Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite ovdje za informacije o dijelu I (Uvod, materijali i metode )ovog članka.

Kako kineski lijekovi koji tonify bubreg inhibirat dopaminergičke neuron apoptoze?

Shaogang Lin,1 Shuifen Ye,2 Jinmu Huang,1 Yun Tian,3 Yihui Xu,2 Mengqi Wu,2 Jingxia Wang,2 Songying Wu,4 i Jing Cai, M.D., Ph.D.2

MATERIJALI I METODE

Dizajn

In vitro komparativno promatranje serumskog farmakologije.

Vrijeme i podešavanje

Eksperimenti su sprovedeni u Laboratoriji za cytobiology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, China od 2010. do 2011. godine.

Materijale

Životinje

Ukupno 60 muških Wistar štakora, starih 8 sedmica, težak 200–220 g, kupljeno je od SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China (licenca br. SCXK (Hu) 2007-0005). Bili su 20-22°C u Laboratoriju za životinje u Fujian Univerzitetu tradicionalne kineske medicine na 20-22°C sa vlažnošću od 40–60% i olakšicom od 7:00 do 19:00 sati. Hranu je obezbedio Laboratorijski životinjski centar Fujian Univerziteta tradicionalne kineske medicine. Svi eksperimentalni postupci su bili u skladu sa Prijedlozima smjernica za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja, koje je formuliralo Ministarstvo nauke i tehnologije Kine[33].

Cistanca za poboljšanje funkcije bubrega

Drogu

Herba Epimedii, vazdušni dio Epimedium sagittatum Maxim bio je iz provincije Sichuan, Kina; Semen Cuscutae, suho zrelo semenko Cuscuta Chinensis Lam., bilo je iz provincije Shandong, Kina; a Herba Cistanches, chylocaulous of scale list Cistanche deserticola Y.C.Ma, bio je iz Autonomne regije Xinjiang Uygur. Sve lijekove je dao Fujian Pharmaceutical Co., Ltd., Provincija Fujian, Kina. Herba Epimedii, Semen Cuscutae i Herba Cistanches, po 97,2 g, uronjeni su u posudu za dekokciju koja sadrži 1 500 mL destilovane vode, brzo zagrijane, kuhane, održavane na 100°C kako bi se omogućilo aktivnim komponentama lijekova da se rastvore i kondenzuju do 540 mL. Sirova količina droge u otopini lijeka bila je 0,180 g/mL. Otopina je filtrirana, mještena u bocu, zatvorena, sterilizirana, i uskladištena na 4°C. Selegiline, 5 mg × 10 tableta po kitu, kupljen je od Nanjing Sike Pharmaceutical Co., Ltd. (provincija Jiangsu, Kina). Selegilin, 21,6 mg, otopao se u dvostruko destilovanu vodu kako bi se pripremio vodeni rastvor od 540 mL. Koncentracija otopine lijeka je bila 0,04 mg/mL. Otopina lijeka je bila u boci, zatvorena, sterilizirana, i uskladištena na 4°C.

Metode

Priprema seruma koji sadrži lijekove

Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches, A selegiline grupe su intragastrično bile perfuzirane serumom koji sadrži lijekove koji sadrže 0,180 g/ml Herba Epimedii, Semen Cuscutae ili Herba Cistanches, ili 0,04 mg/ml selegilina, dva puta dnevno, u dozi od 0,1 mL/kg, 14 uzastopnih dana. Prazna grupa seruma je administrirana jednakim volumenom destilovane vode. Životinje su bile lišene hrane i vode 12 sati nakon završne administracije. Štakori su anestezisani intraperitonealnom injekcijom sa 0,3 mL/100 g ketamin hidroklorida. Krv je berena iz trbušne aorte i centrifugiran na 1 000 r/min 15 minuta. Supernatant je beren, deaktiviran u vodenoj kupelji na 56°C 30 minuta, filtriran kroz mikroporozno membranu od 0,22 μm, i pohranio na –20 °C.

Priprema 50×Sato-ovog rješenja

Mješavina od 60 mL DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, SAD), 15 mg goveda inzulina (Sigma, St. Louis, MO, USA), 15 mg transferrina (Sigma), 145,8 mg natrij piruvata (Biosharp, Koreja), 12 mg putrescina (Solarbio, Peking, Kina), 25 μL natrij selenit (1 mg/mL, 100 mg/100 mL H2O; Sigma), i 100 μL progesterona (0,315 mg/mL, 15,75 mg/50 mL; Biosharp) je bio podvrgnut ultrazvuku u ledenim kupeljama 1,5 sata, filtriran kroz filter od 0,22 μm, alikvoiran i pohranjen na –20°C.

