tako supresiju BMAL1 i CLOCK otkazuju PER i CRY, a promocija genske ekspresije od strane CLOCK i BMAL1 ponovo počinje, a sat ide okolo. Pored ove glavne petlje, postoji i subloop koji uključuje potporodicu nuklearnih receptora 1 grupe D (NR1D1), retinoinski receptor koji se odnosi na receptore siročadi (ROR), D-mjesto proteina za vezanje albumina promotera (DBP) i E4 promotera vezanog proteina 4 (E4BP4). NR1D1 se veže za RRE (AGGTCA) sekvencu i potiskuje glavnu petlju putem negativnih povratnih informacija, dok DBP promovira glavnu petlju putem pozitivnih povratnih informacija vežući se za D-box (TTATGTAA) sekvencu. 5 Također je re-ported da proteini kucaju cirkadijanski ritam pod kontrolom biološkog sata dostižu približno 15% u svakom tkivu. 6 Biološki sat je uključen u formiranje cirkadijanih ritmova raznih fizioloških pojava.
Poznato je da postoji diurnalna varijacija fluktuacije krvnog tlaka hipertenzije, a smatra se da je abnormalnost fluktuacije krvnog tlaka nezavisan faktor rizika za oštećenje organa uključujući kardiovaskularne komplikacije. 7 Poremecen krvni pritisak cirkadijanski ritam uzrokuje ostecenje organa. Postoji mnogo izvještaja o odnosu između krvnog tlaka i bioloških sakova, kao što su Per, Cry, Bmal1, i Clock. U Bmal1 nokaut miševi su prijavljeni sniženje krvnog tlaka, gubitak dnevnog fluktuacije krvnog tlaka i ozljeda vaskularne endotelijske ćelije. 8 Nokaut miševi su prijavili da pokazuju povećano izlučivanje natrija u urinu, smanjen krvni pritisak, pa čak i smanjen otkucaje srca i smanjen puls cirkadijanska amplituda. 9 Dashti et al. je izvijestio da geni sata inducira veliki upor fenotipske varijance u sistolikom krvnom tlaku. 10
U vezi doprinosabubrezido cirkadijan ritmova, normalnobubreziimaju veće izlučivanje elektrolita i proizvodnju urina tokom dana nego noću, a postoji cirkadijanski ritam u izlučivanje natrija, kalija i hlora. 11 Kod hipertenzije, javlja se da je neuspjeh cirkadijanog ritma ovih funkcija povezan sa kardiovaskularnim komplikacijama. 12 Per1 nokaut miševi pokazuju povećano izmeta natrija i sniže krvni tlak u odnosu α podjedinicebubregepitelnog natrijevog kanala (αENaC) u kanalu za sakupljanjebubreg, što ukazuje na prisustvo biološkog sata ububreg.13 Osim toga, u bolesnika s kroničnom bolešničom opaža se i diuralna varijacija krvnog tlaka (nondipper status)bolest bubrega. 14 Tako centralni sat koji se nalazi u SCN regulirabubregperifernog sata, označavajući optimalni tajming zabubreg.
Spontano hipertenzivni štakor (SHR), genetski model esencijalnih hipertenzija, je prijavljen da pokazuje odstupanje otkucaja srca i diurnalnu fluktuaciju krvnog pritiska, koji se pojačava starenje. 15 Prethodno smo istraživali cirkadijanski sat nad nadležne žlijezde u SHR i Wistar Kyoto (WKY) štakorima koji se održavaju pod 12-satnim svjetlosno-tamnim ciklusom i otkrili da SHR posjeduje abnormalni nadležni cirkadijanski sat
i pokazati izmijenjeni cirkadijanski ritam enzima koji ograničava brzinu kodiranje gena sa satom u genezi steroida kao i izmijenjeni nivo glukokortikoida u serumu. 16 Osim signala iz centralnog SCN sata, poznato je da glukokortikoid oslobođen iz nadbubulene žlijezde sinhronizira periferni cirkadijalni sat u drugim organima. 17 Deksametazonska stimulacija može reproducirati cirkadijansko kolebanje gena sata i biti primjenjiva za in vitro ispitivanje. 18 U tom slučaju, moguće je da SHR ima i abnormalne periferne cirkadijarne satove u raznim organima uključujućibubregkoja ima ključnu ulogu u regulaciji krvnog tlaka. Ipak, cirkadijanski sat ububregiz SHR-a nije u potpunosti shvaćen.
