Kako Cistanche polisaharid smanjuje melanogenezu i smanjuje oksidativni stres?

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Polisaharid Cistanche deserticola inducira melanogenezu u melanocitima i smanjuje oksidativni stres

1Odjel za dermatologiju, Treća bolnica Xiangya, Central South University, Changsha, Kina

2Odjel za urologiju, Treća bolnica Xiangya, Central South University, Changsha, Kina

3Medicinski eksperimentalni centar, Treća bolnica Xiangya, Central South University, Changsha, Kina

Cistanchedeserticolaima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

Abstract: Kao glavni dio poremećaja pigmentacije, bolesti depigmentacije kože kao što su vitiligo i ahromični nevus su vrlo česte i sada dobijaju više pažnje. Patogeneza depigmentacije uključuje disfunkciju i gubitak melanocita, što je moguće uzrokovano naslijeđem, autoimunošću i oksidativnim stresom. Među njima,oksidativni stresigra ključnu ulogu; međutim, nekoliko kliničkih tretmana može se nositi s oksidativnim stresom. Kako je objavljeno,Cistanchedeserticola polisaharida(CDP) je efikasan antioksidans; na osnovu toga smo procijenili njegovu ulogu u melanocitima i dalje otkrili mehanizme. U ovoj studiji smo otkrili da CDP može promovirati melanogenezu u ljudskim epidermalnim melanocitima (HEM) i ćelijama mišjeg melanoma B16F10, a također je inducirao pigmentaciju kod zebrica. Nadalje, CDP bi mogao aktivirati signalni put protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK), a zatim regulirati ekspresiju faktora transkripcije povezanog s mikroftalmijom (MITF) i nizvodno gena TYR, TRP1, TRP2 i RAB27A. Inače, otkrili smo da CDP može ublažiti H2O2-indukovanu citotoksičnost i apoptozu u melanocitima. Daljnji dokazi su otkrili da CDP može poboljšati antioksidativni put NRF2/HO-1 i ukloniti intracelularni ROS. Ukratko, CDP može promovirati melanogenezu i spriječiti melanocite od oštećenja oksidativnim stresom, što sugerira da CDP pomaže u održavanju normalnog statusa melanocita. Stoga, CDP može biti novi lijek za liječenje bolesti depigmentacije.

KLJUČNE RIJEČI:

Cistanche deserticola polisaharida, bolest depigmentacije, melanociti, melanogeneza, NRF2,oksidativni stres

1. UVOD

Bolesti depigmentacije kože, kao što su vitiligo i ahromični nevus, karakteriziraju se mrljavom ili opsežnom depigmentacijom kože.1 Iako lezije kože rijetko uzrokuju teške fizičke ozljede, one utječu na izgled pacijenta i stvaraju ozbiljno psihičko opterećenje, čak i poremećaje mentalnog zdravlja.2 glavne patološke promjene u depigmentaciji uključuju disfunkciju i gubitak melanocita, što uvelike utječe na sintezu i transport melanina3, što dovodi do nedovoljne akumulacije melanina u koži.

Mehanizmi uključeni u depigmentaciju trenutno su nepoznati, ali studije su identificirale neke povezane faktore. S jedne strane, funkcija melanocita dijelom ovisi o faktoru transkripcije povezanom s mikroftalmijom (MITF), koji je dobro poznat po promoviranju ekspresije gena povezanih s melanogenezom, uključujući tirozinazu (TYR), protein 1 povezan s tirozinazom (TRP1), tirozinazu povezan protein 2 (TRP2), ras-srodni protein Rab-27a (RAB27A) i fascin actin-bunding protein 1 (FSCN1).4 Među ovim genima, TYR igra ključnu ulogu u sintezi melanina putem oksidacije l-dope u dopakinon.5 S druge strane, studije sugeriraju kombinaciju nekoliko faktora koji mogu biti odgovorni za gubitak melanocita, uključujući naslijeđe, okruženje, autoimunost i oksidativni stres.{17}} Među ovim faktorima, oksidativni stres se smatra najvažnijim .

Mehanizmi odoksidativni stresuzrok depigmentacije djelomično su otkriveni; Preopterećenje reaktivnim kiseonikom (ROS) je jedan od ključnih faktora.10 Preopterećenje ROS-om u depigmentaciji uključuje neravnotežu između pro- i antioksidativnih sistema.11 Jedan od elemenata koji učestvuju u ovoj neravnoteži je nuklearni faktor eritroidni 2-povezan faktor 2/antioksidativni element odgovora (NRF2/ARE) oštećenje antioksidativnog puta.12 Put se sastoji od NRF2 i antioksidativnih enzima kao što je hem oksigenaza-1 (HMOX-1, HO-1) , katalaza (CAT), glutation peroksidaza 1 (GPX1) i NAD(P)H kinon dehidrogenaza 1 (NQO1).13 Kada su melanociti izloženi prekomjernom ROS, NRF2 se može translocirati u jezgro i vezati se za konzervirani ARE, a zatim promovirati ekspresija antioksidativnih enzima. Međutim, kod nekih bolesti depigmentacije, kao što je vitiligo, poremećeni put antioksidansa NRF2/ARE ne može efikasno da ukloni ROS.14 Kliničke terapije koje se obično koriste u depigmentaciji uključuju lokalne ili sistemske kortikosteroide, inhibitore kalcineurina, uskopojasne ultraljubičaste B (NBU1VB) , 308-nm ekscimerno svjetlo, autologna epidermalna transplantacija i terapija tradicionalne kineske medicine (TCM). Kortikosteroidi i inhibitori kalcineurina mogu smanjiti abnormalnu imunološku aktivaciju,15 dok se fototerapije koriste kao tretmani prve linije; posebno, NBUVB stimuliše proliferaciju melanocita i uništavanje T-ćelija,16 dok 308-nm ekscimerno svjetlo inducira apoptozu T stanica.17 Osim toga, efekti TCM terapija povezani su sa promicanjem melanogeneze.18 U određenoj mjeri, ove metode su korisni za poboljšanje depigmentacije, ali kontrola progresije bolesti ostaje izazov. Neophodno je razvijati nove terapije, posebno za oksidativni stres, koji je ranije bio zanemaren.

