Identifikacija i funkcionalna analiza bifavona kao novog inhibitora potencijalnih prolaznih receptora vaniloidnih 4-zavisnih aterogenih procesa
Feb 22, 2022
Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comda saznam više
Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, Rishov Goswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman
Ateroskleroza, progresivna upalna bolest velikih arterija, čini najveći doprinos rastućem teretu smrtnosti i morbiditeta uzrokovanih kardiovaskularnim bolestima na globalnom nivou1. Ključni početni događaj koji dovodi do ateroskleroze uključuje zadržavanje modificiranih čestica lipoproteina niske gustine (oxLDL) u subendotelnim intimnim prostorima aorte prvenstveno u tačkama grananja arterija2. Tokom rane aterogeneze, nakon endotelne disfunkcije, cirkulirajući krvni monociti transmigriraju u područja intime i diferenciraju se u tkivne makrofage3. U intimalnim prostorima aorte, vezivanje i uzimanje oxLDL-a od strane makrofaga uz pomoć receptora hvatača kao što su SRA i CD36 stvara atero-inflamatornu petlju koja se dalje prenosi, što rezultira razvojem lipidnih pjenastih ćelija, kritičnog procesa u aterosklerozi2–8. Kaskade upalnih događaja izazvanih pjenastim stanicama dovode do formiranja rane masne trake i na kraju do pojave uznapredovale aterosklerozne lezije koje karakterizira prisustvo fibroznog poklopca, kalcificiranog tkiva, imunoloških stanica, matriksnih proteina i lipida2–10. Potencijalni prolazni receptor Vaniloid 4 (TRPV4) iz TRPV potfamilije, neselektivni, polimodalni katjonski kanal propustljiv za Ca2 plus je sveprisutno eksprimiran u različitim tipovima ćelija uključujući makrofage11-24. Ranije poznat kao osmosenzor, sada je poznato da TRPV4 reaguje na različite biohemijske i biomehaničke stimuluse uključujući toplotu, krutost matriksa, osmolarnost, faktore rasta, pH i 4 forbol estra11-24. Izvještava se da TRPV4 posreduje u nekoliko fizioloških funkcija kao što su osjećaj bola kod upala i neuropatija18,22,23, diferencijacija i migracija miofibroblasta 17,25,26 i diferencijacija osteoklasta u kosti27. TRPV4 mutacije su povezane s nekoliko kanalopatija28-31. Nedavne studije naše grupe i drugih su implicirale moguću ulogu ovog kanala u bezbrojnim patološkim stanjima kao što su ozljede pluća22,32, formiranje pjenastih ćelija14,16, fbroza tkiva17,33, odgovor stranog tijela13 i rak34,35. Prethodno je prikazana ateroprotektivna uloga TRPV4, u kojoj se pokazalo da je funkcija TRPV4 izazvana hemijskim agonistom u endotelnim ćelijama povezana sa aktivacijom eNOS i inhibicijom adhezije monocita na endotelne ćelije36. Nasuprot tome, nedostaci u funkcijama TRPV4 povezani su s brojnim ateroinfamatornim odgovorima uključujući endotelnu disfunkciju, smanjeno stvaranje pjenastih stanica makrofaga i vaskularne bolesti14,16,37–39. Naša laboratorija je nedavno identifikovala proaterogenu ulogu TRPV4 pri čemu on reguliše formiranje pjenastih ćelija makrofaga izazvano oxLDL. Mehanički, pokazali smo da TRPV4 utiče na unos, ali ne i na vezivanje oxLDL-a u makrofagima na CD{55}}nezavisan način14. U drugoj studiji, izvijestili smo o TRPV4-zavisnoj egzacerbaciji formiranja pjenastih ćelija izazvanih oxLDL-om u prisustvu lipopolisaharida i povećanju krutosti matriksa, čime se obezbjeđuje veza između mehanosensinga i rizika od ateroskleroze16. Uzimajući u obzir sve zajedno, ovi nalazi upućuju na TRPV4 kao atraktivnu metu kod ateroskleroze i drugih bolesti, čime se podstiče otkriće malih molekularnih inhibitora TRPV4 koji se mogu prevesti u klinički efikasne terapeutike. Upotreba prirodnih jedinjenja u terapiji je dobila na značaju, prvenstveno vođena potrebom za isplativim i biokompatibilnim jedinjenjima u poređenju sa