Kako ekstrakt Cistanchea smanjuje inflamatornu hiperplaziju
Mar 17, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Smanjenje upalne hiperplazije u crijevima kod miševa sklonih raku debelog crijeva vodenim ekstraktom Cistanche deserticola
Yamin Jia,1,2 et al
Cistanchedeserticola se obično koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje mnogih zdravstvenih problema, uključujući sindrom iritabilnog crijeva ili zatvor. Ova studija je dizajnirana da testira efikasnost vodenog ekstrakta C. deserticola u prevenciji kolorektalnog karcinoma na mišjem modelu. Vodeni ekstrakt C. deserticola bogat polisaharidima pripremljen je kuhanjem praha stabljike u destilovanoj vodi. Tgfb1Rag2 null miševi su korišteni kao eksperimentalni model. Ovdje smo pokazali da hranjenje vodenim ekstraktom C. deserticola značajno smanjuje broj sluzokožehiperplazijai crijevnu infekciju Helicobacter kod miševa. Ovo blagotvorno dejstvo je u korelaciji sa značajnom stimulacijom imunog sistema, o čemu svedoči povećanje slezene sa povećanim brojem makrofaga slezene i prirodnih ćelija ubica, te snažnijom citotoksičnošću splenocita. In vitro vodeni ekstrakt C. deserticola pojačao je citotoksičnost naivnih splenocita protiv ćelijske linije raka debelog crijeva kod ljudi, au kulturama makrofaga pojačano je regulirao ekspresiju sintaze II dušikovog oksida i stimulirao fagocitozu. Zaključno, naši podaci pokazuju da se oralna primjena ekstrakta C. deserticola smanjujeinflamatornohiperplastičnapolipi i infekcija helikobakterom kod miševa svojom imunostimulirajućom aktivnošću, što sugerira da ekstrakt C. deserticola može imati potencijal u prevenciji intestinalnih inflamacijskih poremećaja uključujući kolorektalni karcinom. Autorska prava © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.
Ključne riječi: biljna imunomodulacija;Cistancheekstrakt; polisaharidi; helicobacter;inflamatornohiperplazija; kolorektalni karcinom.
Cistancheekstraktmože smanjitiInflamatornohiperplazija
UVOD
Rak debelog crijeva je treći po učestalosti karcinom kod muškaraca i drugi kod žena u svijetu i nalazi se na četvrtom mjestu najčešćih uzroka smrti od raka (8 posto svih smrtnih slučajeva od raka; Ferlay et al., 2010). Epidemiološke studije sugeriraju da su mnogi faktori rizika povezani s ovom bolešću, uključujući genetske (npr. porodična anamneza raka debelog crijeva) (Strate i Syngal, 2005) i faktore ishrane (npr. crveno meso i malo vlakana; Chao et al., 2005; Park et al. al., 2005), iinflamatornobolesti crijeva (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Do danas, uprkos brojnim novim citotoksičnim lijekovima i poboljšanim hirurškim i radioterapijskim tehnikama koje se koriste za liječenje ove bolesti (Cunningham et al., 2010), veliki dio pacijenata sa kolorektalnim karcinomom i dalje je neizlječiv; oko 608 000 smrtnih slučajeva od ove bolesti procjenjuje se širom svijeta u 2008. (Ferlay et al., 2010). Stoga su potrebne nove terapije, a jedan kandidat je imunoterapija. Različiti imunoterapijski pristupi su evaluirani u liječenju kolorektalnog karcinoma, a dosadašnji rezultati su ohrabrujući (Burgdorf et al., 2009). Pokazano je da biljni polisaharidi imaju specifične imunoregulatorne aktivnosti (Jiang et al., 2010.), što sugerira da bi se ovi biljni proizvodi mogli koristiti kao specifični imunostimulirajući adjuvans protiv kolorektalnog karcinoma.