Cistanche deserticolapoznat je kao 'pustinjski ginseng'.19 Njegove komponente su korisne kod ozljeda jetre uzrokovanih etanolom i intestinalne inflamatorne hiperplazije; također se može koristiti kao reagens protiv umora, protiv upale i tumora.20-22 Nedavno su Guo et al izvijestili daCistanche deserticola polisaharida(CDP), jedna od njegovih glavnih komponenti, imala je antioksidativnu i hepatoprotektivnu aktivnost20; druge dvije studije identificirale su njegovu ulogu u zaštiti stanica od ozljeda u uvjetima nedostatka/reperfuzije kisika i glukoze i osteoporoze.23,24 Međutim, uloga CDP-a u bolestima depigmentacije nije razjašnjena. Ovdje smo željeli potvrditi da li CDP coksidativni stresmože utjecati na melanogenezu i zaštititi melanocite od oksidativnog stresa.

2.|MATERIJAL I METODE

2.1|Hemikalije i antitijela

Cistanche deserticolapolisaharida(CDP) i l-dopa su kupljeni od Yuanye Biotec (čistoća veća ili jednaka 98 posto; Šangaj, Kina). Vodikov peroksid (H2O2), dimetil sulfoksid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolijum bromid ( MTT) i Annexin V-FITC komplet za detekciju apoptoze kupljeni su od Sigma-Aldrich. 4 posto neutralnog paraformaldehida kupljeno je od Biosharp-a (Hefei, Kina); i komplet za imunofluorescentno bojenje (Alexa Fluor 488) i 2,7-dihlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) kupljeni su od Beyotime Biotec-a (Šangaj, Kina). Fontana-Masson set za bojenje i komplet za ekstrakciju nukleoplazmatskog proteina kupljeni su od Sloarbio (Peking, Kina). Dodatak za rast ljudskih melanocita (HMGS), Dulbecco-ov modifikovani Eagle medijum (DMEM) i medijum 254 kupljeni su od Gibco-a. Fetalni goveđi serum (FBS) je nabavljen od BI (Kibbutz Beit-Haemek, Izrael). Primarna antitela za -aktin, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 i HO-1 su kupljeni od Cell Signaling Technology, primarno antitelo za MITF je kupljeno od St John's Laboratory, primarno antitelo za p-MITF je kupljeno od Affinity Biosciences, primarno antitelo za GAPDH je kupljeno od Bioworlda, a primarno antitelo za TRP1 je kupljeno od EMD Millipore.

2.2| Ćelijska kultura i tretman

Ćelije mišjeg melanoma B16F10 su uzgajane u medijumu DMEM sa dodatkom 10 procenata FBS i 1 procenat mešavine penicilin-streptomicina. Ljudski epidermalni melanociti (HEM) su odvojeni od ljudske kožice (pogledajte našu prethodnu studiju25) i uzgajani u mediju 254 sa dodatkom HMGS, 5 posto FBS i 1 posto mješavine antibiotika penicilin-streptomicin. Sve ćelije su uzgajane u vlažnom inkubatoru na 37 stepeni sa 5 procenata CO2. CDP je otopljen u DMSO i razblažen

sa medijumom prije upotrebe, konačna koncentracija DMSO je bila niža od 0.1 posto. H2O2 je razrijeđen medijumom prije upotrebe.

2.3|Uzgoj i tretman zebrice

Embrioni i podloga zebrice kupljeni su od EzeRinka Biotech. Eksperimentalni protokol je odobrio Etički komitet Univerziteta Central South. Zebrice su uzgajane u 12-pločama na 37 stepeni udaljenim od svjetlosti i tretirane različitim koncentracijama CDP-a. Obrnuti mikroskop je korišten za svakodnevno posmatranje i snimanje melanina u glavama i repovima zebrice. Nakon posmatranja, promijenili smo medij i ponovo dodali CDP. Gustoća melanina u repovima zebrice mjerena je slikom J, a vrijednosti su predstavljene kao integrirane optičke gustoće (IOD).

