HPLC otisak prsta i odnos spektra i antitumorskog efekta za diskriminaciju između Mylabris Phalerata Pallas i Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Farmaceutski fakultet, Medicinski univerzitet Zunyi, Zunyi, Kina,

2 Ključna laboratorija za osnovnu farmakologiju Ministarstva obrazovanja i Zajednička međunarodna istraživačka laboratorija za etnomedicinu Ministarstva obrazovanja, Medicinski univerzitet Zunyi, Zunyi, Guizhou, Kina.

3 Škola osnovnih medicinskih nauka, Medicinski univerzitet Zunyi, Zunyi, Kina, 4 Guizhou Provincial College-bazirana Ključna laboratorija za prevenciju tumora i liječenje karakterističnim lijekovima, Zunyi Medical University, Zunyi, Kina.

Kliknite ovdje da biste dobili više informacija o Cistanche antitumoru

Highlights

Ova studija pruža primenljivu, verodostojnu i efikasniju HPLC metodu za razlikovanje dve vrste Mylabris. I, HPLC otisak prsta i spektar-antitumorski efektisu integrisani i pronađena su tri važna diferencijalna markera za novi marker Mylabrisa.

Abstract

Cilj: Procjena diskriminacije između dvije vrste Mylabris na osnovu HPLC otiska prsta i spektra-antitumorski efekatodnos. Metode: U ovoj studiji, jednostavna i efikasna metoda tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) koja se integriše sa kemometrijskom analizom i spektrom-antitumorski efekatRazvijen je odnos za diskriminaciju između dvije vrste Mylabrisa: Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Rezultati: U analizi otiska prsta odabrano je 14 karakterističnih pikova za procjenu razlika između MP i MC pomoću analize sličnosti i prepoznavanja uzoraka pomoću PCA i OPLS-DA. HPLC hromatogrami uzoraka iz 10 regiona Kine pokazali su razlike između MP i MC, a pronađeno je 7 karakterističnih hemijskih markera. U spektru-antitumorski efekatanaliza odnosa, 4 markera aktivnosti igrala su vitalnu ulogu u smanjenju IC50 i mogli bi biti antitumorske komponente Mylabrisa sivom relacijskom analizom i multivarijantnom linearnom regresijskom analizom. Hemometrijska analiza u kombinaciji sa rezultatima odnosa spektra i efekta pokazala je da su pikovi 2 (citozin), 4 (nepoznato) i 14 (nepoznato) važni diferencijalni markeri za razlikovanje dvije vrste Mylabrisa.

Zaključak: Metoda je primjenjiva, vjerodostojna i efikasnija za diskriminaciju MP i MC, te će ponuditi novi način za olakšavanje kontrole kvaliteta lijekova protiv insekata.

Ključne riječi: HPLC, otisak prsta, spektrum-antitumorski efekat, Mylabris, Discrimination

Pozadina

Mylabris, nazvan ban mao u Kini, koristi se kao tradicionalna kineska medicina (TCM) za liječenje furunclea, duboko ukorijenjenih čireva, abdominalne mase i važan jeantitumoragent. Osim toga, u Europi se široko koristi kao narodna medicina [1]. Glavni aktivni sastojak Mylabrisa je kantaridin, koji je efikasanantitumorspoj [2]. Savremene farmakološke studije su pokazale da Mylabris ima višestruku aktivnost, te je visoko cijenjen u liječenju tumora zbog svoje dvostrukeprotiv rakasvojstva i sposobnost povećanja broja leukocita [3-4]. Trenutno se Mylabris naširoko koristi u nekim kliničkim receptima za TCM protiv karcinoma u Kini, kao što su Aidi injekcije i Compound ban mao kapsule.

Prema Farmakopeji Narodne Republike Kine (verzija iz 2015.), Mylabris je definiran kao osušeno tijelo Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC), koji se razlikuju po svojim botaničkim karakteristikama, dinamici populacije i ekologiji [ 5-6]. Mylabris je također vrlo toksičan lijek. Budući da su lijekovi dostupni u Kini obično mješavina MP i MC, potrebno je identificirati kemijske i aktivnosti razlike između ove dvije vrste.