trenutno postojećim sintetičkim lekovima. Prirodna jedinjenja kao nprflavonoidi, alkaloidi,polifenoli, i kurkuminoidi, utiču na kardiovaskularne bolesti putem različitih mehanizama kao što je inhibicijaproinflamatornosignale, inzulinsku senzibilizaciju i poboljšanje profila lipida u krvi ciljanjem na AMPK, COX1/2, eNOS i Nrf2 puteve40-45. Nedavne studije više grupa su identifikovale dva flavonoida, berberin i apigenin, kao potencijalne modulatore aktivnosti TRPV446,47. Razvili smo i koristili metodu polu-visoke propusnosti za identifikaciju potencijalnih antagonista TRPV4 iz biblioteke prirodnih jedinjenja koristeći fluorometrijski čitač ploča za snimanje (FLIPR) zasnovan na Ca2 plus testu priliva. Ovdje izvještavamo o identifikaciji i funkcionalnoj analizi Linkedina, flavona, kao novog inhibitora TRPV4-zavisnih aterogenih procesa u makrofagima, postavljajući na taj način temelje za dalja istraživanja ovog prirodnog jedinjenja kao prirodnog antiaterosklerotskog malog molekulsko jedinjenje. Prijavljeno je da Linkedin pokazuje neuroprotektivnu,anti-kancerogen, iprotuupalnouloge48,49. Izvještavamo o mehanizmu djelovanja Linkedina protiv TRPV4 u okruženju formiranja pjenastih ćelija makrofaga koristeći brojne biohemijske i ćelijske testove.
Molimo kliknite ovdje da saznate više
Materijali i metode Životinjske i ćelijske kulture
Nabavili smo kongene miševe divljeg tipa C57BL/6 (WT) od Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, SAD). Smjernice Komiteta za njegu i korištenje životinja Univerziteta Maryland su poštovane za sve eksperimente na životinjama, a autori su se pridržavali smjernica ARRIVE. Za izolaciju mišjih rezidentnih makrofaga (MRM) izazvanih tioglikolatom, peritonealna lavaža je sakupljena nakon 4 dana intraperitonealne injekcije tioglikolata, a ćelije su održavane u 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) koji sadrži DMEM7,14,16. Ćelijska linija mišjih makrofaga (RAW264.7) i humani dermalni fibroblasti (HDF) kupljeni su od ATCC (Manassas, VA), i kultivisani su, respektivno, sa DMEM ili MEM (Gibco, Waltham, MA). Makrofagi izvedeni iz mišje koštane srži (BMDM) sakupljeni su od 6- do 7- sedmica starih miševa, kao što je prethodno opisano14,50,51. Ukratko, bedrene kosti miševa WT i TRPV4 KO su sakupljene, a koštana srž femura je isprana kompletnim DMEM medijumom sa 10 posto FBS. Suspendirane ćelije koštane srži su filtrirane kroz cjedilo od 70 µm (BD bioscience), centrifugirane i držane u DMEM mediju sa dodatkom M-CSF (25 ng/mL) 7-8 dana na 37 stepeni da bi se omogućila diferencijacija u makrofage.
Reagensi
Linkedin i GSK1016790A (GSK101) su kupljeni od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), a FLIPR komplet za analizu kalcijuma 6 je nabavljen od Molecular Device (Sunnyvale, CA). Ljudski prirodni LDL (VLDL) kupljen je od Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Inkubirali smo LDL sa 5 µM CuSO4 tokom 12 sati na 37 stepeni da bismo pripremili LDL oksidovani bakrom (oxLDL)7,14,16. DiI-oxLDL, označen fluorescentnom bojom, kupljen je od Invitrogena (Carlsbad, CA), a MCSF od R&D (Minneapolis, MN). Antitijela za FACS analizu su bila: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 i TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugirana sekundarna antitijela su iz R&D (Minneapolis, MN), a PE-konjugirana izotipska kontrola bila je iz BD (Franklin Lake, NJ). Za kvantitativnu polimeraznu lančanu reakciju (qRT-PCR), koristili smo komplet RNeasy iz QIAGEN-a (Redwood City, Kalifornija). Svi prajmeri su kupljeni od Bio-Rad (Hercules, CA). Mediji za ćelijske kulture, proizvodi vezani za ćelijsku kulturu i western blot reagensi su dobijeni od Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).