Cistanche za liječenje funkcije bubrega

Kultura ćelija

Ćelije su semenke u DMEM/F12 dopunjavane sa 5% (v/v) fetusnog seruma goveda (Gibco), 1% (v/v) glutamina (Sigma), 2% (v/v) 50×Satova otopina, i 2% (v/v) penicilina/streptomicina. Ćelije su zatim inkubirane u 5% (v/v) CO2 i održavane pri zasićenim vlažnosti pri 37°C. Ćelije su bile tripsinizirane sa 0,25% (w/v) tripsina i prolaska. Ćelije u logaritamnoj fazi su prikupljene za naknadno eksperimentiranje.

Efekat H2O2 na rast MES23,5 ćelija

Ćelije su zasjenjene u 96 ploča kulture (5 × 105 ćelija/well), inkubovanih sa 50, 100, 150, 200, 300, i 400 μmol/L H2O2 kulturno rješenje (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent Co., Ltd., Shanghai, China) nakon 24 sata za 1, 3, 6, 9, 12, 24 sata, a slijedi MTT (Sigma) 4 sata. Rastvor u zbrstima je odbaиen, a dodano je 150 μL dimetil sulfoksida (Sigma). Kulturna ploča je bila potresena 10 minuta, a apsorpciju uzoraka pri 570 nm određeno je pomoću automatskog čitača mikroplata (EXL800; Biotek, Winooski, VT, USA). Svježe pripremljeno DMEM/F12 rješenje kulture je korišteno kao negativna kontrola. U svakom trenutku postavljena su dva paralelna wellsa. Eksperimenti su sprovedeni u trostrukom.

Utjecaj seruma koji sadrži lijekove u različitim koncentracijama na rast mes23,5 ćelija liječenih H2O2

Ćelije su bile zasivene i izložene serumu koji sadrži lijekove koji sadrže 5, 10, 15, 20, 25, i 30% (v/v) Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches, i selegilin ili prazan serum 24 sata. Ćelije su bile dalje kulturan sa kulturnim rješenjem koje je sadržavalo 100 μmol/L H2O2 3 sata, a nakon toga MTT 4 sata. Tri paralelna wellsa su postavljena u svakoj grupi. Svježe pripremljeno DMEM/F12 rješenje kulture je korišteno kao negativna kontrola. Ćelije kulturane u kulturnom rastvoru koje sadrže 100 μmol/L H2O2 i prazan serum služili su kao grupa modela, a ćelije kulturane samo u praznom serumu služile su kao prazna serumska grupa. Eksperimenti su sprovedeni u trostrukom. Vrijednost upijanja svake grupe izračunata je kao stopa preživljavanja ćelija.

Flow cytometry for FasL, Fas, caspase-3, and Bcl-2 expression in MES23.5 cells

Ćelije su se zasjejale i tretirale kao prije. Ćelije kulturane samo u 100 μmol/L H2O2 smatrane su modelom grupe. FasL antitijela označena sa fikoeriterinom i fasL kontrola izotipa (po 5 μL), dodana su u dvije cijevi (BD, San Jose, CA, SAD), pomiješana u isto vrijeme sa ćelijama, čuvana na sobnoj temperaturi u mraku 15 minuta, centrifugirana na 1 000 r/min 5 minuta nakon dodavanja 2 mL PBS. Supernatant je odbaиen, a жelije su ponovo ubaиane koristeжi PBS od 500 μL. Talasna dužina laserskog uređaja za protoknu cistometriju (Facscalibur; BD) je bio 488 nm. Stopa izraza FasL-pozitivnih ćelija je analizirana i izračunata od strane Cell Quest softvera (BD). Brzina izražavanja Fas-, caspase-3-, i Bcl-2-pozitivnih ćelija je otkrivena istom metodom.

ELISA za sadržaj faktora rasta živaca, neurotrofnog faktora izvedenog u mozgu, i glijalne ćelije izvedene neurotrofnog faktora u ćelijama

Ćelije su se zasjejale i tretirale kao što je prethodno opisano. Supernatant je pobran, a faktor rasta živaca, neurotrofičan faktor izveden iz mozga, i sadržaj neurotrofijskog faktora izvedenog glijnim ćelijama su izmjereni prema uputama proizvođača (BD). Apsorpciju je mjereno na 450 nm pomoću automatskog čitača mikroplata (EXL800; Biotek, Winooski, VT, USA).