Budući da TCM sadrže brojne poznate i nepoznate sastojke, kvantitativna analiza profila njihovih hemijskih sastojaka predstavlja značajan izazov. Tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) otisak prsta igra važnu ulogu u kontroli kvaliteta (QC) TCM-a zbog njegovih opštih karakteristika profila većine jedinjenja u složenom sistemu. Nadalje, analiza otiska prsta TCM-a ima dobru ponovljivost i stabilnost za autentifikaciju vrsta i ocjenu kvaliteta, a prihvaćena je od Svjetske zdravstvene organizacije, Kineske državne uprave za hranu i lijekove (SFDA) i Europske agencije za procjenu lijekova (EMEA). Nedavno je razvijena kemometrijska analiza koja kombinuje HPLC otiske prstiju za QC i razlikovanje različitih kompleksnih prirodnih izvora [7]. Međutim, neefikasno je razlikovati razlike u TCM-ima jer ne može odražavati razlike u aktivnim sastojcima, što je važnije za kliničku upotrebu. Do sada, spektar-antitumor efekatpristupi odnosa korišteni su za uspješno identificiranje bioaktivnih sastojaka TCM-a [8]. HPLC otisak prsta u kombinaciji sa kemometrijskom analizom i odnosom spektra i antitumorskog efekta bolje će razjasniti razliku višestrukih izvora TCM-a.

Nedavno su objavljene neke metode za određivanje sadržaja kantaridina, koji se mogu koristiti za određivanje kvaliteta Mylabrisa [9]. Neki hromatografski otisci prstiju su također primijenjeni za QC [10-11]. Samo jedna studija je koristila metodu koja uključuje gradijentno eluiranje vodotopivih jedinjenja Mylabrisa na osnovu HPLC. U međuvremenu je korišteno samo deset uzoraka, a nijedan MC uzorak [12]. Koliko nam je poznato, razlikovanje MP i MC na osnovu hemijskog sastava i aktivnosti nije ranije proučavano.

Ova studija imala je za cilj razviti jednostavnu i efikasnu metodu za razlikovanje dvije vrste Mylabrisa pomoću HPLC otiska prsta u kombinaciji s kemometrijskom analizom i spektrom.antitumorefekatodnos, koji će pružiti osnovu za QC Mylabris. Ova metoda se također može primijeniti za identifikaciju QC markera drugih TCM-ova.

materijali i metode

Ukupno, 20 serija Mylabris phalerata Pallas (MP) i Mylabris cichorii Linnaeus (MC) prikupljeno je iz različitih provincija Kine (Tabela 1) i identifikovano od strane našeg profesora Xiao-Fei Li. Uzorci vaučera deponovani su u naše laboratorije.

Referentni standardni citozin, uridin, guanozin i adenozin kupljeni su od ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). HPLC acetonitril i metanol su kupljeni od Thermofisher Scientifica (Fairlawn, NJ, SAD). Watsonova čista voda je korištena tokom čitave studije. Ostale hemikalije i rastvarači bili su analitičkog kvaliteta i dobijeni su od Aladdin Reagent (Šangaj, Kina), Chengdu Kelong Reagent (Chengdu, Kina) i Sinopharm Chemical Reagent (Peking, Kina)

Aparatura i hromatografski uslovi

HPLC analiza je sprovedena korišćenjem Agilent 1260 Infinity HPLC sistema na 30 stepena na Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) za otiske prstiju. Za odvajanje je korišteno eluiranje linearnog gradijenta sa eluentima A (voda/glacijalna sirćetna kiselina, 100:1, v/v) i B (metanol). Program gradijenta je razvijen na sljedeći način: 0-1 min, 3.0-4.6 posto B; 1-9 min, 4.6-6.8 posto B; 9-25 min, 6.8-51.0 posto B; 25-30 min, 51.0-100 posto . Brzina protoka mobilne faze bila je 1,0 mL/min. Kromatogram je praćen na 254 nm. Nakon perioda ekvilibracije od 15 minuta, 10 μL uzoraka je korišteno za injekciju.