Cistanche protiv umora
Polu visokopropusni skrining
Izvršili smo polu-visoko propusni skrining za antagoniste Trpv4 iz biblioteke od 2000 prirodnih jedinjenja (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) koristeći fluorometrijski čitač slikovnih ploča (FLIPR) baziran na testu priliva kalcijuma14,17. Identifikovali smo ginketin (GGT), kao novi antagonist TRPV4. Primarni i sekundarni skrining su obavljeni sa RAW264.7, HDF i BMDM-ima kako bi se procijenila sposobnost Linkedina i drugih kandidata da inhibiraju TRPV4-izazvan Ca2 plus infux14,17. Kao kontrole, koristili smo A23187, kalcijum jonofor, TRPV4 null BMDM, i GSK219, selektivni antagonist TRPV417. Nakon sekundarnog skrininga, identifikovali smo šest jedinjenja koja pokazuju više od trostruku inhibiciju TRPV4-posredovanog Ca2 plus priliva u poređenju sa kontrolom nosača. Linkedin je identificiran kao najmoćniji inhibitor aktivnosti TRPV4. BMDM (5×104 ćelije/bunariću) su posađene u kolagenom obložene (10 µg/ml) 96-prozirne crne ploče sa bunarom i inkubirane na 37 stepeni, 5 procenata CO2. Na dan eksperimenta ćelije su napunjene kalcijum 6 bojom u HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecidom i inkubirane 45 minuta na 37 stepeni. Nakon inkubacije, bibliotečka jedinjenja su dodana u svaku jažicu do konačne koncentracije od 2 µM. Ploče su inkubirane još 45 minuta na 37 stepeni. Priliv Ca2 plus induciran je dodatkom 10 nM agonista TRPV4 GSK1016790A u ćelije prethodno tretirane nosačem ili jedinjenjem i zabilježen mjerenjem ΔF/F (Max-Min), kao što je prethodno opisano17. Podaci su prikazani kao relativne fluorescentne jedinice (RFU).
Imunoblotovi
Peritonealni makrofagi izazvani tioglikolatom zasijani su u 10 posto FBS koji sadrži DMEM i inkubirani preko noći. Neadherirane ćelije su isprane i 1 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) koji sadrži DMEM dodat je na ploču i inkubiran 3 h prije tretmana Linkedinom. Da bi se odredila ekspresija CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 i GAPDH proteina, lizati celih ćelija pripremljeni su od ćelija tretiranih preko noći sa Linkedinom (1 i 5 µM) ili nosačem u prisustvu ili odsustvu oxLDL (25 µg/ml). ). Da bi se odredili nivoi ekspresije p-JNK i JNK izazvanih LPS-om, ćelije su prethodno tretirane Linkedinom (5 i 10 µM) tokom 3 h, a zatim stimulisane sa E. coli LPS tokom 30 minuta. Lizati celih ćelija pripremljeni su od dva puta ispranih ćelija (ledeno hladan PBS) korišćenjem RIPA pufera sa dodatkom koktela inhibitora proteaze (Thermo Scientific, MA). Mrlje su ispitane sa zečjim anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Izrael), anti-mišjim CD36 (R&D, Minneapolis, MN), zečjim anti-TLR4, zečjim anti-TLR6, zečjim anti-JNK i zečjim anti-p- JNK primarna antitela (Cell Signaling, Danvers, MA) praćena sekundarnim antitelima konjugovanim protiv zeca i miša sa HRP (R&D, Minneapolis, MN). Mrlje su skinute i ponovo ispitane sa anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) za kontrolu punjenja.
Formiranje pjenastih ćelija.MRM aktiviran tioglikolatom zasijan je na staklenim pokrovima u ploči s 12 jažica sa DMEM, 10 posto FBS i inkubiran na 37 stepeni, 5 posto CO2 2 h. GGT (1 ili 10 µM) je dodat ćelijama, a nakon 3 h inkubacije, dodat je oxLDL (50 µg/ml) i kulture su inkubirane preko noći na 37 stepeni. Nativni LDL (50 ug/ml) je dodat u jažice kontrolne grupe i inkubiran preko noći. Ćelije su fiksirane u 4 posto paraformaldehida, nakon čega je uslijedilo bojenje Oil Red O da se kvantifikuje stvaranje pjenastih ćelija.
