HPLC određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche Herba

Abstract: Cilj: Uspostavljena je HPLC metoda za određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola. Metode: Ehinakozid je određen HPLC. Razdvajanje je izvedeno na Inertsil ODSSP C18 koloni sa mobilnom fazom koja se sastoji od acetonitrila(A) i 0,4% rastvora fosforne kiseline (B), eluiranjem u gradijentu. Talasna dužina detekcije je postavljena na 333 nm, a temperatura kolone je bila 30 stepeni. Brzina protoka je bila 1,0 mL·min-1, a volumen ubrizgavanja je bio 10 μL. Rezultati: Linearni odnos ehinakozida u opsegu koncentracija od 44,93977-539,2764 ug ·m je bio dobar (r=0.9998). Oporavak je iznosio 94,59%-105,31% (RSD= 2.93%,n=9). Sadržaj ehinakozida u vodenim ekstraktima biljke Cistanche herba iznosio je 15.527,7.347,12.267 mg·g-1

Zaključak: Ustanovljena HPLC metoda sa dobrom ponovljivošću je tačna, jednostavna i izvodljiva. Pogodan je za određivanje ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola.

Ključne riječi: HPLC ; vodeni ekstrakt Cistanche deserticola; Echinacoside; određivanje sadržaja

Cistanche deserticola je tonik koji se obično koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini u kliničkoj praksi i ima reputaciju "pustinjskog ginsenga". Cistanche deserticola uključena u izdanje Kineske farmakopeje iz 2015. je osušena, ljuskava, mesnata stabljika biljke Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma ili Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Tople je prirode, slatkog i slanog ukusa, a pripada meridijanima bubrega i debelog creva. Ima efekte toniziranja janga bubrega, blagotvorno djeluje na esenciju i krv, vlaže crijeva i ublažava zatvor [2].

Pustinjski ginseng

"Shennong Materia Medica Classic" navodi da može "hraniti sredinu, hraniti pet unutrašnjih organa i ojačati jin i hraniti suštinu". Cistanche deserticola uglavnom sadrži feniletanoidne glikozide, iridoide i glikozide, lignane i glikozide, polisaharide, estre i alkaloide [3]. Feniletanol glikozidi su glavne aktivne komponente Cistanche deserticola, među kojima su ehinacea i pored bazena indikatorske komponente za identifikaciju i određivanje sadržaja Cistanche deserticola u kineskoj farmakopeji.

Feniletanol glikozid je glavna aktivna komponenta Cistanche deserticola

Farmakološke studije [4] pokazuju da Cistanche deserticola ima različite farmakološke učinke, kao što su vlaženje crijeva i ublažavanje zatvora, zaštita jetre, otpor osteoporozi, antioksidacija, anti-aging i protiv umora. Vodeni ekstrakt Cistanche deserticola može podstaći kosti morfogenetičkog proteina 2 gena osteoblasta kod pacova, kao i kiselu fosfatazu i osteokalcin otpornu na tartarat u serumu miševa sa ovarijektomijom, kao i Smad1 i Smad5 gene i transformacijske faktore rasta u koštanoj srži, ekspresiji koštane srži, itd. efekat [5-6]. Echinoside može promovirati proliferaciju osteoblasta i promovirati diferencijaciju mezenhimalnih matičnih stanica koštane srži u osteoblaste in vitro [7-9].

Echinoside, glavna hemijska komponenta Cistanche deserticola

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Natural Cistanche Echinacoside

【Zatražite više】 Email: xue122522@foxmail.com /WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Posljednjih godina bilo je mnogo izvještaja o određivanju sadržaja ehinakozida i polizida u alkoholnom ekstraktu Cistanche deserticola i njegovim složenim preparatima [10-12], ali je malo izvještaja o određivanju sadržaja indikatorskih komponenti u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola. U ovoj studiji, tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je korištena za određivanje sadržaja ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola.

1. Materijal

1.1 Aparati

LC-20AT tečna hromatografija visokih performansi, detektor SPD-20A, automatski uzorkivač SIL-20A, kutija za temperaturu u koloni CTO-10ASvp, radna stanica za tečnu hromatografiju LCsolution, Shimadzu Corporation of Japan; MES125P-OCE-DU Elektronska analitička vaga, Sartorius, Njemačka; SHZ-D (III) višenamjenska vakuumska pumpa za cirkulirajuću vodu, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.

1.2RC2BSO25 rotacioni isparivač cirkulacioni sistem, RV10DS96 rotacioni isparivač, IKA, Nemačka; DK-S26 Električno termostatsko vodeno kupatilo, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Mašina za ultra čistu vodu serije UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinski materijali i reagensi

Medicinski materijal za meso Rong, kupljen od Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., serijski broj: 18010011806001, 181001. Osušene, ljuskave, mesnate stabljike biljke Leobaceae Cistanche deserticola, koju je identificirao glavni kineski predsjednik Turdi Hermingi Thiard A. Univerzitet tradicionalne kineske medicine Guangzhou pohranjeni su u sobi za inspekciju lijekova Treće pridružene bolnice Univerziteta tradicionalne kineske medicine Guangzhou; Referentna supstanca ehinozida, sadržaj 89,7%, Kineski institut za kontrolu hrane i lekova, broj serije: 111670-201706; Acetonitril je hromatografski čist (Merck, Njemačka); Metanol i fosforna kiselina su analitički čisti (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Voda je ultra čista voda.

