Kako transformirajući faktor rasta B1 (TGF 1) utječe na fibrozu bubrega

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Inhibicija signalizacije transformirajućeg faktora rasta b1 u rezidentnim intersticijskim stanicama smanjuje ekspresiju profibrotičnog gena i čuva proizvodnju eritropoetina tijekom eksperimentalne fibroze bubrega kod miševa

Michaela AA Fuchs, Katharina AE Broeker i dr.

Fibroza bubregakarakterizira razvoj miofibroblasta koji potiču iz rezidentnih bubrega i imigrirajućih stanica. Formiranje miofibroblasta i proizvodnja ekstracelularnog matriksa tokom oštećenja bubrega pokreću različiti citokini. među ovima,transformirajući faktor rasta B1(TGF 1) se smatra centralnim okidačem zafibroza bubrega. Pronašli smo visoko regulisanu ekspresiju TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i mRNA TGF receptora 2(TGF-R2) u intersticijskim stanicama bubrega u eksperimentalnimfibroza. Ovdje smo istražili doprinos TGF 1(transformirajući faktor rasta B1) signaliziranje u rezidentnim intersticijskim stanicama bubrega do fibroze organa koristeći modele nefropatije izazvane adeninom i unilateralne okluzije uretera kod miševa. U tu svrhu TGFB1 signalizacija je prekinuta inducibilnom delecijom TGF-R2 gena u intersticijskim ćelijama koje eksprimiraju fibroblast marker receptor faktora rasta-B izveden iz trombocita. Ekspresija profibrotičkih gena je oslabljena do 50 procenata u bubrezima kojima nedostaje TGF-R2 u ćelijama pozitivnim na receptor faktora rasta koji potiče od trombocita-B. Dodatno, delecija TGF-R2 spriječila je smanjenje proizvodnje eritropoetina u bubrezima vezanim za ureter. Značajno je da ekspresija aktina glatkih mišića x kao markera miofibroblasta povezana s fibrozom i depoziti ekstracelularnog kolagena nisu izmijenjeni kod miševa s ciljanom delecijom TGF-R2. Stoga, naši nalazi ukazuju na pojačani učinak TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranje u rezidentnim intersticijskim ćelijama koje doprinose ekspresiji profibrotskih gena i smanjenju proizvodnje eritropoetina, ali ne i razvoju miofibroblasta tokomfibroza bubrega.

Click to Cistanche puder koristi za zdravlje bubrega

Razvoj i napredovanjefibroza bubregaje znak hronične bolesti bubrega. Obično se smatra da je rezultat povećane proizvodnje i taloženja proteina ekstracelularnog matriksa (ECM) poput kolagena, fibronektina ili tenascina. U tokufibroza bubregadovodi do progresivnog pada glomerularne i tubularne funkcije i također ograničava endokrine funkcije bubrega što rezultira nedovoljnom proizvodnjom eritropoetina (EPO) što dovodi do anemije.-y

Među citokinima i signalnim faktorima koji su uključeni u bolest bubrega ifibrozanapredovanje,transformirajući faktor rasta 1(TGF 1) je proučavan u različitim modelima.6.0-1 TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)vezuje se za TGF receptor 2 (TGF-R2). Formiranje heteromernog kompleksa sa TGF receptorom 1 je bitno za intracelularnu aktivaciju SMAD signalne kaskade. i.1-18 U oštećenim bubrezima, povećana ekspresija TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)Prijavljena je mRNA u različitim tipovima ćelija bubrega.1517,19-2lVažna uloga TGF 1 ububregfibrozaje također razgraničeno iz nalaza da primjena egzogenog TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)može izazvatifibroza bubregai da je TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)antitijela mogu oslabiti eksperimentalno induciranofibroza,10.22-24Pored toga, genetska delecija Smad2 ili 3, intracelularnih efektora za TGF -R2, pokazala je pozitivne efekte na razvojfibroza.1,1

Ekspresija TGF-R2 je prijavljena u mnogim tipovima ćelija, čime se ograničava precizna informativna vrednost nalaza dobijenih uz opštu interferenciju globalnog TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizacija. Ovo takođe može objasniti neke od kontroverznih izveštaja poslednjih godina.1.1.2 TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)je također prijavljeno da promovirabubreg fibrozapojačavanjem infiltracije makrofaga, koji se mogu transdiferencirati u miofibroblaste.