Transdukcija vektora adenovirusa.Prikupili smo adenovirusne konstrukte za ekspresiju Ad(RGD)-mišjeg TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) i adenovirusnog praznog vektora, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), od Vector Biolabs, Malvern, PA. Koristili smo 1×108 pfu/ml za sve eksperimente. Za studije stvaranja pjenastih ćelija, peritonealni makrofagi miša su inkubirani sa Ade-TRPV4 ili Ade-Vec u DMEM mediju 72 h prije dodavanja oxLDL-a za stvaranje pjenastih ćelija makrofaga.
Vezivanje i unos volovskog LDL-a.Da bi se procenilo vezivanje, peritonealni makrofagi su tretirani sa dve doze (1 ili 10 µM) Linkedina ili vehikuluma tokom 3 sata i inkubirani sa DiI-oxLDL na 4 stepena jedan sat. Nakon prethodnog tretmana sa Linkedinom ili vehikulumom, ćelije su inkubirane sa DiI-oxLDL na 37 stepeni tokom 30 minuta da bi se procenila apsorpcija. Slike su snimljene fluorescentnom mikroskopijom (63x), a Slika J je korištena za kvantifikaciju rezultata.
Analiza protočnom citometrijom.Peritonealni makrofagi izazvani tioglikolatom kultivisani su u DMEM, 10% FBS tokom 24 h. Neadherirane ćelije su isprane, dodan je medijum bez seruma i ćelije su inkubirane 2 h, nakon čega je dodat 5 µM GGT ili vehikulum, a inkubacija je nastavljena 3 h. Tretirane ćelije su sastrugane sa ploče i resuspendirane u PBS, 2 posto BSA. Ćelije su inkubirane sa primarnim antitijelima 45 minuta nakon čega je uslijedila 30 minuta inkubacije sa PE-konjugiranim sekundarnim antitijelima. Za prikupljanje podataka korišten je FACSCantoII protočni citometar (BD Bioscience, Ontario, Canada). Svi podaci su obrađeni pomoću softvera FlowJo.
qRT‑PCR.Makrofagi izazvani tioglikolatom tretirani su sa 5 µM Linkedinom ili vehikulumom tokom 3 h; 25 µg/ml oxLDL dodano je u nosač ili ćelije tretirane Linkedinom, a inkubacija je nastavljena preko noći. RNeasy Micro Kit (#74,004) iz QIAGEN-a je korišten za ekstrakciju ukupne RNK, a Univerzalni SYBR Green One-Step Kit iz Bio-Rad-a korišten je za reverznu transkripciju RNK. Za prikupljanje podataka korišten je C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Ekspresija gena je određena kao količina gen-specifične mRNA u odnosu na GAPDH mRNA korištenjem komparativne CT metode opisane u biltenu za korisnike Bio-Rad qRT-PCR sistema.
Statistička analiza.Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost±SEM bioloških trilikata. Korišten je softver GraphPad Prism 7.0, a proračuni su rađeni korištenjem Studentovog t-testa za dvije grupe ili jednosmjerne ANOVA za više grupa.
Etičko odobrenje.Svi eksperimenti na miševima provedeni su u skladu sa smjernicama Institucionalnog odbora za brigu o životinjama (IACUC) i odobreni su od strane Odbora za reviziju Parka Univerziteta Maryland-College.
Rezultati in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>trostruko; str<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">
Slika 1. Identifikacija Linkedina kao novog inhibitora TRPV4 iz biblioteke prirodnih jedinjenja zasnovana na polu-visokom propusnom skriningu. (A) Dijagram toka koji pokazuje tok rada koji rezultira identifikacijom ginketina kao potencijalnog inhibitora TRPV4 iz biblioteke od 2000 prirodnih jedinjenja. (B) Reprezentativni snimak FlexStation 3 koji pokazuje inhibitorni efekat 6 prirodnih jedinjenja na TRPV4 agonist (GSK1016790A) induciran Ca2 plus priliv u BMDM napunjene kalcijumom 6 bojama tokom sekundarnog skrininga. Predtretman sa svih 6 jedinjenja pokazao je inhibitorne efekte na TRPV4-zavisan Ca2 plus priliv u poređenju sa ćelijama prethodno tretiranim nosačem (negativna kontrola; vehikul plus GSK1016790A (10 nM)) ili kalcijum jonoforom (A23187, 2 μM). Koristili smo selektivni antagonist TRPV4, GSK2193874 (10 nM), kao negativnu kontrolu. Svi eksperimenti su ponovljeni tri puta u četiri primjerka. RFU: jedinica relativne fluorescencije.