U trenutnoj studiji, pokušali smo identificirati odgovorne gene satabubregu hipertenziji koristeći SHR i shr štakore sklone moždanom udaru (SHRSP), te procijenio uloge gena sata uključenih u regulaciju abnormalnog cirkadijanog ritma krvnog tlaka.
METODE
Etika i životinjeNaša istraga je bila u skladu sa Vodičem za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja koje su objavili nacionalni instituti za zdravlje (NIH Publication No. 85-23, 1996). Istraživački protokoli koji uključuju upotrebu živih životinja su ocijenjeni od strane etičkog odbora Nihon University School of Medicine (No. 11–034). WKY/Izm rats and SHR/ Izm maintained at Disease Model Cooperative Research Association su kupljeni od Japan SLC (Hamamatsu, Shizuoka, Japan). Sistolički krvni pritisak je izmjeren metodom rep-manžeta. U ovoj studiji, kako bi se izbjegle sekundarne promjene u ekspresiji gena po povišenju krvnog tlaka i identificirali odgovorni geni koji utječu na cirkadijane ritmove i na kraju pridruže hipertenziju, odabrali smo prehipertenzivne 5-tjedne štakore.
Traži gene sa E-kutijom u cijelom genomu
Koristili smo bazu podataka molekularnih potpisa u Gene Set Obogaćivanju Analiza (GSEA; Broad Institute, Boston, MA) da pretraže gensku klasteru za ljudske transkripcione faktore meta i koristi bazu podataka sa najvišim brojem gena uzvodno od tačke početka transkripcije A gena, u kojem je E-box (CACGTG) bio prisutan na 2.000 bp uzvodno.
DNK mikroarray analiza
Bubreziuklonjeni su iz 5-tjednih SHR/Izm, SHRSP/Izm, i WKY/Izm štakora u 12:00. Resektedbubreghomogeniziran je sa TaKaRa BioMasher standardom (Takara, Otsu, Shiga, Japan), a izvađena je i totalna RNK. Nakon hibridizacije i skeniranja, izvršena je kvantifikacija sa Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies). Genska ekspresija je upoređena i ispitana. Geni čiji se izraz koleba između soja bili su ekstrahiran sa pragom od više od 2 puta ili manji od 0,5 puta.
Otkrivanje varijacije gena kandidata u ćelijama TCMK-1
Tubularne ćelije miša (TCMK-1) iz Američke kolekcije kulture tipa (ATCC, Manassas, VA) su stimulirane sa 0,5 μmol/l deksametazonom kao što je opisano
Prethodno. 18 Medij je promijenjen u Dulbeccoov Modificirani Orlov medij bez seruma. Totalna RNK je ekstrahirana svaka 4 sata nakon stimulacije deksametazona, a obilje Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat i Tef mRNAs je kvantificirano korištenjem lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu. U istom koraku, lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu je izvedena na Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) RNK i koristi se kao interni standard. Korišteni primeri su nabrojeni u Dopunskom stolu S1 online. Periodičnost mRNA fluktuacije nakon deksameta- sone stimulacije ćelija TCMK-1 analizirana je multivarijatnom regresijnom analizom koja je odredila mrežnu krivinu (MESS), amplitudu (AMP), fazu (TZ1) optimizirajući kozinsku krivinu koristeći metodu najmanje kvadrata Procjene MESS-a, AMP-a i TZ1; njihovi intervali pouzdanosti od 95% su izračunati metodom jednostruke slučajnosti.