2.4| Viabilnost ćelije

Vijabilnost ćelija je merena korišćenjem MTT testa. Da bi se ispitala citotoksičnost CDP, HEM i B16F10 ćelije su implantirane u 96-jažice u gustini od 2 × 1{{30}}3 ćelije/jažici i kultivirane do ćelije su bile pričvršćene za ploče. Ćelije su zatim tretirane različitim koncentracijama (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 i 320 ug/mL) CDP-a tokom 24, 48 ili 72 sata. Pre merenja, 20 μL MTT je dodato u svaku jažicu i ploče su inkubirane na 37 stepeni 4 sata. Nakon toga, odbacili smo supernatant i dodali 160 μL DMSO u svaku jažicu da otopimo kristale formazana. Vrijednost apsorbancije na 490 nm izmjerena je multimodnim čitačem ploča (PerkinElmer). Da bi se istražio efekat CDP-a u stanju citotoksičnosti izazvane H2O2-, HEM i B16F10 ćelije su postavljene u ploče sa 96-jažicom pri gustini od 4 × 103 ćelije/jažici. Ćelije su tretirane različitim koncentracijama CDP (0, 20, 40 ili 80 ug/mL) tokom 24 sata, nakon čega smo dodali H2O2 (konačne koncentracije: 500 μm za HEM i 1,0 mm za ćelije B16F10) u svaku jažicu. i inkubirao ćelije još 24 sata. Postavili smo CDP-tretirane i negativne kontrolne (NC) grupe. Koraci otkrivanja su bili isti kao što je prethodno opisano.

2.5|NaOH analiza sadržaja melanina

Ćelije su uzgajane u petrijevim posudama od {{0}} mm i tretirane CDP-om u različitim koncentracijama (0, 20, 40 i 80 ug/mL) tokom 48 sati, zatim digestirane tripsinom i sakupljene u 1. 5-mL epruvete. Ćelije smo isprali dva puta dvostruko destilovanom vodom, resuspendovali ih u 1 mL etanola i vorteksirali da bi se oslobodio melanin. Zatim smo centrifugirali (200 g, 5 minuta) smjesu i odbacili supernatant, dodali 1 mL 10 posto DMSO (razrijeđen sa 1 mm otopinom NaOH) u svaku epruvetu i suspendirali sediment. Inkubirali smo suspenziju u vodenom kupatilu na 80 stepeni 1 sat da se melanin rastvori. Konačno, prenijeli smo 200 μL tečnosti u 96-ploču i koristili multimode čitač ploča za mjerenje vrijednosti apsorpcije na 470 nm.

2.6|Mjerenje aktivnosti tirozinaze

Ćelije su uzgajane u petrijevim posudama od {{0}} mm i tretirane sa CDP prije mjerenja, digestirane tripsinom i sakupljene u epruvete od 1.5-} mL i isprane dva puta fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS ). Premjestili smo 106 ćelija iz svakog uzorka u novu epruvetu i odbacili supernatant nakon centrifugiranja, zatim dodali 1 ml 0.5 posto Tritona X-100 u ćelijsku peletu i pohranili mešavina na 0 stepeni 15 minuta. Nakon toga smo dodali 1 mL l-dopa (1 mm, razrijeđen sa 0.1 M fosfatnim puferom) kao supstrat i pomiješali otopinu, premjestili 200 μL smjese na 96-ploču odmah i izmerio vrednost apsorbancije (A0) na 475 nm pomoću multimodnog čitača ploča, ponavljajući merenje na 10 minuta (A10). Aktivnost tirozinaze je izračunata sa (A10-A0)/105, a rezultati su izraženi u postocima (procentima) u odnosu na negativnu kontrolu.

2.7| Fontana-Masson bojenje melaninom

Ćelije su kultivisane u 12-pločama sa bunarima do postizanja gustine od 50 procenata. Nakon tretmana, ćelije su fiksirane sa 4 posto neutralnog paraformaldehida 30 minuta i isprane destilovanom vodom. Zatim smo u svaku jažicu dodali 500 μL otopine Fontana amonijak-srebro i držali ploče u mraku 16 sati da bi se obojio melanin. Zatim smo pet puta isprali ćelije destilovanom vodom (svaki put 1 minut) i namočili ih u 500 μL hiposulfita 5 minuta; na kraju smo uklonili hiposulfit i ponovo isprali ćelije destilovanom vodom 1 minut. Zatim smo koristili obrnuti mikroskop da posmatramo i snimimo melanine.

2.8|Ekstrakcija RNK i kvantitativna reverzna transkripcija - lančana reakcija polimeraze

Ćelije su uzgajane u 6-pločama s bunarima. Nakon tretmana, ćelije su digestirane tripsinom i sakupljene u epruvete od 1.5-mL. Ćelije smo isprali dva puta sa PBS-om, zatim smo dodali 1 mL pufera za lizu, vorteksirali smjesu i stavili epruvete na led na 5 minuta da se ćelije potpuno liziraju. RNK je ekstrahirana korištenjem kompleta Total RNA (Omega Bio-Tek) i reverzno transkribirana (RT) koristeći ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitativna reverzna transkripcija-polimerazna lančana reakcija (PCR) izvedena je upotrebom KODSYBR qPCR miksa (TOYOBO). Reakcioni volumen RT mješavine bio je 20 μL, dok je reakcioni volumen PCR mješavine bio 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, prajmer F 1 μL, prajmer R 1 μL, dodajte DEPC H2O u 20 μL ). Eksperimenti su izvedeni prema protokolima. Sekvence prajmera su navedene u tabeli S1.