2. Metode i rezultati

2.1 Priprema vodenog ekstrakta iz Cistanche deserticola

Uzmite cistanche prah, dodajte 10 puta veću količinu destilovane vode, zagrijte i refluksirajte da biste ekstrahirali dva puta, svaki put po 1 sat. Filtrirajte, sjedinite filtrat i koristite rotacioni isparivač da koncentrišete filtrat do sadržaja sirovog lijeka od 0,100 g · mL-1. Čuvati na 4 stepena u stanju pripravnosti. 2.2 Uslovi hromatografije i prikladnost sistema Kromatografska kolona: InertsilODS SPC18 kolona (150mm × 4.6mm,5 μm); Mobilna faza: acetonitril (A) - 0.4% rastvor fosforne kiseline (B), gradijent eluiranja: 0~5min, 17% A; 5~25min,20%A; 25~30min,17%A; Talasna dužina detekcije: 333nm; Temperatura kolone: ​​30 stepeni; Brzina protoka: 1.0mL · min-1; Zapremina ubrizgavanja: 10 μL. Pod ovim hromatografskim uslovima, rezolucija između vrhova ehinacee i susednih komponenti je veća od 1,5, a teoretski broj kolona ne bi trebalo da bude manji od 4000 za vrhove ehinacee. Kromatogram je prikazan na slici 1.

Slika 1 HPLC hromatogrami ehinakozida(A) i vodenog ekstrakta Cistanche herba(B)

2.3 Priprema rastvora

2.3.1 Referentno rješenje

Izvagajte odgovarajuću količinu referentne supstance ehinacetina, precizno je izvažite, stavite je u volumetrijsku tikvicu od 10 mL, dodajte metanol da se otopi i učinite da sadrži 898,794 ehinacetina po mililitru μG referentnog rastvora, pohranjenog na 4 stepena za pripravnost.

Echinoside of Cistanche deserticola

2.3.2 Test rješenje

Precizno izmjerite 2,0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, isparite u vodenom kupatilu, otopite u metanolu, dovedite do konstantne zapremine u volumetrijskoj tikvici od 10 mL i dobro protresite . 0.22 μm mikroporoznu membransku filtraciju, tj.

2.4 Istraživanje linearnog odnosa

Precizno izmjerite 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 i 3,00 mL referentne otopine pod 2.3.1 i stavite ih u volumetrijsku tikvicu od 5 mL, dodajte metanol do konstantne zapremine i dobro protresite da dobijete gradijent koncentracije od 44,93187, 44,9387, 44,9387. 359,5176, 449,3970 i 539,2764 μG · mL-1 referentnog rastvora, 0,22 μM Mikroporozna membranska filtracija. Izvršite određivanje prema hromatografskim uslovima u 2.2 i zabeležite površinu pika. Koristeći masenu koncentraciju referentne supstance kao apscisu (X, μ G · mL-1), površina vrha je ordinata (Y), a dobijena je jednačina linearne regresije: Y=13185.0X-32273.0, r=0.9998. Rezultati su pokazali da se echinacea kretala od 474,39 do 47,49. Linearni odnos unutar raspona koncentracija od g · mL-1 je dobar.

2.5 Test preciznosti

Uzmite 539,2764 μG · mL-1 referentnog rastvora, ubrizgajte uzorak kontinuirano 6 puta prema hromatografskim uslovima u 2.2 i zabeležite površinu pika. Rezultati: RSD površine pika ehinacee iznosi 1,81%, što ukazuje na dobru preciznost instrumenta.

2.6 Test stabilnosti

Precizno izmjeriti 2,0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, ispariti do suhog u vodenoj kupelji, otopiti u metanolu, dovesti do konstantne zapremine u odmjernoj tikvici od 10 mL, dobro promućkati, 0,22 μ Filtrirati s mikroporoznom membranom, ubrizgati uzorke za određivanje do 2, 14,2 sati prema 0, 4,2 sata, hromatografski uslovi u 2.2, i zabilježiti površinu pika. Rezultati: RSD površine pika ehinacee iznosio je 1,16%, što ukazuje da je test rastvor imao dobru stabilnost u roku od 24 sata.

2.7 Test ponovljivosti

Precizno izmerite 6 porcija vodenog ekstrakta od 2,0 mL Cistanche deserticola, pripremite 6 porcija rastvora za ispitivanje paralelno prema metodi opisanoj u 2.3.2, ubrizgajte uzorke za određivanje prema hromatografskim uslovima opisanim u 2.2 i zabeležite površinu pika. Rezultati: RSD masene koncentracije ehinacee iznosio je 1,28%, što ukazuje na dobru ponovljivost metode.