Imunofluorescentno mrljanje ćelija TCMK-1TCMK-1 ćelije su fiksne sa 4% paraformaldehida. Nakon opranja sa fosfatnim baferiranim salinom, ćelije su inkubiraju sa zečjim monoklonskim anti-PPAT antitijelom
(Sigma-Aldrich) razrijeđen 250 puta i zec monoklonsko anti-FXR1 protutijelo (Abcam, Cambridge, UK) razrijeđeno 300 puta na 1 sat na temperaturi sobe. 1.000 puta više puta razlučivanje Alexe Fluor 488 anti-zec IgG (Invitrogen), kao sekundarno protutijelo, napravljeno je da reagira u mraku 1 sat.
Imunostaining u bubregu od WKY pacova i SHRUbubregmedulla odbubregod 5-tjednih WKY/ Izm štakora i SHR/Izm bio je izoliran i ugrađen u parafin, te inkubiran zečjim monoklonskim anti-PPAT antitijelom razrijeđenim 250 puta, a zečje monoklonsko anti-FXR1 protutijelo razrijeđeno 200 puta. Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) je primijenjen kao sekundarno antitijelo. Kriške su dehidrirani, očišćeni, zatvoreni marinolom, i posmatrani pod optičkom mikroskopom.
Western blotting za FXR1 i PPAT proteine u bubrege od WKY štakora i SHRUbubregmedulla je bila podvrgnuta ekstrakciji proteina koristeći bafer za ispitivanje radio-imunoprecipitacije (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Kriške su prebačene na poliviniliden difluoridnu membranu sa iblotom (Invitrogen) i blokirane sa 5% obranog otopine mlijeka 1 sat. Primenjena su primarna antitijela, koja su bila zečja monoklonska anti-FXR1 antitijela, i zečje monoklonsko anti-PPAT antitijelo. Hren peroksidaze konjugiran kozji antirabbit IgG (Jackson ImmuneReseach, West Grove, PA) je korišten kao sekundarno protutijelo. GAPDH je korišten kao interni standard.
Statističke analizeVrijednosti su prijavljene kao ± SE. Studentov t-test je korišten za analizu neplaćenih podataka. Korištena je i 2-way analiza odstupanja sa Bonferroni/Dunn procedurom kao post-testom. P vrijednosti od<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistical="">
REZULTATE
Krvni pritisakSistolički krvni pritisak 5-tjednih WKY/Izm štakora, SHR/Izm štakora, i SHRSP/Izm štakora je bio 116 ± 3,0 (n = 6), 121 ± 3,3 (n = 6), odnosno 125 ± 3,4 (n = 5) mm Hg. Sistolički krvni pritisak se nije razlikujeo među 3 soja u statistički značajnoj mjeri.
Potraga za genima sa E-boxom u promotoru od strane GSEA analizeTragali smo za genima koji nose E-box (CACGTG) sekvencu vezanja sata i BMAL1 heterodimera u cijelom genomu. Kao rezultat toga, identifikovano je 1.032 gena koji su nosili E-kutiju između 2.000 bp uzvodno ili nizvodno od tačke inicijacije transkripcije (Dopunska tabela S2 na mreži).
Usporedba genske ekspresije u bubregu od WKY, SHR i SHRSP pacova po DNK mikroarray analiziUsporedili smo gensku ekspresiju ububreziod 5-tjednih WKY/Izm štakora i SHR/Izm štakora koji koriste DNK mikroaraye. Tri stotine šezdeset tri gena su bili visoko izraženi (više od 2 puta) ububregkorteks SHR/Izm štakora u usporedbi sa WKY/Izm štakorima. Nivo izraza od 281 gena ububregbili su više od 0,5 puta u odnosu na WKY/Izm štakore. Ububregmedulla od SHR/Izm štakora, 284 gena pokazala su viši nivo ekspresije i 203 gena
pokazao niže razine izraza u odnosu na WKY/Izm štakore. Ububregkorteks SHRSP/Izm štakora, nivo izraza od 267 gena je bio više od 2 puta u odnosu na one u WKY/Izm štakorima. Nivo izraza od 580 gena bio je manji od 0,5 puta u poređenju sa WKY/Izm štakorima. UbubregMedulla od SHRSP/Izm, 639 gena je pokazalo više razine izražavanja i 251 gen je pokazao niže razine izraza u odnosu na WKY/Izm štakore. Među 1.032 gena sa E-kutijom, nivo izraza od 17 gena mRNA je bio više od 2 puta ububregkorteks SHR/Izm štakora u usporedbi s
Na 2. Izraz varijacija gena kandidata mRNA u TCMK-1 ćelijama nakon deksametazonske stimulacije. TCMK-1 ćelije su stimulirane sa 0,5 μmol/l deksametazona 2 sata. Totalna RNK je ekstrahirana svaka 4 sata nakon stimulacije deksametazona, a obilje NPM1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat, i Tef mRNAs je ocjenjivano lančanom reakcijom polimeraze u stvarnom vremenu. Relativni genski izraz analiziran je u odnosu na GAPDH mRNA. Podaci su predstavljeni kao ± SEM (n = 6).