Priprema uzorka

Osušeni uzorci su usitnjeni u prah, a 2,5 g svakog praškastog uzorka ekstrahirano je dva puta sa 50 mL 75 posto etanola refluksom svaki put po 1,5 sata. Ekstrahovani uzorak je pomešan i koncentrisan pod sniženim pritiskom do 20 mL. Smeša je zatim istaložena sa 80 mL vode tokom 24 sata na 4 stepena. Nakon toga, ekstrakt je centrifugiran na 3000 g min{11}} 10 minuta da se odvoji supernatant. Supernatant je koncentriran pod sniženim pritiskom na 25 mL. Konačno, supernatant je filtriran kroz 0,22 μm Millipore film prije HPLC analize.

Validacija metodologije

HPLC metoda je validirana za preciznost, ponovljivost i stabilnost (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Validacija je procijenjena na osnovu vremena zadržavanja (RT) i površine pika (PA). Konačno, utvrđeni su hemijski otisci prstiju 20 serija Mylabrisa da bi se identifikovale integrisane hemijske karakteristike više jedinjenja. Neke hemometrijske tehnike su uvedene na hemijski otisak prsta za analizu.

Analiza prepoznavanja uzoraka

Razlike između dvije vrste vršnih područja procijenjene su za statističku značajnost korištenjem nesparenog Studentovog t-testa. P-vrijednost manja od 0.05 se smatra statistički značajnom. Kao klasična metoda bez nadzora, analiza glavnih komponenti (PCA) se široko primjenjuje za statističku analizu podataka. Umjesto da koristi mnogo varijabli, PCA uzima mali broj računara bez gubitka mnogo informacija, a grafikoni rezultata se zatim vizualiziraju za slobodno odvajanje opservacija. U ovoj studiji, PCA je sproveden na normalizovanim površinama vrha svake komponente u HPLC otiscima prstiju koristeći SIMCA-P plus 14.0 softver (Umetrics, Umea, Švedska) da bi se pronašla diskriminacija između dve vrste Mylabrisa.

Za poželjniju diskriminaciju između dve vrste Mylabris, primenjena je nadgledana metoda ortogonalne parcijalne diskriminantne analize najmanjih kvadrata (OPLS-DA) za analizu razlika u normalizovanim površinama pikova svake komponente u HPLC otiscima prstiju. VIP vrijednost je ponderisani zbir kvadrata OPLS pondera, koji odražava relativni doprinos svake X varijable modelu. Smatra se da su varijable sa VIP > 1, zajedno sa S-pločom, uticajne za odvajanje uzoraka u grafikonima rezultata generisanih OPLS-DA analizom. Zatim su dobijeni karakteristični hemijski markeri za diskriminaciju.

Analiza odnosa spektra i antitumorskog efekta

Za istraživanjeantitumorpodručje vršnog efekta za uzorke Mylabris integrirane s podacima o otisku prsta i uporedite razlike između dvije vrste, korelaciju između vrha otiska prsta ianti-tumorproučavani su efekti. SPSS19.0 (IBM, SAD) i GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Kina) primijenile su dvije metode koje kombinuju sivu relacionu analizu i multivarijantnu linearnu regresionu analizu (MLRA). Theanti-tumorTest je sproveden prema našim objavljenim metodama [12], ćelije HepG2 ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma su održavane u medijumu RPMI1640 sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma. Ćelije su uzgajane u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2 na 37 C. SRB metoda je korištena za procjenu proliferacije zaanti-tumoraktivnosti, zatim je izračunat IC50 HepG2 ćelija, na kraju, IC50 i normalizovane površine pika su korištene za kemometrijsku analizu. Tada su dobijeni karakteristični markeri aktivnosti Mylabrisa.

Rezultati i diskusija

Optimizacija uslova ekstrakcije

Za dovoljnu ekstrakciju jedinjenja rastvorljivih u vodi iz Mylabrisa, sistem ekstrakcije je optimizovan. Ultrazvuk i refluksiranje su pokazali da se ova jedinjenja mogu optimalno ekstrahovati refluksom.