Cistanchedeserticola Ma, poznata kao Rou Cong Rong u kineskoj biljnoj medicini, uključena je u biljne formule za mnoge zdravstvene probleme, uključujući impotenciju, morbidnu leukoreju i sindrom iritabilnog crijeva/zatvor (Jiang i Tu, 2009.). Eksperimentalne studije su otkrile različite biološke aktivnosti različitih ekstrakata C. deserticola; Ekstrakt feniletanoidnih glikozida ove biljke ima djelovanje protiv umora kod miševa (Cai et al., 2010), te analgetik i anti-inflamatornoefekte na glodare (Lin et al., 2002), dok njegovi polisaharidi stimulišu proliferaciju T- i B-limfocita u kulturama limfocita (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Međutim, djelotvornost ekstrakta polisaharida C. deserticola u stimulaciji imunološkog odgovora in vivo još nije ispitana.
Rag2-/-miševima nedostaju zreli T- i B-limfociti, a na mješovitoj pozadini (~97 posto 129 S6 i ~3 posto CF-1) spontano razvijaju upaluhiperplazijau crijevima (Engle et al., 1999). Genetsko uvođenje nultog alela Tgfb1 (gena transformirajućeg faktora rasta b1 (TGF-b1)) u ovaj soj miševa rezultira daljnjim napredovanjemhiperplazijana adenom i karcinom (Engle et al., 2002.), a patogeni kolitis ovisan o mikroflori neophodan je za razvoj raka debelog crijeva (Engle et al., 2002.), što sugerira da ovaj soj miševa predstavlja idealan model za ispitivanje potencijalne terapije u liječenju karcinoma debelog crijeva izazvanog upalom/IBD-om. U ovoj studiji po prvi put demonstriramo efikasnost vodenog ekstrakta C. deserticola bogatog polisaharidima u smanjenjuinflamatornohiperplazijau ovom modelu.
MATERIJALI I METODE
Vodeni ekstrakt C. deserticola bogat polisaharidima.
Biljni C. deserticola ubrao je dr. Y. Guo (Kineski poljoprivredni univerzitet) u autonomnoj oblasti Unutrašnja Mongolija, Kina. Prašak celih osušenih stabljika (300 g) kuvan je u dvostruko destilovanoj vodi dva puta: prvo 1 h u 500 mL vode, zatim sakupljanje supernatanta, zatim 45 min u 400 mL vode. Supernatanti su filtrirani kroz Whatman filter papir (srednje brzi) nakon svakog ključanja i sjedinjeni. Rastvor ekstrakta je osušen liofilizacijom i držan na 80 C. Konačni proizvod je bio oko 10 g (prinos: ~3 procenta).
Miševi i ćelijske kulture. Miševi sa nedostatkom TGF-b1 (Tgfb1 plus /- Rag2-/-) na mješovitoj pozadini (~97 posto 129 S6 i ~3 posto CF-1) primljeni su iz kolonije za razmnožavanje koja se održava u uslovima bez patogena u objektu za životinje u Jack Bell Research Center (Vancouver, BC). Ovi miševi su potekli iz repozitorijuma Konzorcijuma za mišje modele humanog raka (MMHCC) (Nacionalni institut za rak u Fredericku, MD, SAD). C57BL/6 J (B6) miševi (mužjaci, stari 8-10 sedmica) kupljeni su od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SAD). Sve životinje za eksperimente držane su pod konvencionalnim smještajem i ishranom (5001 dijeta za glodare, LabDiet) nakon odbijanja u dobi od 4 sedmice, a biljni tretman i sakupljanje uzoraka obavljeni su u skladu sa smjernicama Kanadskog vijeća za brigu o životinjama pod
protokole koje je odobrio Podkomitet za korištenje životinja na Univerzitetu Britanske Kolumbije.