WKY/Izm pacovi. Među ovih 17 gena, izraz 4 gena (Bcl6, Nr1d1, Ppat i Tef) je povećan više od 2 puta ububregkorteks SHRSP/Izm štakora u usporedbi sa WKY/Izm štakorima (Tabela 1). Ububregkorteks SHR/Izm štakora, otkriven je izraz 10 gena mRNA, koji su se smanjili kao manji od 0,5 puta u odnosu na WKY/Izm štakore; 8 ovih gena (Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1,
Plbd1, Tbl1x i Trim46) također su se umanjene kao manje od 0,5 puta ububregkorteks SHRSP/Izm štakora (Tabela 1). MRNA izraz 10 gena ububregmedulla iz SHR/Izm štakora je povećana više od 2 puta u odnosu na WKY/Izm štakore. Među ovih 10 gena, izraz Nr1d1 i Tef mRNA ububregmedulla iz SHRSP/Izm štakora je povećana više od 2 puta u odnosu na WKY/Izm štakore (Tabela 1). Izraz Transferrin receptora (Tfrc) mRNA ububregmedulla shr/izm štakora pokazala je kao manje od 0,5 puta u odnosu na WKY/Izm štakore. Međutim, izraz Tfrc mRNA je povećan ububregmedulla of SHRSP/Izm rats (Table 1).
Indukcija mRNNA gena sata u nefrotubularnim ćelijamaNa sliku 1 se vidi varijacija u izrazu Per1, Bmal1, Nr1d1 i Cry1 mRNA nakon dodavanja dex- ametazona u ćelijama TCMK-1. Amplituda izraza Per1, Bmal1 i Nr1d1 mRNA pokazala je vrhove na 28 i 44 sata nakon 4 sata stimulacije deksametazona. Amplituda izraza Cry1 mRNA pokazala je vrhove na 4, 28, a 44 sata nakon 4 sata stimulacije deksametazona. Tako je stimulacija deksametazona inducirao fluktuaciju izraza mRNA gena sata u TCMK-1 (figure 1 i 2).
stimulaciju deksametazona. MRNA izraz Ppata je dostigao vrhunac u 28 sati nakon stimulacije deksametazonom, a zatim se ponovo povećao u 44 sata. Hnrnpa3 je pokazao vrhove na 16, 28, i 44 sata i pokazao amplitute relativno slične Per1. NPM1 je pokazao vrhunac u 28 sati, slično Per1. Fxr1 je pokazao vrhunac na 24 i 44 sata (na 2. Obavili smo periodičku regresijsku analizu kako bismo ocijenili statistički značaj ovih varijacija. Analiza je pokazala da je varijacija izraza Cry1 i Bmal1 mRNA pokazala značajnu (P< 0.05)="" periodicity="" after="" dexamethasone="" loading="" in="" tcmk-1="" cells="" (supplementary="" figure="" s1="" and="" table="" s3="" online).="" the="" results="" of="" periodic="" regression="" analysis="" of="" 7="" genes="" are="" shown="" in="" supplementary="" figure="" s2="" and="" table="" s3="" online.="" the="" analysis="" indicated="" that="" fxr1="" and="" ppat="" showed="" sig-nificant="" (p="">< 0.05)="" regression.="" in="" the="" regression="" of="" fxr1,="" both="" the="" period="" and="" amplitude="" showed="" large="" waves,="" while="" in="" ppat,="" both="" the="" period="" and="" amplitude="" were="" small="" and="" showed="" ultradian="">
Imunostaining PPAT i FXR1 u nefrotubularnim ćelijama i u bubrega od WKY i SHR štakoraPPAT je lokaliziran i u cistoplazmi i u nukleusu. FXR1 je lokaliziran samo u cistoplazmi ćelija TCMK-1 (na 3. PPAT je bio obojen i u jedro i u cisto- plazmi u proksimalnim i distalnim tubulama (sliku 4). FXR1 je uglavnom bio zatamnjena u cistoplazmi proksimalne i distalne tubule (sliku 4). Nije bilo vidljivih razlika u mrljanju ili lokalizaciji bubrega WKY i SHR pacova.