Optimizacija HPLC metode

Da bi se dobili maksimalni hromatografski pikovi koji opisuju ukupnu karakteristiku biljke, istražen je sastav hromatografske kolone, mobilne faze i talasne dužine detekcije (200, 254, 265 i 278 nm). Rezultati su pokazali da su Phenimenex Synergy Polar-RP80 kolona, ​​voda (koja sadrži 1 posto glacijalne octene kiseline) i metanol i 254 nm bili najbolji uslovi za Mylabris HPLC analizu (slika 1), struktura 4 standardne supstance prikazana je na slici 2. .

Validacija metode

U ovoj studiji, 14 vrhova je bilo dobro odvojeno i korišteno kao "uobičajeni vrhovi". Preciznost, ponovljivost i stabilnost zasnovani su na vremenu zadržavanja (RT) i površini pika (PA). RSD vrednosti RT i PA za preciznost (n=6) nisu prelazile 0.2 i 4 procenta, respektivno; RSD vrednosti RA i PA za ponovljivost (n=6) bile su ispod 0.2 i 4 procenta, respektivno, a RSD vrednosti za stabilnost (0-24 h) bile su manje od { {10}}.4 i 5 procenata, što ukazuje da su uzorci bili stabilni u roku od 24 h. Ovi rezultati su pokazali da su kvalitet proučavanih uzoraka i HPLC metode bili stabilni i dobro kontrolisani.

Procjena sličnosti otiska prsta

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 osim MC uzoraka (iz Guizhou2 i Guizhou4), čije su sličnosti bile 0.888 i 0.887, respektivno. Ovi podaci ukazuju da je kvalitet Mylabrisa unutar jedne vrste bio stabilan. Međutim, sličnosti samo tri MP uzorka u poređenju sa referentnim HPLC otiskom su > 0.930; a sličnosti samo dva MC uzorka u poređenju sa referentnim HPLC otiskom prsta bile su > 0,921. Ovi rezultati su pokazali da su dvije vrste Mylabris bile značajne varijacije u nekim vršnim područjima.

Diskriminacija MP i MC analizom prepoznavanja obrazaca

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, vrhovi 1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14 mogu biti najznačajnije varijable u razlikovanju između ove dvije vrste (Slika 6). Grupa pikova (1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14) može igrati vitalnu ulogu u razlikovanju MP i MC kao karakterističnih hemijskih markera.

Odnos spektra i efekta sivom relacijskom analizom

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Odnos spektra i efekta prema MLRA

MLRA model je najčešća metoda modeliranja za određivanje složenosti odnosa između dvije ili više varijabli i odgovora koji je izgrađen pomoću sljedeće formule

gdje je Y procijenjena vrijednost i predstavlja odgovor; Xn je nezavisna varijabla, b{{0}} je presek, a bn je koeficijent regresije za Xn. U ovoj studiji, MLRA je primijenjen za utvrđivanje odnosa otiska prsta i efikasnosti između vrijednosti vršnih površina u HPLC otiscima prstiju i IC50 anti-HepG2, a zatim pronalaženje mogućih antitumorskih komponenti. Kolineacija podataka pronađena je uobičajenim MLRA modelom, koji nije pogodan za istraživanje korelacije između Y (IC50) i X (PA). PCA MLRA model je korišten za proučavanje odnosa otisaka prstiju i efekta, a prvih šest računara sa kumulativnom stopom doprinosa varijanse: 91,068 posto je odabrano za analizu. Konačno, sljedeća jednačina je uspostavljena prema SPSS izlazu i računarima: IC50=1.115864 plus （ 1,87268PA1- 699.722PA2 plus 25,7138PA{18}}.1528PA4 plus 7,22878PA1- 699. 23}}.2114PA6 plus 2.95283PA7- 15.5305PA8 plus 13.0297PA9 plus 22.5683PA10 - 10.3462PA11 plus 123.762PA12 plus 31.0428PA{72}{0428PA{72}{44}{44}{44} (R je bio 0,682, P <>

Integrirajuća analiza dvije vrste Mylabris

Eksperiment je pokazao da se HPLC otisak prsta može koristiti za odražavanje hemijskih karakteristika Mylabrisa. Algoritmi sličnosti, PCA i OPLS-DA su primijenjeni da se pronađe razlika između MC i MP. Grupa pikova (1, 2, 4, 7, 9, 12 i 14) je definisana kao karakteristični hemijski markeri.