2.9|Ekstrakcija proteina i Western blotting/imunofluorescencija

Ćelije su uzgajane u Petrijevim zdjelicama od 100-mm. Nakon tretmana, ćelije su digestirane tripsinom i sakupljene u epruvete od 1.5-mL. Ćelije smo isprali dva puta sa PBS, zatim smo dodali 500 μL RIPA pufera za lizu (Thermo Fisher) sa dodatkom 1 mm fenilmetilsulfonil fluorida (Thermo Fisher) i 1:100 razblaženog koktela inhibitora fosfataze (Roche). Nukleoplazmatski protein i protein citoplazme su ekstrahovani pomoću kompleta za ekstrakciju nukleoplazmatskog proteina prema protokolu proizvođača. Stavili smo epruvete na led na 30 minuta i vorteksirali ih svakih 5 minuta da potpuno liziraju ćelije. Centrifugirali smo ćelije (200 g, 4 stepena, 15 minuta), premestili supernatant u novu epruvetu i izmerili koncentraciju ukupnog proteina korišćenjem kompleta za analizu BCA proteina (KeyGEN Biotec). Proteine ​​smo kuvali sa puferom za punjenje 5× (Beyotime Biotec, Kina) na 100 stepeni 10 minuta, a zatim ih čuvali na -80 stepeni. Metoda elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (PAGE) korištena je u Western blotingu, a 20 ug proteina svake grupe je odvojeno i prebačeno na poliviniliden fluoridnu membranu. Nakon blokade antigena, inkubirali smo membranu u 1:1000 razrijeđenom primarnom antitelu 16 sati na 4 stepena, zatim smo isprali membranu sa PBST i inkubirali je u 1:10 000 razblaženom fluorescentnom sekundarnom antitelu 1 sat na 37 stepeni. . Intenzitet fluorescencije je detektovan korišćenjem Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Imunofluorescencija je izvedena korišćenjem kompleta za imunofluorescenciju (Alexa Fluor

488) sa razblaženjem primarnog antitela 1:100.

2.10|Merenje apoptoze ćelije

Ćelije su uzgajane u petrijevim posudama od {{0}} mm i tretirane različitim koncentracijama (0, 20, 40 i 80 ug/mL) CDP-a tokom 24 sata, a dodavan je H2O2 ( konačne koncentracije: 500 μm za HEM, 1,0 mm za ćelije B16F10) u svaku jažicu i inkubirano još 24 sata. Također smo uspostavili CDP-tretirane i NC grupe. Nakon tretmana, digestirali smo ćelije tripsinom bez EDTA i sakupili ih u epruvete, zatim smo ćelije isprali dva puta sa PBS i resuspendovali ih u 100 μL PBS. Ćelije su obojene Annexin V-FITC kompletom za detekciju apoptoze u skladu sa protokolom i detektovane protočnom citometrijom (FCM). Za analizu stope apoptoze korišten je softver FlowJo.

2.11| Intracelularno mjerenje ROS

Ćelije su kultivisane u {{0}}pločama i tretirane različitim koncentracijama (0, 20, 40 i 80 ug/mL) CDP tokom 24 sata, u koje smo dodavali H2O2 (konačne koncentracije: 500 μm za HEM,

1.0 mm za B16F10 ćelije) u svaku jažicu, inkubirao ih za drugu

24 sata i postaviti CDP-tretirane i NC grupe. Nakon tretmana, dva puta smo isprali ćelije sa PBS-om da uklonimo sav medijum i FBS, zatim razblažili DCFH-DA sondu na 1:1000 sa medijumom i dodali je u svaku jažicu. Inkubirali smo ćelije na 37 stepeni 30 minuta i isprali ih tri puta sa podlogom bez seruma. Koristili smo an

invertirani fluorescentni mikroskop za promatranje i snimanje fluorescencije, a zatim korišten ImageJ za mjerenje intenziteta fluorescencije.

2.12|Statistika i analiza

Podaci u ovom radu prikazani su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), a statistička analiza je izvršena korištenjem GraphPad Prism (verzija 7.0) ili SPSS (verzija 22.0), a Student's t-test ili jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA) korišten je za višestruka poređenja grupa. Siva vrijednost traka proteina WB standardizirana je sa GAPDH ili -aktinom. Vrijednosti P < .05="" smatrane="" su="" značajnim.="" svi="" eksperimenti="" su="" ponovljeni="" najmanje="" tri="">

3|REZULTATI

3.1|CDP je inducirao melanogenezu u HEM i B16F10 ćelijama

Prije nego što smo započeli, koristili smo MTT test da istražimo potencijalnu citotoksičnost CDP-a na ćelije HEM-a i mišjeg melanoma B16F10. Ćelije su tretirane CDP-om u različitim koncentracijama 24, 48 ili 72 sata. HEM testiranje održivosti je pokazalo da kada su koncentracije bile niže od 320 ug/mL, CDP nije imao uticaja na vitalnost ćelija; međutim, vitalnost se značajno smanjila kako je koncentracija dostigla 320 ug/mL nakon 24, 48 i 72 sata (P < .05;="" slika="" 1a).="" vijabilnost="" ćelija="" b16f10="" takođe="" se="" smanjila="" nakon="" 48="" i="" 72="" sata="" kada="" je="" cdp="" dostigao="" 320="" ug/ml="" (p="">< .01),="" ali="" nije="" primećena="" promena="" pri="" nižim="" koncentracijama="" (slika="" 1b).="" zatim="" smo="" preliminarno="" istražili="" ulogu="" cdp-a="" u="" melanogenezi="" i="" uporedili="" njegove="" efekte="" sa="" efektima="" -melanocit-stimulirajućeg="" hormona="" (-msh;="" koncentracije:="" 20,="" 100="" i="" 400="" nm)="" i="" dmso="" (0,1="" posto)="" u="" hem.="" rezultati="" ispitivanja="" bojenja="" melaninom,="" aktivnosti="" tirozinaze="" i="" sadržaja="" melanina="" sugeriraju="" da="" je="" cdp="" uporediv="" sa="" -msh="" za="" promociju="" melanogeneze,="" dok="" tretman="" sa="" 0,1="" posto="" dmso="" nije="" napravio="" nikakvu="" razliku="" (slika="">