Eksperiment sa cistanche deserticola

2.8 Test oporavka dodatkom uzorka

Precizno izmjerite 9 porcija od 1,0 mL vodenog ekstrakta Cistanche deserticola, dodajte 0,8, 1,0 i 1,2 mL referentne otopine (101,552 mg · mL - 1), isparite u vodenom kupatilu, otopite u metanolu i dovedite do zapremine u mL posude za mjerenje; Dobro promućkajte, 0,22 μ Filter sa m mikroporoznom filterskom membranom za pripremu test rastvora visoke, srednje i niske koncentracije. Pripremite 3 dijela svake koncentracije paralelno, izmjerite u skladu sa hromatografskim uslovima u 2.2, zabilježite površinu pika i izračunajte obnavljanje dodatkom uzorka. Rezultati su prikazani u tabeli 1.

2.9 Određivanje sadržaja uzorka

Precizno odmjerite 3 porcije 2,0 mL vodenog ekstrakta iz Cistanche deserticola, isparite do suhog u vodenom kupatilu, otopite u metanolu, dovedite do konstantne zapremine u odmjernoj tikvici od 10 mL, dobro promućkajte, 0,22 μ Filtrirajte mikroporoznom membranom, izmjerite prema hromatografskoj površini, izračunajte sadržaj pe2ak2 i zabilježite u . ehinacea. Rezultati su prikazani u tabeli 2.

Tabela 1: Rezultati testova oporavka ehinakozida

Tabela 2. Rezultati određivanja sadržaja ehinakozida u vodenom ekstraktu Cistanche herba

3. Diskusija

3.1 Metoda pripreme ispitnog artikla

Vodeni ekstrakt Cistanche deserticola sadrži različite hemijske komponente kao što su fenil etanol glikozidi i polisaharidi, koji uzrokuju određene smetnje komponentama koje se ispituju. Ovo istraživanje istraživalo je dvije različite koncentracije otapala, 50% metanola i metanola. Rezultati su pokazali da je efekat razdvajanja pikova u hromatogramu testiranog proizvoda koji je koristio 50% metanol kao rastvarač bio slab između ehinacee i susjednih komponenti. Koristeći metanol kao rastvarač, rezolucija vrha glikozida ehinacee je dobra i nema smetnji od drugih vrhova nečistoća. Stoga je metanol odabran kao rastvarač za testnu otopinu. Koristeći metanol kao rastvarač, vodeni ekstrakt Cistanche deserticola je uparen do suva u vodenom kupatilu. Korištene su dvije metode tretmana: otapanje u metanolu, mućkanje konstantne zapremine i ultrazvučno otapanje metanola (10 min). Rezultati su pokazali da nema značajne razlike između ove dvije metode. Ova metoda je odabrana za pripremu ispitne otopine zbog jednostavnog postupka rastvaranja metanola i mućkanja konstantnog volumena.

Kineska trava cistanche

3.2 Izbor mobilne faze

U ovoj studiji se pominje mobilna faza (metanol-0,1% mravlja kiselina) koja se koristi za određivanje sadržaja Cistanche deserticola u kineskoj farmakopeji (tom I) (2015). Rezultati su pokazali da se vrh glikozida ehinacee proširio i da je došlo do fenomena vodećih rubova, koji može biti povezan sa slabom elucijskom sposobnošću mobilne faze; Pozivajući se na relevantnu literaturu [12-13], acetonitril-0,5% octena kiselina je korištena kao mobilna faza, ali je oblik vrha ehinacee bio loš i postojao je fenomen jalovine. S obzirom na pH vrijednost mobilne faze, kao mobilna faza konačno je korišten acetonitril-0,4% fosforna kiselina. Kao rezultat toga, teoretski broj pikova ehinacee bio je veći od 4000, a rezolucija između vrhova ehinacee i susjednih komponenti bila je veća od 1,5. Oblik vrha je bio simetričan, bez smetnji od strane vrhova nečistoća, a osnovna linija je bila stabilna. Stoga je u ovoj studiji korišćena acetonitril-0,4% - 0.4% fosforna kiselina kao hromatografska mobilna faza za određivanje sadržaja ehinacee. U ovoj studiji, HPLC metoda je korištena za određivanje ehinacee u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola.

Cistanche ekstrakt u prahu

Metoda je jednostavna, tačna i ponovljiva. Pogodan je za određivanje ehinacee u vodenom ekstraktu cistanche deserticola i može se koristiti kao metoda kontrole kvaliteta za vodeni ekstrakt cistanche deserticola. Ovo istraživanje samo je utvrdilo sadržaj ehinacee u vodenom ekstraktu Cistanche deserticola. U budućnosti je planirano da se odredi sadržaj ehinacee u složenom odvaru od Cistanche deserticola kako bi se istražio uticaj različitih faktora na sadržaj ehinacee, dajući referencu za kontrolu kvaliteta odvarka koji sadrži Cistanche deserticola.