I SW480 ćelijska linija humanog adenokarcinoma debelog crijeva i RAW 246.7 ćelijska linija mišjih leukemičnih makrofaga uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle's Medijumu (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) koji sadrži 1{{13} posto goveđeg fetusa serum (FBS) (kompletan DMEM medij) na 37-C u vlažnom inkubatoru sa 5 posto CO2/95 posto. Splenociti su izolovani blagim razbijanjem fragmenata slezene u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS), nakon čega je usledilo uklanjanje eritrocita korišćenjem pufera za lizu (0.15 M NH4Cl, 1.0 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 6.8). Nakon ponovnog ispiranja sa PBS, splenociti su suspendovani u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10 procenata FBS (kompletan RPMI medijum).
Cistancheekstraktmože smanjitiInflamatornohiperplazija
Tretman ekstraktom.
Biljni ekstrakt, tzvCistancheekstraktu ovoj studiji, konačno je pripremljen rekonstitucijom osušenog praha sa steriliziranom dvostruko destilovanom vodom i sadržavao je 2-3 procenta (w/w) feniletanoida, 65-70 posto (w/w) polisaharida i 0.6–1 procenat (w/w) proteina na osnovu sledećih testova: broj feniletanoida je određen apsorbancijom na 332 nm koristeći prethodno opisanu spektrofotometriju (Ouyang et al., 2005); sadržaj polisaharida mjeren je standardnom metodom fenol sumporne kiseline (Dubois et al., 1956) nakon precipitacije etanolom; a protein je određen Bio-Rad proteinskim testom prema protokolu proizvođača (Bio-Rad Lab, Hercules, Kalifornija, SAD). Doza ekstrakta Cistanchea bila je 0,4 g/kg/dan na osnovu naše pilot studije. Prosječan dnevni unos vode po odraslom mišu iznosio je približno 4 mL, a ako je 1 mL vode za piće sadržavao 3 mgCistancheekstrakt, svaki miš je primio oralnu primenu od 12 mg ekstrakta dnevno. Na osnovu činjenice da je prosječna tjelesna težina odraslog miša bila 30 g, voda za piće koja sadrži 3 mg/mLCistancheekstraktdao dozu od 0,4 g/kg/dan miševima. Miševi su tretirani davanjem vode za piće ad labium koja sadrži 3 mg/mLCistancheekstraktkoji se dopunjavao najmanje jednom u dva dana, od navršenih dva mjeseca u trajanju od tri mjeseca u konvencionalnoj prostoriji ustanove za njegu životinja.
Histološka klasifikacija kolorektalnog karcinoma.
Na kraju tromjesečnog tretmana, sakupljena su i tkiva tankog i debelog crijeva i otvorena uzdužno, nakon čega je slijedilo lagano ispiranje sadržaja PBS-om. Sakupljeno je ukupno šest komada (svaki dužine 2 cm) crijevnog tkiva od svakog miša: tri iz tankog crijeva na proksimalnim, srednjim i distalnim lokacijama; dva iz debelog crijeva na proksimalnim i distalnim lokacijama i jedan iz cekuma. Sva tkiva su fiksirana u 10 posto formalina i stavljena u parafin. Svaki rez je obojen hematoksilinom i eozinom (HE) za histološku gradaciju kolorektalnog karcinoma. Klasifikacija bolesti je vršena prema patološkim karakteristikamahiperplazija, adenom ili karcinom unutar svakog uzorka, kao što je prethodno opisano (Engle et al., 1999.) na način slijepog testa. Ukupan broj svake patološke promjene (hiperplazija, adenom i karcinom) izbrojani su u dva dijela crijevnog tkiva za svakog miša.
Cistancheekstraktmože smanjitiInflamatornohiperplazija
Detekcija Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) u izmetu miša.