U skladu s tim dodatno smo usavršili naše istraživanje. HEM-ovi su tretirani CDP-om u različitim koncentracijama (20, 40 i 80 ug/mL) tokom 48 sati; obavljeni su testovi bojenja melanina, sadržaja melanina i aktivnosti tirozinaze i svi su pokazali značajno povećanje nakon tretmana CDP-om na način ovisan o koncentraciji koji je dostigao vrhunac u grupi od 80 ug/mL (P < .05,="" slika="" 2a-c)="" .="" zatim="" smo="" izmjerili="" nivoe="" mrna="" i="" proteina="" gena="" povezanih="" s="" melanogenezom="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" i="" fscn1).="" cdp="" je="" značajno="" povećao="" nivoe="" mrna="" tih="" gena="" u="" hem="" (p="">< .05;="" slika="" s2a).="" osim="" toga,="" povećali="" su="" se="" nivoi="" proteina="" mitf,="" tyr,="" trp1="" i="" rab27a,="" kao="" i="" odnos="" fosforiliranog="" mitf-a="" prema="" ukupnom="" mitf-u="" (p="">< .05),="" dok="" trp2="" i="" fscn1="" nisu="" pokazali="" nikakvu="" razliku="" (slika="" 2d,="" e).="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" cdp="" može="" promovirati="" melanogenezu="" i="" regulisati="" ekspresiju="" gena="" povezanih="" s="" melanogenezom="" u="" ljudskim="">

Nadalje, ponovo smo verifikovali efekte CDP-a sa B16F10 ćelijama i otkrili da se sadržaj melanina u B16F10 ćelijama značajno povećao (P < .01;="" slika="" s2b).="" osim="" toga,="" cdp="">

3.2|CDP je promovirao melanogenezu kod zebrica

Istražiti može li CDP promoviratimelanogenezain vivo, koristili smo embrione zebrice. Embrioni zebrice su podijeljeni u četiri grupe i kontinuirano tretirani samo podlogom (NC) ili CDP u različitim koncentracijama (20, 40 i 80 ug/mL); gustina i distribucija granula melanina su posmatrani i beleženi svakog dana. Kako su embrioni zebrice rasli, otkrili smo da se gustina melanina postepeno povećavala u glavama i repovima. Trećeg dana, razlike među grupama su bile uočljive, a razlika je nastavila da se povećava sve dok nismo završili eksperiment 6. dana (slika 3A). Koristili smo sliku J za mjerenje gustine melanina u repovima zebrice; gustina melanina u grupama koje su tretirane CDP bila je značajno veća od one u kontrolnoj grupi (P < .05;="" slika="">

3.3|CDP je aktivirao MAPK signalni put u HEM i B16F10 ćelijama

Otkriti mehanizme kojima je CDP promoviraomelanogeneza, tretirali smo HEM sa CDP u različitim koncentracijama (20, 40 i

80 ug/mL) tokom 48 sati, a zatim istraživali fosforilirane i ukupne nivoe ERK, JNK i p38 proteina u MAPK signalnom putu. Kao što je mjereno Western blottingom, nivoi p-ERK, p-JNK i p-p38 su povećani nakon tretmana CDP (P < .05),="" dok="" se="" njihov="" ukupni="" nivo="" nije="" promijenio="" (slika="" 4a,="" b).="" eksperimenti="" su="" ponovljeni="" sa="" b16f10="" ćelijama="" i="" povećani="" su="" fosforilisani="" nivoi="" proteina="" erk,="" jnk="" i="" p38="" (p="">< .05),="" ali="" se="" ukupni="" nivoi="" mapk="" nisu="" promenili="" (slika="" 4c,="" d),="" što="" je="" u="" skladu="" sa="" rezultatima="" u="" hem.="">

3.4|CDP atenuiran H2O2-induciran

citotoksičnost i apoptoza u HEM i B16F10 ćelijama

Koristili smo H2O2 za simulacijuoksidativni stresokoliša i dalje istraživao ulogu CDP-a u melanocitima podoksidativni stres. Konačna koncentracija H2O2 korištena u HEM-ima bila je 500 μm, dok je u ćelijama B16F10 bila 1,0 mm. Da bismo istražili učinak CDP-a na citotoksičnost izazvanu H2O2-, prethodno smo tretirali HEM i B16F10 ćelije sa CDP-om u različitim koncentracijama (20, 40 i 80 ug/mL) tokom 24 sata, zatim smo dodali H2O2 i nastavili ih tretirati 24 sata prije izvođenja opservacije i MTT testa.