Inhibicija TRPV4 GGT-om poništava formiranje pjenastih ćelija makrofaga izazvano oksLDL.Naše prethodne studije su pokazale da je TRPV4-izazvao Ca2 plus priliv uključen u formiranje pjenastih ćelija posredovano oxLDL 14,16. Stoga smo procijenili mogućnost da je stvaranje pjenastih ćelija inhibirano antagonizacijom aktivnosti TRPV4 posredovanom GGT. Mišji peritonealni makrofagi divljeg tipa inkubirani su sa oxLDL kako bi se inducirala formiranje pjenastih ćelija u prisustvu ili odsustvu GGT-a, i analizirani bojenjem Oil Red O. Kao što se i očekivalo, otkrili smo da je stvaranje pjenastih ćelija povećano za pet puta u makrofagima tretiranim oxLDL u odnosu na nativni LDL (slika 2A, B). Međutim, tretman makrofaga sa GGT (1 ili 10 µM) prije stimulacije oxLDL značajno je smanjio postotak pjenastih ćelija (Slika 2A, B). Zajedno, ovi nalazi upućuju na inhibitorni efekat GGT-a na formiranje pjenastih ćelija makrofaga koje je moguće ciljano na TRPV4-izazvao Ca2 plus priliv. Nadalje, prekomjerno smo eksprimirali TRPV4 u TRPV4 nul makrofagima korištenjem adenovirusnog konstrukta, a zatim inducirali stvaranje pjenastih ćelija korištenjem oxLDL u prisustvu GGT. Otkrili smo da prekomjerna ekspresija TRPV4 povećava stvaranje pjenastih ćelija koje je bilo blokirano kada smo prethodno tretirali ćeliju GGT-om, sugerirajući da je inhibicija stvaranja proaterogenih pjenastih ćelija od strane GGT-a ovisna o TRPV4 (Slika 2C, D).
GGT ne blokira bazalni nivo ekspresije TRPV4 i inflamatornih receptora.Receptor za čišćenje CD36 igra glavnu ulogu u preuzimanju i vezivanju oxLDL i formiranju pjenastih ćelija, kritičnim procesima u aterosklerozi4–7,54,55. Nedavno je sve veći broj dokaza koji sugeriraju uključenost receptora sličnih naplati u aterosklerozi2,4,56. Da bismo istražili da li je GGT blokirao stvaranje pjenastih ćelija utječući na ekspresiju CD36, TLR4, TLR6 i TRPV4, izvršili smo imunoblot analizu na dvije koncentracije GGT (1 ili 5 µM). Pronašli smo slične nivoe ekspresije CD36, TRPV4, TLR6 i TLR4 u poređenju sa netretiranom kontrolom (sl. 3A-D). Protočna citometrijska analiza takođe nije otkrila značajnu razliku u ekspresiji proteina na površini ćelije sa ili bez GGT tretmana (sl. 3E–H, I–L). Uzimajući sve zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GGT blokira stvaranje pjenastih ćelija makrofaga bez inhibicije bazalnih nivoa površinske ekspresije TRPV4, CD36, TLR4 i TLR6.