FXR1 i PPAT proteinski izraz u bubregima od WKY i SHR pacovaNa sličci 5 se vidi zapadno blotting FXR1 i PPAT proteina ububregMedulla od 5-tjednih WKY i SHR pacova. Obilje FXR1 proteina bilo je ububregmedulla shr štakora bila je znatno niža u usporedbi s WKY štakorima (P< 0.05).="" the="" ppat="" protein="" expression="" in="" the="">bubregmedulla od WKY i SHR štakora nije se razlikovala u sta- tistično značajnoj mjeri.
RASPRAVAHipertenzija inducira kardiovaskularne ibubregkomplikacije, kao što su kroničnebolest bubrega(CKD). Poznato je da bolesnici s CKD razvijaju abnormalnosti fluktuacije krvnog tlaka, što ukazuje na to da jebubregmože biti uključena u abnormalni cirkadijanski ritam krvnog tlaka u hipertenziji. 19 U trenutnoj studiji, stoga smo imali za cilj identificirati molekule odgovorne za formiranje cirka-dian ritma pod kontrolom biološkog satabubregu hipertenziji. Dobili smo 1.032 gena kandidata koji nose E-box se- quence iz GSEA baze podataka. Pošto BMAL1/CLOCK heterodimer veže E-box za regulaciju transkripcije gena nizvodno, ovi geni se smatraju kontroliranim biološkim cirkadijalnim satom. Da bismo identificirali molekule u volviranom u cirkadijanom ritmu krvnog tlaka u bubregu, sveobuhvatno smo istražili ekspresiju gena u bubregima iz SHR, SHRSP i WKY štakora koristeći DNK mikroarray. Među 1.032 gena, izabrali smo transkripte koji su se povećali više od 2 puta ili se sniže manje od 0,5 puta
u SHRbubregu srodstvu sa onima WKY pacova. Zatim smo se fokusirali na gene koji su pokazali slične trendove ububreziod SHRSP, konkretno, Bcl6, Nr1d1, Ppat, Tef, Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1, Plbd1, Tbl1x, i Trim46. Ovih 12 gena koji nose E-box sekvencu, koji su pokazali viši ili niži nivo ekspresije u oba hipertenzivna modela pacova (SHR i SHRSP) u poređenju sa normotenzivnim WKY štakorima, su možda povezani sa cirkadijanim ritmom krvnog pritiska. Među tim genima, Nr1d1 se naziva i Reverzno erithroblastosis virus-α (Rev-erbα), je prijavljen da formira subloop biološkog sata. 20
Potvrđeno je da je podvrgavanje kulturanih ćelija deksametazonu ili visokokoncentracionom konjskom serumskom šoku reproduciralo amplitudu genskog izraza sata in vitro. 21,22 Dodavanje seruma visoke koncentracije i glukokortikoida smatra se korisnim za reprodukciju cirkadijan ritma ekspresije gena sata u perifernim tkivima. 18,23 U ovoj studiji, uspjeli smo inducirati amplitudu Per1, Cry1, i Nr1d1 mRNA gena sata in vivo sa deksametazon učitavanje u ćelije tubularne miša. Sa utovarom deksametazona, Per1 je povećan u 4, 20–24, a 44 sata nakon stimulacije, Cry1 je povećan u 0–8 i 24–32 sata, a Nr1 d1 je povećan na 0–4, 16–24, i 40–44 sata. Ove promjene su slične onima opisanim u prethodnim izvještajima. 21 Koristeći ovaj deksametazonski sistem, identificirali smo indukciju amplituda 2 gena: Fxr1 i Ppat. Štaviše, immunostaining je pokazao da je PPAT izražen u nukleusu i cistoplazmi tubula, a FXR1 je izražen u cistoplazmi tubula. Ovi rezultati govore da su ove 2 molekule kontrolirane od stranebubregperiferni sat i potencijalni su kandidati za formiranje cirkadijala krvnog tlaka.