Da se ispita efekatCistancheekstraktna rast patološke mikroflore u crijevima, H. hepaticus u fecesu određen je lančanom reakcijom polimeraze (PCR) sa specifičnim 16S rDNA prajmerima kao što je prethodno opisano (Shames et al., 1995). Približno 200 mg svježeg izmeta je otopljeno u 1 μL PBS-a i inkubirano na 50 stepeni 30 minuta, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 8000 rpm tokom 10 minuta. Supernatant (200 mL) je sakupljen i pomiješan s jednakom količinom otopine proteinaze K koja sadrži 5 posto (v/v) 18,7 mg/mL otopine proteinaze K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Kanada) u puferu za digestiju (50 μM Tris–HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5 posto natrijum dodecil sulfat), i inkubirano na 70 C 30 min. DNK u rezultirajućem rastvoru je ekstrahovan korišćenjem QIAprep Miniprep kompleta prema protokolu proizvođača (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada).
Polimerazna lančana reakcija amplifikacije bakterijske DNK izvedena je u smjesi koja sadrži {{0}}.75 μL 10 PCR pufera, 0.5 μL od 50 mM MgCl2, 0,5 μL svakog prajmera (sens: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; antisens: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM svaki), 0,5 μL Taq polimeraze, 18,75 μL H2O bez aze 1 μL nekvantificirane otopine DNK izmeta. PCR smeša je zagrevana na 94 stepena 5 minuta, nakon čega je usledilo 40 ciklusa denaturacije na 94 stepena u trajanju od 1 min, žarenje na 55 stepeni tokom 1,25 minuta i ekstenzija na 72 stepena tokom 1,5 min. PCR je završen korakom elongacije od 10 min na 72 stepena. Dobijeni PCR proizvod (25 μL) je podvrgnut elektroforezi na 1% agaroznom gelu u Tris-acetat-EDTA (TAE) puferu koji sadrži 0,5 mg/mL etidijum bromida i vizualiziran je pod UV svjetlom.
Određivanje makrofaga i prirodnih ćelija ubica (NK).
Procenti makrofaga i NK ćelija u suspenziji splenocita određeni su analizom fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija (FACS). Milion splenocita u FACS puferu je inkubirano sa odgovarajućom kombinacijom antitela za različite fenotipove ćelija u ledu: anti-CD3-fluorescein izotiocijanat (FITC) i anti-CD49b-fikoeritrin (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Kanada) za CD3 CD49b plus NK ćelije i štakorov anti-mišji F4/80 plus kao primarno antitijelo i anti-pacovski IgG-FITC kao sekundarno antitijelo (eBioscience, San Diego, CA, SAD) za F4/80 plus makrofage. Intenzitet fluorescencije za svaki tip ćelije meren je protočnom citometrijom i analiziran upoređivanjem sa pozadinskim kontrolama korišćenjem softvera CELLQUEST (BD Biosciences).
Kalcein-acetoksimetil (kalcein-AM) test citotoksičnosti.
Litička aktivnost efektorskih splenocita prema ciljnim ćelijama SW480 procenjena je testom citotoksičnosti kalcein-AM korišćenjem sistema ko-kulture kao što je prethodno opisano (Neri et al., 2001). Ukratko, SW480 ćelije su označene fluorescentnom bojom calcein-AM na sljedeći način: 1 x106ćelije/mL SW480 ćelija u kompletnom medijumu DMEM inkubirane su sa 15 μM calcein-AM na 37 stepeni uz povremeno mućkanje. Nakon 30 minuta inkubacije, ćelije su opsežno isprane kompletnim DMEM medijumom da bi se uklonila ekstracelularna boja. SW480 ćelije označene fluorescentnom bojom u kompletnom DMEM mediju (0,2 x 106ćelije/{{0}}.25 mL/jažici) zasijane su u 24-ploče sa jažicom. Na osnovu različitih omjera (12:1, 6:1, 3:1 i 1,5:1) E (efektor): T (cilj), splenociti u 0.25 mL kompletnog