Slika 2. Inhibicija TRPV4 Linkedinom poništava formiranje pjenastih ćelija makrofaga izazvano oksLDL. (A) Tioglikolatom inducirani mišji peritonealni makrofagi tretirani su preko noći sa 50 µg/ml oxLDL-a, nakon čega je uslijedila 3 h predinkubacija s nosačem ili 1 ili 10 µM Linkedinom. Ćelije su tretirane sa 50 µg/mL nativnog LDL (VLDL) kao kontrola. Originalno uvećanje: 40x. (B) Kvantifikacija rezultata je prikazana u (A). n=500 ćelija/uslov. Studentov t-test; ***str<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>
Unošenje oxLDL, ali ne vezanje makrofaga je potisnuto od strane GGT. Budući da je ranije pokazano da TRPV4 ima ulogu u preuzimanju oxLDL i formiranju pjenastih ćelija14,16, procijenili smo da li tretman s GGT uzrokuje oštećenje vezivanja oxLDL na površini makrofaga. WT peritonealni makrofagi tretirani su GGT prije inkubacije sa DiI-oxLDL na 4 stepena i procijenjeno je vezivanje. Rezultati pokazuju da vezivanje oxLDL-a na površini makrofaga nije značajno otežano tretmanom GGT (1 ili 10 µM) u poređenju sa kontrolom nosača (Slika 5A-C). Nakon što smo ustanovili da GGT ne inhibira vezivanje oxLDL-a, zatim smo nastojali utvrditi da li je uzimanje oxLDL-a u makrofagima poremećeno liječenjem GGT-om. Zanimljivo je da su naši rezultati pokazali da postoji značajna inhibicija u preuzimanju oxLDL u makrofagima u GGT prethodno tretiranim ćelijama u poređenju sa grupom koja je tretirana nosačem (Slika 6A, B). Uzimajući sve zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GGT blokira unos oxLDL-a, ali ne i vezivanje, u makrofagima.
GGT blokira ekspresiju TRPV4 izazvanu oxLDL u makrofagima.
Kako su naše prethodno objavljene studije pokazale da TRPV4-izaziva Ca2 plus igra ulogu u formiranju pjenastih ćelija makrofaga posredovane oxLDL14,16, pokušali smo utvrditi da li GGT blokira stvaranje pjenastih ćelija supresijom ekspresije CD36 izazvane oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 ili TRPV4. Otkrili smo da je stimulacija makrofaga preko noći sa oxLDL rezultirala značajnom pojačanom regulacijom ekspresije TRPV4 proteina u odnosu na LDL, dok je ekspresija drugih receptora (CD36, TLR2, TLR4 i TLR6) ostala nepromijenjena (slike 4A-F). Predtretman ćelija sa GGT pre stimulacije sa oxLDL selektivno je smanjio nivo ekspresije TRPV4 proteina u poređenju sa tretmanom nosačem (Slika 4A-F). Zajedno, ovi nalazi upućuju na inhibitorni efekat GGT na ekspresiju proteina TRPV4, koji može biti dijelom uključen u supresiju formiranja pjenastih ćelija od strane GGT.
Slika 3. Tretman Linkedinom ne mijenja ukupni protein ili površinsku ekspresiju TRPV4, CD36 i TLR u makrofagima. (A–D) Imunoblotovi lizata celih ćelija makrofaga nakon tretmana preko noći sa 1 ili 5 µM Linkedinom ili vehikulumom. Reprezentativni imunoblotovi pokazuju ukupnu ekspresiju proteina CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) i TLR4 (D) u ćelijama tretiranim i netretiranim Linkedinom. Izvedene su tri nezavisne biološke replike i 3 eksperimentalna ponavljanja za svaki skup eksperimenata. (E–H) Protočna citometrijska analiza makrofaga tretiranih preko noći sa 5 µM Linkedinom ili netretiranih pokazuje površinsku ekspresiju TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) i TLR6 (G) u netretiranim i Linkedin-tretiranim ćelijama. Analizirane su tri nezavisne biološke replike i 30,000 ćelija po stanju. (I–L) Kvantitativna analiza rezultata iz (E–H). Analizirano dvostranim t-testom sa 99 posto intervala povjerenja. Broj ćelija po eksperimentu, 30,000; dva eksperimentalna ponavljanja.