Osim toga, i GRA i MLRA su se pokazale kao zadovoljavajuće metode za dalju diskriminaciju. Integracijom rezultata GRA i MLRA analize, pikovi 2, 4 i 14 kao markeri aktivnosti Mylabrisa trebali bi biti odgovorni za antitumorski efekat, koji može biti osnova farmakodinamičkog materijala za Mylabris.

Važni diferencijalni markeri su definisani za pik sa karakterističnim hemijskim svojstvima i svojstvima markera aktivnosti. Dakle, između MC i MP na HPLC otiscima prstiju nakon analize odnosa spektra i efekta, pikovi 2 (citozin), 4 (nepoznato) i 14 (nepoznato) bili su važni diferencijalni markeri za razlike između MP i MC kao što je prikazano na slici 7.

Zaključak

Konačno, u ovom istraživanju predložena je HPLC metoda za hemijsko otiske prstiju MP i MC. Kombinacijom HPLC otiska prsta, PCA i analize odnosa spektra i efekta kao što su GAS i MLRA, hemijska i farmakološka svojstva dvije bliske vrste Mylabrisa mogu se razlikovati. Ovo je pokazalo da su spojevi iz pikova 2 (citozin), 4 (nepoznato) i 14 (nepoznato) kao važni diferencijalni markeri igrali dominantnu ulogu u razlikovanju MP i MC. Strukturu vrhova 4 i 14 treba identifikovati drugom tehnologijom. Metoda HPLC otiska prsta u kombinaciji sa statističkom, kemometrijskom analizom i analizom odnosa spektra i efekta pokazala se efikasnom u otkrivanju komponenti markera ili za promociju QC-abiljni lekovi.

Reference

1 Wang GS. Medicinska upotreba Mylabrisa u drevnoj Kini i nedavna istraživanja. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, et al. Određivanje sadržaja kantaridina i njegov inhibitorni učinak na HepG2 ćelije humanog hepatoma. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, et al. Acyl-CoA: inhibitorne aktivnosti kolesterola aciltransferaze amida masnih kiselina izolovanih iz Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Dan RM, Harbord M, Forbes A, et al. Kantaridin plikovi: tehnika za ispitivanje prometa leukocita i proizvodnje citokina na mjestima upale kod ljudi. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Studija o preferiranoj hrani odraslih Mylabris phalerata u različitim geografskim populacijama. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Biološke karakteristike meloida i njihovo veštačko hranjenje. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, et al. Kvantitativna analiza u kombinaciji s tehnologijom otiska prsta i kemometrijskom analizom koja se primjenjuje za procjenu šest vrsta divljeg Pariza korištenjem UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, et al. Praćenje i procena konzistencije kvaliteta tableta Compound Bismuth Aluminate jednostavnom metodom otiska prsta sa kvantifikovanim odnosom u kombinaciji sa simultanim određivanjem pet jedinjenja iu korelaciji sa antioksidativnim aktivnostima. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analiza kantaridina u lažnim mjehurićima (Coleoptera: Oedemeridae) mikroekstrakcijom u čvrstoj fazi i plinskom hromatografijom-masenom spektrometrijom. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Studija GC otisaka prstiju Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX i Shi XF. Digitalizovani otisci prstiju Mylabrisa od HPCE. Central South Pharmacy (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX i Wang, Z. Studija o digitalizovanim HPLC otiscima prstiju Mylabrisa. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, et al. Anti-humani hepatocelularni karcinom HepG 2 aktivnost kantaridina koji potiče iz provincije Guizhou i okolnih regija. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.