Međutim, centralna uloga TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)inbubregfibrozanedavno je osporeno nalazom dabubregfibrozase ne smanjuje blokiranjem TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranje u stanicama koje aktivno proizvode matriksne proteine. Dobro je poznato da je povećana proizvodnja matriksnih proteina uglavnom izvedena iz miofibroblasta, koji se mogu transdiferencirati iz nekoliko tipova ćelija uključujući fibroblaste, monocite, pericite i tubularne i endotelne ćelije.6,10,2-32 Relativni doprinos ovi tipovi ćelija prema populaciji miofibroblasta mogu varirati ovisno o eksperimentalnom modelu. Ipak, rastući konsenzus je da su rezidentni fibroblasti, periciti i ćelije izvedene iz koštane srži glavni prekursori miofibroblasta u bubrezima i doprinosebubregfibrozau sličnom omjeru..102933-35 Rezidentni fibroblasti i periciti eksprimiraju receptor faktora rasta koji potiče od trombocita (PDGFR-) i jedan su od njih,31,36. Nedavna studija takođe ima brojne tipove ćelija u bubrezima. potvrdili su PDGFR-f ćelije kao glavne prekursore za miofibroblaste u ljudskim bubrezima. Ove PDGFR-f ćelije također uključuju sve ćelije bubrega sposobne da proizvode EpO,-9

Bubreg fibrozapovezan je sa smanjenom sposobnošću bubrega da proizvode EPO.-,3,0 Iako razlozi za to nisu bili jasno razjašnjeni, smatra se da transformacija intersticijskih PDGFR- plus ćelija u miofibroblaste ide ruku pod ruku sa gubitkom njihove sposobnosti da proizvode EPO. S obzirom na glavnu ulogu intersticijskih PDGFR-B ćelija kao nativnih proizvođača EPO i kao prekursora miofibroblasta, zanimalo nas je da definišemo ulogu TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signaliziranje u ovoj ćelijskoj populaciji.

U tom cilju, generirali smo model miša sa tamoksifenom inducibilnom delecijom TGF -R2 u PDGFR- plus ćelijama (PDGFR- CeERT7 plus TGF -R2/, u daljem tekstu TGF -R2ko miševi). Nakon brisanja TGF-a(transformirajući faktor rasta)-R2 u PDGFR- plus ćelijama kod odraslih miševa, životinje su proučavane u 2 eksperimentalna modelabubregfibroza: unilateralna okluzija uretera (UUO) i nefropatija izazvana adeninom (AN). Nefropatija izazvana adeninom je model hroničnog oštećenja sa jakim paralelama sa patologijama izazvanim ljudskim kristalima, dok je UUO model akutnog oštećenja mehaničkog stresa.2933,42- Upotreba visoko specifične RNAscope in situ metode hibridizacije omogućila je kolokalizaciju ciljne i markerske mRNA sve do rezolucije jedne ćelije. U ovim patološkim modelima ispitani su efekti delecije TGFB-R2 u PDGFR-f ćelijama na ekspresiju d-aktina (a-SMA) glatkih mišića kao markera za formiranje miofibroblasta. Nadalje, istražili smo profibrotičku ekspresiju gena i depoziciju ECM. Sposobnost bubrega da proizvode EPO u eksperimentalnim stanjimabubreg fibrozaje evaluiran mjerenjem nivoa EPO u plazmi i broja i lokalizacije ćelija koje eksprimiraju EPO mRNA u oštećenim bubrezima.

METODE

Životinje

TGF -R2lo miševi su generirani ukrštanjem PDGFR-cexr2 miševa (tamoksifen-inducibilna ekspresija Cre rekombinaze pod kontrolom PDGFR-promotora; JAX dionica #029684) i mikrofona sa loxP-frankiranim TGF6- R2 aleli (IAX stock #012603) u mješovitoj pozadini C57BJ/6 i 129S1/SvmJ." Za praćenje loze, dvostruki fluorescentni reporter konstruirao je mT/mG(B6129(G)-Gt(ROSA)26Sorm4AcCTB-dromute;. JAX zaliha #007676) uzgajana je u TGF -R2ko miševima. Genotipizacija je izvedena korištenjem prajmera navedenih u Tabeli 1. Littermates negativni na Cre korišteni su kao kontrolne životinje. pristup vodi iz slavine Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja koje je objavio američki Nacionalni institut za zdravlje i odobrio lokalni etički komitet.

Liječenje tamoksifenom

Cre rekombinacija je izazvana ishranom koja je sadržavala 400 mg tamoksifen citrata po kilogramu (A115T00404, Sniff) tokom 4 sedmice nakon čega je slijedio 3-nedeljni period sa standardnom hranom. Ekscizija floksiranog TGF-R2 gena potvrđena je lančanom reakcijom polimeraze,

Nefropatija izazvana adeninom

Indukovano adeninomfibrozageneriran je kod odraslih miševa. Nakon tretmana tamoksifenom i sljedećeg perioda odmora, mužjaci miševa su hranjeni hranom koja je sadržavala adenin (0.2 posto) neprekidno tokom 3 sedmice. Eksperimenti su izvedeni nakon tačno 3 sedmice (3-sedmica adenina).