Zapadni blotting je otkrio da je proteinski izraz FXR1 bio niži ububregMedulla od SHR pacova nego kod WKY pacova. Izraz PPAT-a u bubregu medule WKY štakora i SHR-a nije se razlikovala u statistički značajnoj mjeri. Fxr1 pripada istoj porodici gena kao krhki X gen mentalne retardacije 1 (Fmr1), koji se smatra uzročnim genom krhkog X sindroma. FXR1 je protein vezan za RNK koji u interakciji sa FMR1 i FXR2. Hipoteza je da se cistoplazma i jezgro mogu uzvratiti jer imaju signale nuklearne lokalizacije i nuklearne izvozne signale. 24 Kod ljudi je dokazano da aberantan izraz Fxr1 u skeletnom mišiću izaziva facioscapulohumeralnu mišićnu distrofiju. 25 U ovoj studiji, izraz Fxr1 je smanjen ububrezishr i SHRSP štakora i izražen je u cjevastoj cistoplazmi mezodermalnog porijekla, što je isto kao i kod skeletnog mišića, a može biti uključeno u proliferaciju i rast cjevastih ćelija. PPAT formira homotetramer u obliku krofne i postaje inaktivirani homotetramer vezivom purinih nukleotida da utiču na metabolizam uricne kiseline. U ovoj studiji, izraz PPAT-a je povećan ububrezishr i SHRSP štakora, a PPAT je lokaliziran u cistoplazmi i nukleusu tubularnih ćelija. Budući da uricna kiselina ima jaku vaskularnu toksičnost i da je nezavisan faktor rizika za arteriosklerozu. Tako bi aberantna PPAT funkcija mogla biti povezana sa patofiziološkim karakteristikama SHR-a.
Ova studija je primijenila sekvence i analize izraza i kulturne eksperimente ćelija u novom pokušaju sužavanja molekula koje su vezane za regulaciju krvnog tlaka i koje kontrolira biološki sat. Nadalje, Fxr1 i Ppat su kontrolirani biološkim satom i vezani su za regulaciju krvnog tlaka. Daljnje studije su neophodne za mjerenje i potvrdu vremenske varijacije ekspresije gena Fxr1 i Ppat u štakorububreg.Očekuje se da će mehanizmi djelovanja ovih molekula biti pojašnjeni. Kontrola ovih molekula se smatra metom za biološko liječenje abnormalnosti fluktuacije krvnog tlaka.
Na osnovu nalaza sadašnje studije, moguća kružna povratna petlja ububregiz SHR-a je prikazano na 6. PPAT i FXR1 imaju EBOX u kojem se BMAL1 i CLOCK vežu za promotora, sugerirajući da su uključeni u formiranje cirkadijanog ritma u tubulama pod kontrolom gena sata. Smatra se da su uključeni u reabsorpciju i izlučivanje vode i elektrolita u tubule, te da mogu utjecati na hipertenziju i cirkadijanski ritam krvnog tlaka.
Tako su PPAT i FXR1 smatrani molekulama u volviranom u formiranju cirkadijanog ritma krvnog tlaka ububreg. U odnosu na mehanizme regulacije krvnog pritiska, ove molekule su vodeći kandidati za studije koji žele da eluciduju mehanizme na kojima se nalazi formiranje cirkadijanog ritma krvnog pritiska.