H2O2 je izazvao prividno mjehuriće membrane i skupljanje ćelija u HEM, u grupama koje su prethodno tretirane CDP, situacija je ublažena. Samo liječenje CDP-om nije imalo efekta (Slika 5A). MTT test je pokazao sličan rezultat u tome što je tretman H2O2 smanjio vitalnost HEM, dok je CDP značajno ublažio ovaj štetan uticaj

3.5|CDP je pokupio H2O2-inducirani intracelularni ROS u HEM i B16F10 ćelijama

Da bismo istražili mehanizme CDP-a za smanjenje citotoksičnosti i apoptoze izazvane H2O2-, dalje smo detektirali intracelularni ROS u HEM i B16F10 ćelijama koristeći DCFH-DA fluorescenciju

4|DISKUSIJA I ZAKLJUČCI

U ovoj studiji smo istraživali ulogu CDP-a u HEM i B16F10 ćelijama. Po prvi put smo otkrili da CDP može promoviratimelanogenezau melanocitima i potiču pigmentaciju kod zebrica. Naknadni eksperiment je pokazao da je MAPK signalni put aktiviran pod tretmanom CDP. Dalje smo istražili njegovu ulogu uoksidativni stresi otkrili da CDP može oslabiti H2O{1}} indukovanu citotoksičnost i apoptozu u melanocitima; u međuvremenu, CDP bi mogao aktivirati NRF2/HO-1 antioksidativni put i sakupljati unutarćelijske ROS podoksidativni stresuslovima.

Proteinska kinaza aktivirana mitogenom je vitalni put uključen u regulaciju MITF-a, ključnog transkripcionog faktora koji potiče ekspresijumelanogeneza-srodni geni i kasnije utiče na sintezu i transport melanina.26,27 U našoj studiji, aktivacija ERK, JNK i p38 u melanocitima je značajno povećana nakon tretmana CDP; u međuvremenu, izrazi MITF/p-MITF i TYR, TRP1, TRP2 i RAB27A vođeni MITF

u skladu s tim su regulirani naviše. Stoga predlažemo da CDP može

promoviratimelanogenezaputem aktiviranja MAPK puta, ali kako CDP aktivira MAPK ostaje nepoznato. Prema nedavnim studijama, receptor 4 (TLR4) je visoko eksprimiran u melanocitima i uključen je u melanogenezu.28,29 TLR4 je važan transmembranski protein koji može specifično vezati lipopolisaharid (LPS)30; studije su objavile da LPS može inducirati melanogenezu.29 Zanimljivo, nekolikopolisaharidiekstrahiran iz biljaka ili gljiva navodno je aktivirao TLR i nizvodne signalne puteve kao što su MAPK i nuklearni faktor kapa beta (NF-κB).31,32 Stoga sumnjamo da se CDP može prepoznati i vezati TLR-ima, a zatim aktivira nizvodni MAPK signal- ling puta i promoviramelanogeneza. Nadalje, poznato je da receptori slični domeni oligomerizacije (NLR) koji se vezuju za nukleotide prepoznaju unutarćelijske ligande i pokreću aktivaciju MAPK i NF-κB signalnih puteva.33,34 Kao što je objavljeno, polisaharidi ekstrahirani iz Ganoderme lucidum i Astragalusa mogu ući u ćelije i utiču na NLR.35,36 Stoga je moguće da CDP može ući u melanocite i regulisati MAPK signalni put preko NLR-a. Međutim, potrebne su daljnje studije kako bi se potvrdila ova hipoteza.

Neka dosadašnja istraživanja izvještavaju o primjeni biljnog porijeklapolisaharidiu melanogenezi da inhibira proizvodnju melanina.37,38 Međutim, u ovoj studiji, CDP je promovirao melanogenezu u

melanocita, a ovaj efekat je dodatno potvrđen nakon poređenja sa -MSH. CDP je takođe neka vrstapolisaharidaekstrahirano iz bilja, sumnjamo da bi suprotan efekat CDP-a mogao biti povezan sa strukturnim razlikama između CDP-a i drugihpolisaharidi. Polisaharidi nastaju polimerizacijom monosaharida, ali su varijabilni po tipu monosaharida, sastavu monosaharida, glikozidnoj vezi, strukturi bočnog lanca i molekulskoj težini39,40; Smatra se da ovi faktori određuju njihove biološke funkcije.41 Postojeće studije su predložile strukturu CDP-a i sugerirale da struktura CDP-a naknadno utiče na njegovu funkciju.42 Stoga je potrebno više dokaza da bi se u potpunosti razumjelo CDP i potvrdila naša hipoteza.

Melanogeneza je važan zaštitni mehanizam otpora

ultraljubičasto oštećenje i održavanje homeostaze tijela43; na istom

vremena, melanociti su lako izloženi nepovoljnim okruženjima kao što je preopterećenje ROS.11 Poznato je da ROS učestvuju u promocijimelanogeneza, jedan od mehanizama je aktiviranje MAPK.44 Ali studije su takođe otkrile da ovaj efekat postoji samo unutar određenog nivoa ROS, dok preopterećenje ROS značajno narušava melanogenezu.45 Odnos između ROS, MAPK i melanogeneze je promenljiv pod različitim uslovima, tako da, ravnoteža između pro- i antioksidativnih sistema je očigledno važna. Kod bolesti depigmentacije kao što je vitiligo, neuravnotežen antioksidativni sistem i nekontrolisano preopterećenje ROS-a će oštetiti melanocite i smanjiti vitalnost ćelija.11,46 U ovoj studiji koristili smo različite koncentracije H2O2 da simuliramo preopterećenje ROS-a u ćelijama, a HEM-ovi su pokazali lošiju toleranciju na H2O2 nego ćelije B16F10. Kada su melanociti bili podvrgnuti tretmanu H2O2, njihova vitalnost i stopa apoptoze su se pogoršali, ali