Hibridizacija in situ putem RNAskopa

Lokalizacija ekspresije mRNA proučavana je pomoću RNAscope Multiplex Fluorescent v2 kita (Advanced Cell Diagnostics ACD) prema uputstvima proizvođača. Bubrezi su perfuzijski fiksirani sa 10 posto neutralnog puferovanog rastvora formalina, dehidrirani u seriji etanola i stavljeni u parafin. Hibridizacijski signali su detektovani na 5- μm tkivnim sedicijama korišćenjem TSA Plus fluorofora Cy3 i Cy5 (PerkinElmer). Rezovi su montirani ProLong Gold antifade nosačem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i pregledani mikroskopom Axio Observer Z1 (Zeiss). Pozitivne i negativne kontrole su rutinski priložene. RNAsape sonde su navedene u tabeli 2

Tabela 1|Prajmer sekvence korištene za genotipizaciju miševa

REZULTATI

TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i TGF(transformirajući faktor rasta)Ekspresija R2 u intersticijskim ćelijama je pojačana tokom eksperimentalne bubrežne bolesti

Lokalizacija ekspresije mRNA TGFB1 i TGFB-R2 u bubrezima u bazalnim uslovima i tokom eksperimentalnogfibrozaizvedena je RNAscope in situ hibridizacijom. U bazalnim uslovima, ekspresija TGFB-R2 mRNA je otkrivena u tubulointersticijskim PDGFR-B ćelijama u svim zonama bubrega iu glomerularnim mezangijalnim ćelijama (Slika 1, levo). TGF-R2 je takođe otkriven u proksimalnim tubulima; ekspresija u ostalim tubularnim segmentima bila je niža (dodatne slike S1 i S2).

Tabela 2|RNAskopske sonde koje se koriste za in situ hibridizaciju

TGFb1(transformirajući faktor rasta B1)mRNA je lokalizirana u intersticijskim PDGFR-bþ ćelijama u svim zonama bubrega i u glomerularnim mezangijalnim ćelijama (Slika 1). Tubuli su bili negativni na TGFb1 mRNA. Ovo implicira PDGFR- plus ćelije kao glavno mjesto ekspresije za TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)u bubregu u bazalnim uslovima.

Tabela 3|Prajmer sekvence koje se koriste za kvantitativnu lančanu reakciju polimeraze

Nakon 3 sedmice na adeninskoj dijeti (AN) ili 5-dan UUO, bubrežni TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i nivoi ekspresije TGF-R2 mRNA su bili snažno povećani kod kontrolnih miševa (Slika 2).

Povećana ekspresija TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)i TGF -R2 nakon što je AN ili UUO lokaliziran RNAskopom. Kolokalizacijom markera specifičnih za tip ćelije, mogli bismo identifikovati tipove ćelija bubrega koji pokazuju pojačanu regulaciju TGF-R2 tokom oštećenja bubrega (Slika 3; Dodatne slike S2 ​​i S3). U AN, ekspresija TGF-R2 mRNA je bila snažno povećana u intersticijskom PDGFR- plus ćelije u fibrotičnim područjima (slika 3a). Oštećeni tubuli sa povišenom ekspresijom TGF-R2 pojavili su se sa spljoštenim epitelom i bili su okruženi PDGFR- plus ćelijama sa jakim TGF-R2 i TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)mRNA signali (Slika 3a i c, strelice; Dodatna slika S2). Tubuli sa povećanim TGF-R2 signalima pokazali su de novo TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)ekspresija mRNA (slika 3c; dodatna slika S3).

U UUO bubrezima, povećani signali za TGF-R2 mRNA otkriveni su u intersticijskim stanicama preostale vanjske medule (slika 3b) i korteksa (dodatna slika S2). Ove PDGFR- plus ćelije su takođe pokazale povećane signale za TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)(Slika 3d).

Ukratko, ovi nalazi sugeriraju snažnu aktivaciju TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizacija između intersticijskih PDGFR- plus ćelija i oštećenih tubula tokom eksperimentalnog oštećenja bubrega.

Slika 1|Bazalna ekspresija mRNA (lijevo) transformirajućeg faktora rasta b receptora 2 (TGFb-R2) i (desno) transformirajućeg faktora rasta b1 (TGFb1) na bubrežnim dijelovima miševa divljeg tipa.