Statistička analiza

Rezultati su izraženi kao ± SD. Podaci su analizirani pomoću SPSS 18.0 softvera (SPSS, Chicago, IL, USA). Jednosmjesna analiza varijanse je obavljena, a slijedilo je višestruko poređenje najmanje značajnih testova razlika. Vrijednost P< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Cistanche za funkciju bubrega

Priznanja

Zahvaljujemo se Čenu B, Laboratoriji za neurobiologiju, Kapitalnom medicinskom univerzitetu, što je milostivo obezbjedio MES23.5dopaminergiknervne ćelije.

Fusnote

Funding: This study was supported by the Developmental Fund of Chen Keji Integrative Medicine, No. CKJ2010025 and the Key Foundation of Society Development in Fujian Province, No. 2013Y0059.

Sukob interesa: Nijedna nije proglašena.

Ethical approval: This study received permission from the Animal Ethics Committee of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, China.

(Reviewed by Diwakarla S, Norman C, Cheng HY, Wang JM)

(Edited by Wang LM, Su LL, Li CH, Song LP, Liu WJ, Zhao M)

REFERENCE

[1] Zhang ZX, Roman GC, Hong Z, et al. Parkinsonova bolest u Kini: prevalencija u Pekingu, Xianu i Šangaju. Lancet. 2005;365(9459):595–597. [PubMed] [Google scholar]

[2] He JC, Wang WW. Efekat Tianme Gauteng Yin naapoptozaoddopaminergikneuroni u Parkinsonovom modelu bolesti pacova. Zhongyi Zazhi. 2010;51(11):1024–1027. [Google scholar]

[3] Perier C, Bové J, Vila M. Mitochondria i programirana smrt ćelija kod Parkinsonove bolesti:apoptozai dalje. Antioksid Redox Signal. 2012;16(9):883–895. [PubMed] [Google scholar]

[4] Gallagher DA, Schapira AH. Etiopathogenesis i liječenje Parkinsonove bolesti. Curr Top Med Chem. 2009;9(10):860–868. [PubMed] [Google scholar]

[5] Rangasamy SB, Soderstrom K, Bakay RA, et al. Neurotrofična terapija faktora za Parkinsonovu bolest. Prog Brain Res. 2010;184:237–264. [PubMed] [Google scholar]

[6] Zuccato C, Cattaneo E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google scholar]

[7] Cai DF, Chen XQ, Gao Y. Effect of bushes yangban recept na nigrostriatal funkciju u parkinsonian model pacova nakon dugoročnog liječenja levodopom. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002;22(1):43–46. [PubMed] [Google scholar]

[8] Yang MH, Wang HM, Liu Y. Effect of Bushen Huoxue Decoction na receptor siročadi i tirozin hidroksilazu u mozgu štakora sa Parkinsonovom bolešću. Chin J Integr Med. 2011;17(1):43–47. [PubMed] [Google scholar]

[9] Li SD, Liu Y, Yang MH. Efekti grmlja Huo Xue yin na mozak NF-kB i NE sadržaja u Parkinsonovom modelu bolesti miša. J Tradit Chin Med. 2012;32(1):67–70. [PubMed] [Google scholar]

[10] Tian Y, Cai J, Chen XZ, et al. Zaštitni efekti kineske hranebubregbiljke na neuronima striatalnih neurona u Parkinsonovom modelu bolesti miša. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31(3):440–443. [Google scholar]

[11] Yu H, Li YH, Feng XL, et al. Identifikacija i aktivnost assay tirozin hidroksilaze u MES23.5 ćelijama. Zhongguo Shengwu Huaxue yu Fenzi Shengwu Xuebao. 2004;20(1):95–100. [Google scholar]

[12] Wang XR. Beijing: People's Medical Publishing House; 2007. Toxicology Experimental Methods and Technology. [Google scholar]

[13] Lv SJ. Beijing: China Medical Science Press; 2010. Clinical Immunology Test. [Google Scholar]

[14] Eriksen JL, Wszolek Z, Petrucelli L. Molekularna patogeneza Parkinsonove bolesti. Arch Neurol. 2005;62(3):353–357. [PubMed] [Google scholar]