Predtretman CDP-a mogao bi djelimično preokrenuti trend. U isto vrijeme, ROS je očišćen. Kao što je objavljeno, aktivacija NRF2/ARE antioksidacionog puta je glavna metoda uklanjanja ROS-a u ćelijama kože.14 U našim eksperimentima, nivoi proteina NRF2 i HO-1 u melanocitima su bili povišeni nakon tretmana H2O2 bez CDP; to znači da je H2O2-indukovanaoksidativni stresmože aktivirati NRF2/HO-1 put, ali je nedovoljan za održavanje redoks ravnoteže i zaštitu ćelije od ozljeda. Međutim, predtretman CDP-om poboljšao je put antioksidacije NRF2/HO-1 i vratio ravnotežu. Stoga, predlažemo da CDP može zaštititi melanocite od ozljede oksidativnim stresom putem aktivacije NRF2/HO-1 antioksidacionog puta i uklanjanja ROS.

Otkrili smo da samo liječenje CDP nema utjecaja na ROS ili NRF2/HO-1 u melanocitima. Ovaj rezultat sugerira da CDP može utjecati na redoks ravnotežu pod oksidativnim stresom, ali ne i na normalna stanja. Štaviše, put antioksidacije NRF2/HO-1 je navodno regulisan signalnim putevima PI3K, NF-κB i MAPK.47,48 U našoj studiji, CDP je bio u stanju da aktivira MAPK signalni put. Moguće je da CDP može aktivirati NRF2/HO-1 put putem MAPK-ova koji regulišu naviše. Kako je izvijestio Slominski, melanociti su senzori stresa uključeni u regulatornu mrežu, a njihove funkcije se mogu brzo mijenjati kao odgovor na okolinu.49 Predlažemo da na ulogu CDP-a utiče status melanocita, da može promovirati melanogenezu bez utjecaja na antioksidans. sistema u normalnim uslovima, ali vraća redoks ravnotežu podoksidativni stresuslovima. Stoga se funkcija melanocita i preživljavanje mogu održavati na dva različita načina pomoću CDP-a. CDP pomaže melanocitima u održavanju homeostaze, što je također važna funkcija melanogeneze.50,51

Zaključno, CDP može promoviratimelanogenezamelanocita

preko aktiviranja MAPK signalnog puta. CDP može poboljšati preživljavanje melanocita aktivacijom antioksidativnog puta NRF2/HO-1 i uklanjanjem intracelularnog ROS-a u uslovima oksidativnog stresa. Naši nalazi su značajni jer pokazuju da CDP može i promoviratimelanogenezai štite melanocite odoksidativni stresozljeda, koja je vjerojatno odgovorna za disfunkciju i gubitak melanocita. Nalazi ove studije pokazuju da bi CDP mogao biti novi lijek u liječenju bolesti depigmentacije.

ZAHVALNICA

Ovaj rad je podržala Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (br. 81703101), Novi projekti za talente Xiangya Treće bolnice Xiangya Univerziteta Central South (br. JY201623 i br. 20170301), Fondacija za prirodne nauke provincije Hunan ( br. 2018JJ3788 i br. 2018JJ3793) i Projekt zdravstvene komisije Hunan (br. C2019173). Dr Yibo Hu je izvršio glavni dio studije i napisao rukopis; Profesor Jing Chen i Qinghai Zeng dizajnirali su studiju i vodili pisanje rukopisa; Profesor Jinhua Huang, Lihua Huang i Hong Xiang pružili su tehničku podršku i analizirali podatke; Dr Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang i Xiaojiao Zhao dali su doprinos dijelu eksperimenata.

SUKOB INTERESA

Autori potvrđuju da nema sukoba interesa.

IZJAVA O DOSTUPNOSTI PODATAKA

Podaci koji podržavaju nalaze ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

REFERENCE

1. Bleuel R, Eberlein B. Terapeutski tretman vitiliga. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Trebamo li dati prioritet psihološkim intervencijama u liječenju vitiliga? J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, et al. Vitiligo. Nat Rev Dis Primeri. 2015;1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Pigmentacija melanina u koži sisara i njena hormonska regulacija. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski A, Zmijewski MA, Pawelek J. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin kao hormonski slični regulatori funkcija melanocita. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA. Zajedničke genetske veze u osnovi generaliziranog vitiliga i autoimune bolesti štitnjače. Thyroid. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Dječji vitiligo u Kini: klinički profili i imunološki nalazi u 620 slučajeva. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Autoreaktivni T-limfociti u inflamatornim kožnim bolestima. Front Immunol. 2019;10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, et al. Vitiligo: Patogeneza, kliničke varijante i pristupi liječenju. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, et al. Reaktivne vrste kiseonika u metaboličkoj i inflamatornoj signalizaciji. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Melanociti kao pokretači i žrtve oksidativnog stresa. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oksidativni stres i vitiligo: Nrf2-ARE

signalna veza. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Regulatorna mreža Nrf2 pruža interfejs između redoks i posrednog metabolizma. Trends Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Značaj Nrf2