RPMI medijuma po jažici su dodani u jažice sa ciljnim ćelijama u tri primjerka. Kokulture su inkubirane na 37 stepeni u 5 procenata CO2 tokom 24 sata. Supernatanti su sakupljeni nakon što je ploča centrifugirana na 2000 rpm tokom 5 minuta. Oslobađanje Calcein-AM u supernatant je određeno korišćenjem spektrofluorimetra na mikroploči (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) pri emisiji od 527 nm pod ekscitacijom na 485 nm. Ciljne ćelije, inkubirane sa mešavinom od 0,25 mL kompletnog DMEM medijuma i 0,25 mL kompletnog RPMI medijuma, korišćene su kao pozadinske kontrole ili kontrole spontanog otpuštanja, a u prisustvu 2 procenta, Triton X-100 je korišćen kao maksimalne kontrole otpuštanja. Citotoksičnost splenocita izračunata je na sljedeći način:
Mjerenje dušikovog oksida (NO). Dušikov oksid izlučen iz ćelija brzo je oksidirao u nitrit u mediju kulture. Zbog toga su koncentracije nitrata u podlozi određene Griessovom metodom kao mjerenje proizvodnje NO. RAW264.7 ćelije (0.25 x 106
ćelije/jažicu u 0.5 mL kompletnog DMEM medijuma) u 24-pločama sa jažicom stimulirane su saCistancheekstrakt(50-200 mg/mL) i lipopolisaharida (LPS) (10 ng/mL) kao pozitivnu kontrolu. Nakon 24 sata tretmana, 50 mL supernatanta kulture prvo je pomiješano sa 50 mL 1 posto
sulfanilamid u 5% fosfornoj kiselini u 96-pločama u tri primjerka, i inkubirani su 10 min, a zatim je dodato 50 mL 0,1% naftil etilen diamin dihidroklorida u destilovanoj vodi po jažici. Apsorbancija je očitana na 550 nm nakon inkubacije od 10 minuta, a nivo NO/nitrita je izračunat korištenjem standardne krive sa poznatim koncentracijama natrijum nitrita.
Cistancheekstraktmože smanjitiInflamatornohiperplazija
Western blot.
Ćelijski nivoi sintaze azot oksida II (NOS 2 ili iNOS) ispitani su Western blotom kao što je prethodno opisano (Du et al., 2006). Ukratko, uzorci proteina (otprilike 100 mg/uzorku) su frakcionisani sa 7% SDS-PAGE i prebačeni na nitroceluloznu membranu. NOS II proteinske trake su identificirane s primarnim zečjim poliklonskim anti-NOS II antitijelom (N-20) (1:500 razrjeđenje; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Kalifornija, SAD) i sekundarnim kozjim anti-zečjim IgG antitijelom ( 1:10000 razrjeđenje; Vector Laboratory, Burlingame, CA, SAD). Kompleks protein-antitijelo NOS II vizualiziran je poboljšanim hemiluminiscencijskim testom (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Engleska). Blots su ponovo ispitani korištenjem anti-b-actin IgG (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) za potvrdu napunjenog proteina u svakom uzorku.
Test fagocitoze. Fagocitoza je mjerena količinom fluorescentno označenih lateksnih kuglica (SigmaAldrich Canada, L-3030, modificirane karboksilatima, prosječne veličine 2 mm) obuhvaćenih ćelijama RAW264.7 kao što je prethodno opisano (Wu et al., 2{{ 9}07). Ukratko, ćelije RAW264.7 (0,1 106 ćelija/0,5 mL/jažici) u kompletnom DMEM mediju zasijane su u 24-jažice i stimulirane sa 100 mg/mLCistancheekstraktili kompletan DMEM medij samo kao kontrola. Nakon stimulacije preko noći, kulturama makrofaga je dodano 2,5 mL fluorescentnih kuglica lateksa po jažici i inkubirano 2 sata. Za analizu protočne citometrije, ćelije su odvojene pipetiranjem nakon ispiranja u PBS, a intenzitet fluorescencije fagocitnih ćelija je meren protočnim citometrom i analiziran u poređenju sa pozadinskim kontrolama (bez kuglica) korišćenjem softvera CELLQUEST (BD Biosciences).