[15] Christen Y. Oksidativni stres i Alchajmerova bolest. Am J Clin Nutr. 2000;71(2):621S–629S. [PubMed] [Google Scholar]

[16] Blandini F, Armenteros MT, Fancellu R, et al. Neuroprotektivni efekat rasagilina u modelu glodara Parkinsonove bolesti. Exp Neurol. 2004;187(2):455–459. [PubMed] [Google scholar]

[17] Zhang XN, Wang HH, Wang ZQ, et al. Zaštitni učinak icariina naapoptozaprimarno kulturanih pacovnih neurona izazvanih Aâ25-35 peptidom. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixue Ban. 2007;36(3):224–228. [PubMed] [Google scholar]

[18] Wang LH, Bu PC, Bao YM. Neuroprotektivni efekat Cuscuta Chinensis Lam ekstrakta na neuronski različite PC12 ćelije štete izazvane reaktivnim vrstama kisika. Xibao Shengwu Xue Zazhi. 2005;27:69–72. [Google scholar]

[19] Sun SL, Wang B, Peng HS. Inhibicija Dodder ekstrakta u srčani miocitapoptozau starenju miševe. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31:642–644. [Google scholar]

[20] Yang JH, Hu JP, Rena K, et al. Struktura-aktivnost odnosi feniletanoida glycosides u biljkama Cistanche salsa na antioksidativnu aktivnost. Zhong Yao Cai. 2009;32(7):1067–1069. [PubMed] [Google scholar]

[21] Wu Y, Li L, Wen T, et al. Zaštitni učinci ehinakoside na hepatotoksičnost izazvanu ugljikom tetrakloridom kod štakora. Toksikologija. 2007;232(1-2):50–56. [PubMed] [Google scholar]

[22] Cheng SD. Beijing: People's Medical Publishing House; 2006. Parkinsonova bolest. [Google scholar]

[23] Yang T. Beijing: People's Medical Publishing House; 2010. Cell Biology. [Google scholar]

[24] Baba N, Koji T, Itoh M, et al. Recipročna promjena u izrazu Bcl-2 i Bax u hipoglosalnom nukleusu nakon aksotomije kod odraslih štakora: moguće učešće u indukciji smrti neurona ćelija. Brain Res. 1999;827(1-2):122–129. [PubMed] [Google scholar]

[25] Zuccato C, Cattaneo E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google scholar]

[26] Peterziel H, Unsicker K, Krieglstein K. TGFbeta inducira GDNF responzivnost u neuronima regrutovanju GFRalpha1 na plazma membranu. J Cell Biol. 2002;159(1):157–167. [PMC slobodan članak] [PubMed] [Google scholar]

[27] Hong M, Mukhida K, Mendez I. GDNF terapija za Parkinsonovu bolest. Ekspert Rev Neurother. 2008;8( 7):1125–1139. [PubMed] [Google scholar]

[28] Chaturvedi RK, Shukla S, Seth K, et al. Faktor rasta živaca povećava preživljavanjedopaminergikgraft, spašava nigralne dopaminergičke neurone, i vraća funkcionalne deficite u pacovovom modelu Parkinsonove bolesti. Neurosci Lett. 2006;398(1-2):44–49. [PubMed] [Google scholar]

[29] Kavanagh ET, Loughlin JP, Herbert KR, et al. Funkcionalnost NGF-zaštićenih PC12 ćelija nakon izlaganja 6-hidroksidopaminu. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):890–895. [PubMed] [Google scholar]

[30] Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Neurotrofički faktor izveden od mozga potreban je za uspostavu pravilnog brojadopaminergikneuroni u substantia nigra pars compacta. J Neurosci. 2005;25(26):6251–6259. [PMC slobodan članak] [PubMed] [Google scholar]

[31] Hung SY, Liou HC, Fu WM. Mehanizam djelovanja heme oksigenaze-1 je uključen u poboljšanje neurotroficnog faktora ekspresije. Neurofarmakologija. 2010;58(2):321–329. [PubMed] [Google scholar]

[32] Duarte EP, Curcio M, Canzoniero LM, et al. Neurozaštita od strane GDNF-a u ishemičnom mozgu. Faktori rasta. 2012;30(4):242–257. [PubMed] [Google scholar]

[33] Ministarstvo nauke i tehnologije Narodne Republike Kine. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006 Sep 30; [Google scholar]