put (foto)-oksidativnog stresnog odgovora u melanocitima i keratinocitima ljudske epiderme. Pigment Cell Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel N, Speeckaert R, Mollet I, et al. In vivo model indukcije i terapije vitiliga: dvostruko slijepo, randomizirano kliničko ispitivanje. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. Uskopojasna ultraljubičasta B fototerapija i 308-nm ekscimer laser u liječenju vitiliga: pregled. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, et al. Xenon hlorid ultraljubičasti B laser

je efikasniji u liječenju psorijaze i indukciji apoptoze T ćelija od uskopojasnog ultraljubičastog B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, et al. Efekti vodenih ekstrakata Eclipse herba, Polygoni multiflora radix preparator i Rehmanniae radix preparator na melanogenezu i migraciju ljudskih melanocita. J Ethnopharmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": recenzija. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, et al. Preliminarne karakteristike, antioksidativna i hepatoprotektivna aktivnostpolisaharidaodCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang MH, Shi Y, et al. Antizamorna aktivnost ekstrakta bogatog feniletanoidimaCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang H, Xiang Z, Duan X, et al. Antitumorsko i protuupalno djelovanje oligosaharida izCistanche deserticolaekstrakt kod ozljede kičmene moždine. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang H, Yang M, et al.Cistanche deserticola polisaharidištiti PC12 ćelije od OGD/RP-induciranih ozljeda. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.

24. Song D, Cao Z, Liu Z, et al.Cistanche deserticola polisaharidaublažava osteoklastogenezu i resorpciju kosti inhibiranjem RANKL signalizacije i proizvodnje reaktivnih vrsta kisika. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J, et al. Smanjenje TUG1 potiče melanogenezu i melanogenezu izazvanu UVB zrakama. Exp Dermatol. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Program loze melanocita daje otpornost na inhibiciju puta MAP kinaze. Priroda. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Fiziologija transkripcije" formiranja pigmenta u melanocitima: centralna uloga MITF-a. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F, et al. Kulturisani humani melanociti eksprimiraju funkcionalne receptore slične toll-u 2–4, 7 i 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Ljudski melanociti eksprimiraju funkcionalni Toll-like receptor 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C, et al. Korelati aktivnosti pomoćnih sredstava GLA porodice. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng M, Feng CC, et al. Romanpolisaharidadobiven iz Craterellus cornucopioides poboljšava imunomodulatornu aktivnost kod imunosupresivnih miševa putem regulacije TLR4-NF-kappaB puta. Funkcija hrane. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR, et al. TLR-4 može posredovati u signalnim putevima AstragalusapolisaharidaRAP je inducirao ekspresiju citokina ćelija RAW264.7. J Ethnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen H, Yang D, Han F, et al. Bakterijski T6SS efektor EvpP sprečava aktivaciju inflamasoma NLRP3 inhibiranjem Ca(2 plus )-zavisnog MAPK-Jnk puta. Cell Host Microbe. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: višestruki in-Nate imunološki senzor. Trends Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Protuupalni i hepatoprotektivni efekti Ganoderme lucidumpolisaharidiprotiv ozljede jetre uzrokovane tetrakloridom u Kunmingu. Farmakologija. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang B, et al. Astragaluspolisaharidaublažava mišji kolitis inhibicijom NLRP3 inflamasoma. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J, et al. Ganoderma lucidumpolisaharidasmanjuje melanogenezu inhibiranjem parakrinih efekata keratinocita i fibroblasta putem IL-6/STAT3/FGF2 puta. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, et al. Efekat odpolisaharidaFMP-1 iz Morchella esculenta o melanogenezi u ćelijama B16F10 i zebrice. Funkcija hrane. 2018;9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, et al. Molekularne karakteristike i bioaktivnostpolisaharidiiz lucerke (Medicago sativa L.). Nutrienti. 2019;11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, et al. Prisustvo komponenti u tragovima značajno proširuje molekularni odgovor Aspergillus niger na guar gumu. New Biotechnol. 2019;51:57-66.

41. Ma H, Zhang K, Jiang Q, et al. Karakterizacija biljkepolisaharidiiz Dendrobium officinale višestrukim hromatografskim i masenim spektrometrijskim tehnikama. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Strukturna karakterizacija i imunološka aktivnost dvije ekstrahirane hladnom vodompolisaharidiodCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski AT, Zmijewski MA, Plonka PM, et al. Kako UV svjetlo dodiruje mozak i endokrini sistem kroz kožu i zašto. Endokrinologija. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Novi podaci o poremećajima hiperpigmentacije. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Suppl 5):18-21.

45. Glassman SJ. Vitiligo, reaktivne vrste kiseonika i T-ćelije. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Otkrivanje istine o antioksidansima: mitohormeza objašnjava zdravstvene prednosti izazvane ROS. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun E, Hoque M, Gong P, et al. Kurkumin aktivira gen hem oksigenaze-1 regulacijom Nrf2 i elementa koji reaguje na antioksidans. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signaliziranje

hem oksigenaza-1 i njen protuupalni terapijski potencijal.

Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanociti kao "senzorne" i regulatorne ćelije u epidermi. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Uloga pigmenta melanina u melanomu. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski A, Kim TK, Brozyna AA, et al. Uloga melanogeneze u regulaciji ponašanja melanoma: melanogeneza dovodi do stimulacije HIF-1alfa ekspresije i pratećih puteva zavisnih od HIF-a. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.