GGT blokira proaterogenu aktivaciju JNK2 i upalu u makrofagima. Objavljeni izvještaji iz naše laboratorije i drugih pokazali su da aktivacija JNK2 igra ključnu ulogu u stvaranju pjenastih ćelija i aterosklerozi7,57. Da bi se utvrdilo može li GGT inhibirati aktivaciju JNK1/2, makrofagi su tretirani GGT nakon čega je uslijedila stimulacija sa LPS ili oxLDL. Rezultati imunoblot analize su pokazali da tretman sa GGT značajno potiskuje fosforilaciju JNK1/2 izazvanu oxLDL ili LPS u poređenju sa netretiranom ili nativnom kontrolom tretiranom LDL (Slika 7A-D). Pokazalo se da JNK aktivacija u makrofagima inducira transkripciju proinflamatornih medijatora povezanih s aterosklerozom58-60. Da bi se utvrdilo može li GGT potencijalno blokirati ekspresiju ovih proinflamatornih regulatora u makrofagima, GGT-tretirane ćelije su stimulirane s oxLDL, a nivoi ekspresije mRNA TNF, IL 6, IL12, IL1 i MCP1 su kvantificirani qRT-PCR analizom. Otkrili smo značajnu smanjenje regulacije u nivoima ekspresije TNF, IL12, IL1 i MCP1 mRNA izazvane oxLDL u ćelijama tretiranim GGT u poređenju sa kontrolama tretiranim nosačem (Slika 7E-I). Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GGT blokira proaterogenu aktivaciju JNK2 i ekspresiju inflamatornih gena kao odgovor na stimulaciju oxLDL u makrofagima. Diskusija Poznato je da prirodni spojevi kao što su flavonoidi i polifenoli moduliraju kardiovaskularne odgovore putem različitih mehanizama, kao što su inhibicija proinflamatornih signala, senzibilizacija na inzulin, oksidativni status i poboljšanje profila lipida u krvi40–45. Ovdje izvještavamo o identifikaciji i funkcionalnoj karakterizaciji Linkedina, flavona, kao novog inhibitora TRPV4-zavisnih proterogenih/upalnih procesa u makrofagima, zasnovanu na polu-visokom propusnom skriningu. Posebno smo pokazali da i) ginketin blokira TRPV4-posredovan Ca2 plus dotok u makrofage, ii) blokada funkcije TRPV4 ginketinom značajno smanjuje formiranje pjenastih ćelija izazvano oxLDL supresijom preuzimanja oxLDL u makrofagima, i iinge blokovi) LPS- i oxLDL-indukovana fosforilacija JNK1/2, ekspresija TRPV4 proteina i ekspresija inflamatornih gena. Sve u svemu, rezultati naše studije su pokazali da ginketin inhibira proaterogenu/inflamatornu funkciju makrofaga na TRPV4-zavisan način. Ateroskleroza, bolest aorte, u početku je podstaknuta upalom i nagomilavanjem makrofaga s oxLDL, izazivajući stvaranje pjenastih ćelija makrofaga, koje kasnije napreduju u aterom2-10. Budući da je formiranje pjenastih stanica kritičan proces u aterogenezi, razumijevanje i manipuliranje formiranjem pjenastih stanica može imati terapeutski potencijal. Poznato je da makrofagi eksprimiraju niz jonskih kanala i pumpi koje prodiru u membranu, uključujući TRPV4, mehanosenzitivni polimodalni Ca2 plus permeabilni jonski kanal, koji se aktivira i fizičkim i biohemijskim stimulansima11-24. Objavljene studije naše laboratorije i drugih identificirale su ulogu TRPV4 u upali makrofaga i formiranju pjenastih ćelija izazvanih oxLDL14–16,26. TRPV4 stoga može poslužiti kao održiva meta za slabljenje proaterogenih procesa.
Slika 5. Linkedin ne potiskuje vezivanje DiI-oxLDL za makrofage. Makrofagi su prethodno tretirani nosačem ili Linkedinom (1 ili 10 µM) tokom 3 h, nakon čega je uslijedila inkubacija sa DiI-obilježenim oxLDL (2,5 µg/mL) tokom 1 h na 4 stepena. (A) Reprezentativne fluorescentne mikroskopske slike (originalno povećanje, 63×) vezivanja DiI-oxLDL na površini membrane makrofaga (n=20 ćelija/stanje). (B) Rezultati eksperimenta A prikazani kao profil dijagrama pomoću softvera NIH ImageJ. (C) Kvantitativna analiza rezultata iz A. n=20 ćelija/stanja. u poboljšanju ateroskleroze smanjenjem MMP-2 i MMP-9 i povećanjem nivoa NO i NOS u torakalnim aortama pacova52. U ovoj studiji, pokazali smo da ginketin blokira TRPV4-izazvao Ca2 plus priliv u makrofage. Mehanički, pokazali smo da ginketin blokira unos oxLDL-a, ali ne i vezivanje, u makrofagima. Studije obavljene in vivo i in vitro sugerirale su kritičnu ulogu CD36 kao glavnog receptora hvatača u preuzimanju oxLDL i formiranju pjenastih ćelija makrofaga2–7. Pokazalo se da su CD36 nulti miševi koji nemaju ApoE ili LDLR manje skloni razvoju aterosklerotskih