Statistička analiza.
Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost plus standardna devijacija (SD). Analiza varijanse (ANOVA) ili Studentov t-test urađena je kako je prikladno za poređenje podataka između grupa. P-vrijednost od < 0.05="" se="" smatra="">
REZULTATI
Tretman saCistancheekstraktsmanjuje učestalosthiperplazijai H. hepaticus infekcija crijeva Tokom perioda liječenja (3 mjeseca), tjelesna težina i unos vode za piće su praćeni jednom svaka 2 dana kod miševa iz grupe tretirane ekstraktom u odnosu na grupu koja je tretirana vehikulom, nije bilo značajne razlike. zabilježeno (podaci nisu prikazani). Histološka analiza je, međutim, pokazala da oralna primjenaCistancheekstraktiznačajno smanjio brojinflamatornohiperplazijau crijevima (slika 1), o čemu svjedoči činjenica da su miševi koji su primali vodu s ekstraktom imali manjehiperplazija(5.00 plus -2,83/miš, n=15) od onih koji piju običnu vodu ili vozilo (7,53 plus -3,09/miš, n {{9 }}) (izvod u odnosu na vozilo: p=0.0133, t-test). Razlika u broju adenoma i karcinoma između miševa tretiranih ekstraktom i nosačem nije bila statistički značajna jer je samo nekoliko miševa imalo ove faze patoloških promjena (podaci nisu prikazani).
Slika 1. Smanjenje incidencije hiperplazije tretmanom vodenim ekstraktom C. deserticola (Cistancheekstrakt). Tgfb1 plus /-Rag2-/- miševi su hranjeni saCistancheekstraktu vodi za piće (grupa ekstrakta) u poređenju sa onima sa samo običnom vodom za piće (grupa vozila). Kancerogene lezije u crijevima su histološki ispitane s H&E bojom. (A) Tipična slika presjeka zdravog tkiva. (B) Tipična slika hiperplazije u presjeku, označena strelicom. (C) Broj hiperplazija u crijevima svake životinje izbrojan je histološkim putem (p=0.0133, ekstrakt naspram nosača, n=15). Ova brojka je dostupna u boji na mreži na wileyonlinelibrary.com/journal/ptr
Pokazalo se da je sadržaj crijevnih mikroba, posebno infekcija H. hepaticusom, neophodan za razvoj svih faza raka debelog crijeva, uključujući hiperplaziju u Rag2-/- miševi (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Da se ispita da li je tretman saCistancheekstraktismanjena patološka mikroflora u crijevima, prisustvo H. hepaticus u fecesu miševa tretiranih sCistancheekstraktodređen je PCR-om u poređenju sa kontrolama vehikuluma. U svakom eksperimentu, tri miša po kavezu su tretirana ekstraktom ili vehikulumom Cistanche. Uzorci stolice su prikupljeni na kraju 14-h preko noći nakon čišćenja kaveza. Kao što je prikazano na slici 2, H. hepaticus 16S rDNK u fecesu je efikasno detektovan PCR tehnikom. U tri odvojena eksperimenta (Tabela 1), samo 20–40 posto uzoraka izCistanche-ekstrakt-tretirani miševi su detektovani kao PCR pozitivni, dok je 60-80 posto iz kontrola nosača bilo pozitivno (ekstrakt naspram nosača: p=0.0189, t-test, n=3), što sugerira da je tretman sa Ekstrakt Cistanche je smanjio intestinalnu infekciju H. hepaticus kod miševa.