Inducibilna delecija TGF-R2 u PDGFR- plus ćelijama slabi ekspresiju profibrotičnog gena tokom eksperimentalne bolesti bubrega

Za analizu relevantnosti TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizirajući funkciju PDGFR- plus ćelija, ispitali smo odrasle TGF -R2ko miševe. Bazalna ekspresija TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)je nepromijenjen nakon delecije TGF-R2 u intersticijskim stanicama bubrega (Slika 2). Ekspresija TGF-R2 mRNA je značajno smanjena kod nokaut životinja (Slika 2). Rezidualna ekspresija je nastala zbog tubularne ekspresije TGF-R2 (Slika 1). Morfologija bubrega nije se razlikovala kod TGF -R2ko miševa do 8 sedmica nakon delecije TGF -R2.

Uočeno povećanje ekspresije TGF-R2 tokom AN i UUO značajno je smanjeno u TGF-R2ko bubrezima u poređenju sa kontrolnim bubrezima (Slika 2). TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)ekspresija je značajno smanjena tek nakon AN.

Histološka studija fosforiliranog SMAD3 pokazala je smanjenu translokaciju transkripcionog faktora u jezgro a-SMAþ intersticijskih ćelija kod TGFb-R2ko životinja, što ukazuje na poremećenu TGFb1 signalizaciju nakon uspješne delecije TGFb-R2 posredovane Cre (Slika 4).

Slika 2|Transformirajući faktor rasta b1 (TGFb1) i TGFb receptor 2 (TGFb-R2) mRNA obilje u kontrolnim bubrezima i bubrezima s tamoksifenom inducibilnom delecijom TGFb-R2 u pozitivnim stanicama receptora faktora rasta iz trombocita (TGFb-R2ko) u bazalnoj bazi i patoloških stanja.

Inducibilna delecija TGFb-R2 u PDGFR-bD ćelijama slabi ekspresiju profibrotičnog gena tokom eksperimentalne bolesti bubrega

Tokomfibroza, proizvodnja komponenti matriksa je poboljšana, što dovodi do ekstenzivnog taloženja ECM-a i stvaranja ožiljaka. Procijeniti moguću ulogu TGF 1(transformirajući faktor rasta B1)signalizirajući u rezidentnim PDGFR-Bf ćelijama za proizvodnju matriksa, uporedili smo ekspresiju gena fibroznih markera između kontrolnih i TGF-R2ko miševa.

Ishrana adeninom i UUO doveli su do -25-puta povećanja Collal mRNA u kontrolnim bubrezima. Dok je kod bubrega TGF-R2ko povećanje mRNA ovratnika smanjeno za -50 procenata u poređenju sa kontrolama (Slika 5). Hranjenje adeninom i UUO su također doveli do značajnog povećanja mRNA kolagena 3al i fibronektina. Povećanja obe mRNA su takođe značajno oslabljena u TGF-R2ko bubrezima.

KLIKNITE OVDJE ZA DIO Ⅱ

REFERENCE

1. Schimdf C. Duffield JS.Mechanisms offibroza: roke pericita. Curr Opin Nephrol Hoertens.2011:20297-305.

2. Neelisetty S, Aford C Reynalds K, et al. Renalfibrozase ne smanjuje blokiranjem signalizacije transformirajućeg faktora rasta u intersticijskim stanicama koje proizvode matriks. Kidney Int. 201588:503-514.

3. Bülow RD, Boor P. Extracellularmatrix infibroza bubrega: više od obične skele. J Histochem Cytochem. 2019;67643-661.

4. Humphreys BD. Mehanizmi renalne fibroze. Annu Rey PhysioL201880: 309-326.

5. Maxwell PH, Ferguson DJP, Nicholls LG, et al. Intersticijski odgovor na oštećenje bubrega ćelije slične fibroblastima pokazuju fenotipske promjene i imaju smanjen potencijal za ekspresiju gena za eritropoetin. Kidney Int. 1997;52.715-724.

6. Souma T, Yamazaki S, MoriguchiT, et al.Plastičnost stanica koje proizvode eritropoetin bubrega upravljafibroza. J Am Soc Nephrol,2013;24:1599-1616.

7. Babit 儿L, Lin HY.Mechanisms of anemia in CKD.JAm Soc Nephrol. 2012:23:1631-1634.

8. Eschbach JW, Adamson JW. Anemija krajnjeg stadijuma bubrežne bolesti (ESRD). Kidney Int. 1985;28:1-5.

9. Broeker KAE, Fuchs MAA, Schrank J, et al. Različite subpopulacije intersticijskih ćelija bubrega proizvode eritropoetin i faktore koji podržavaju oksigenaciju tkiva kao odgovor na hipoksiju u Vivo.Kidney Int. 2020;98:918-931.

10. Falke LL, Gholizadeh S, Goldschmedinq R et al. Različito porijeklo miofibroblasta – implikacije zafibroza bubrega. Nat Rey Nephrol. 2015;11:233-244.

Napomena: gore navedeno nije potpuna lista referenci