lezija5,6. Prethodne studije naše grupe identifikovale su suštinsku ulogu CD36-JNK signalne kaskade u formiranju pjenastih ćelija makrofaga7. Toll-like receptori TLR2, TLR4 i TLR6 djeluju kao koreceptori u interakciji sa CD36 i pokazalo se da su uključeni u aterogenezu2,56,63. Ispitivali smo mogućnost da je nedostatak formiranja pjenastih ćelija uočen kod makrofaga tretiranih Linkedinom bio posljedica smanjene ekspresije CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 ili TLR6 proteina. Zanimljivo je da tretman Linkedinom nije značajno smanjio ekspresiju CD36, TLR2, TLR4 ili TLR6 proteina na bazalnim nivoima ili pod uslovima stimulisanim oxLDL. Međutim, Linkedin je specifično blokirao pojačanu regulaciju ekspresije TRPV4 proteina izazvanu oxLDL, dok je njegova ekspresija na bazalnim razinama ostala nepromijenjena. Uzimajući sve zajedno, ovi rezultati sugeriraju da ginketin blokira formiranje pjenastih ćelija izazvano oxLDL putem mehanizma neovisnog o ekspresiji CD36 i TLR, ali ovisi o TRPV4. Prethodne studije naše grupe i drugih su pokazale da je aktivacija JNK2 uključena u formiranje pjenastih ćelija i razvoj aterosklerotskih lezija7,57. Takođe je objavljeno da je JNK uključen u modulaciju MMP-9 i MMP-13, koji su prekomerno izraženi u aterosklerotskim lezijama64–68. S obzirom na prepoznatu vezu JNK u aterogenim procesima, željeli smo utvrditi može li ginketin inhibirati aktivaciju JNK. U skladu sa prethodnim izveštajima, naši rezultati su takođe pokazali da ginketin blokira fosforilaciju JNK2 u makrofagima izazvanu upalnim stimulansima. Ovaj rezultat sugerira mogući mehanizam kojim Linkedin blokira stvaranje pjenastih ćelija. Nadalje, otkrili smo značajno smanjenje regulacije u ekspresiji TNF, IL12, IL1 i MCP1 mRNA izazvanoj oxLDL u stanicama tretiranim ginketinom u usporedbi s kontrolom nosača, naglašavajući potencijalne protuupalne uloge ginketina kao odgovor na oxLDL. Ukratko, naši rezultati su pokazali da ginketin inhibira proaterogenu i inflamatornu funkciju makrofaga na TRPV4-zavisan način. Ovi nalazi stoga jačaju obrazloženje za korištenje prirodnih spojeva u razvoju potencijalnih terapeutika i/ili hemopreventivnih reagensa.
Reference
1. Barquera, S. et al. Globalni pregled epidemiologije aterosklerotske kardiovaskularne bolesti. Arch. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Ćelijska biologija makrofaga u aterosklerozi. Cell 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Inflamacija kod ateroskleroze. Nature 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Citokini, metabolizam lipida makrofaga i pjenaste ćelije: implikacije na terapiju kardiovaskularnih bolesti. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Ciljano narušavanje CD36 receptora čistača klase B štiti od razvoja aterosklerotskih lezija kod miševa. J. Clin. Invest. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Čisti receptori klase AI/II i CD36 su glavni receptori odgovorni za unos modifikovanog lipoproteina niske gustine koji dovodi do opterećenja lipida u makrofagima. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. CD36-zavisna signalna kaskada je neophodna za formiranje pjenastih ćelija makrofaga. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Ateroskleroza-inflamatorna bolest. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Molekularni mehanizmi trombotičkih komplikacija ateroskleroze. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Ateroskleroza. Nature 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Ultra-brza aktivacija TRPV4 jonskih kanala mehaničkim silama primijenjenim na beta1 integrine ćelijske površine. Integer. Biol. (Camb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ signalna osa mehanotransdukcije u krutosti matriksa i TGF 1-indukovanoj epitelno-mezenhimskoj tranziciji. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Prolazni receptorski potencijal vaniloid 4 je neophodan za odgovor stranog tijela i formiranje džinovskih ćelija. Am. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. TRPV4 kalcijum-permeabilni kanal je novi regulator formiranja oksidiranih LDL-indukovanih pjenastih ćelija makrofaga. Slobodni Radic. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).