Tretman ekstraktom Cistanche povećava broj makrofaga slezene i NK stanica
Imunološki odgovor igra ključnu ulogu u eliminaciji infekcije helikobakterom. Da ispita da liCistanche ekstrakttretman je uticao na imunološki sistem kod ovih miševa sklonih raku debelog crijeva, veličina slezine (12 miševa u svakoj grupi) i broj splenocita (šest miševa nasumično odabranih iz svake grupe) određen je na kraju tretmana. Slezene 12 miševa u svakoj grupi su izmerene, ostala tri miša u početnom eksperimentu nisu bila uključena. Kao što je prikazano u tabeli 2,Cistanche-ekstrakt-tretirani miševi (0.055 plus -0.022 g/slezena) bili su teži nego u grupi sa nosačem (0,038 plus -0.01 g/slezena; ekstrakt; u odnosu na vozilo: p=0.04, t-test). Ovi podaci su dodatno potkrijepljeni povećanjem broja splenocita kod miševa tretiranih sCistancheekstrakt, označeno sa 7,095 plus -1.353 (x106 ćelije/slezena) u poređenju sa 2.941 plus -1.492 (x106ćelije/slezena) kontrolni miševi u vozilu (ekstrakt naspram nosača: p=0.002, t-test).
Da se dalje procijeni da liCistancheekstraktliječenje je utjecalo na određeni podtip splenocita kod miševa, na broj NK stanica slezene (CD3-CD49bplusćelije) i makrofage (FT/80plusćelije) je prebrojan FACS analizom. Procenat CD3-CD49bplusćelije u splenocitimaCistanche-ekstrakt-tretirani miševi (32,06 plus -2,13 posto) nije se značajno razlikovao od miševa tretiranih nosačem (28,47 plus -2,74 posto; ekstrakt naspram nosača: p=0. 3741, t-test, n=6), ali ukupan broj NK ćelija u slezeniCistanche-ekstrakt-tretirani miševi (2,22 plus - 0.44x106/slezena) je bila veća od one kontrolne grupe u vozilu (0.83 plus -0.17x106/slezena; ekstrakt u odnosu na vozilo: p=0.01, t-test, n=6; Slika 3B). Slični rezultati su uočeni u ispitivanju FT/80 plus ćelija slezene; kao iu populaciji NK ćelija slezene, razlika u procentu ćelija slezene FT/80 plus između miševa tretiranih ekstraktom (35,25 plus -7,28 posto) i kontrolnih miševa slezene (31,74 plus -5). 07 posto ) nije bio značajan (ekstrakt naspram nosača: p=0.407, n=6), ali ukupan broj makrofaga slezene u grupi tretiranoj ekstraktom (2.439 plus -0 .452x106ćelije/slezena) bila je veća nego u kontrolnim grupama (1.114 plus -0.685x106ćelije/slezena; ekstrakt u odnosu na vozilo: p=0.001, t-test, n=6; Slika 3D). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da je tretman sCistancheekstraktmože povećati ukupan broj, ali ne postotak ili udio, podtipova efektorskih splenocita, NK ćelija i makrofaga u slezeni.
Slika 3. Povećanje broja NK ćelija slezene i makrofaga tretmanom saCistancheekstrakt. NK ćelije ili makrofagi u suspenziji splenocita određeni su FACS analizom sa kombinovanom bojom FITC-anti-CD3e antitijela i APC-anti-CD49b/Pan-NK ćelijskog markera (za NK ćelije) ili s jednom bojom FITC-anti- FT/80 (za makrofage). (A) Reprezentativni grafikon procenta NK ćelija slezene (CD3-CD49bplus) u splenocitima miševa tretiranih sCistancheekstraktnaspram vozila. (B) Ukupan broj NK ćelija po slezeni. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost plus -SD u svakoj grupi (p= 0.01, n= 6). (C) Reprezentativni grafikon procenta makrofaga slezene (FT/80 plus) u splenocitima miševa tretiranih sCistancheekstraktnaspram vozila. (D) Ukupan broj makrofaga po slezeni. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost plus -SD u svakoj grupi (p= 0.001, n=6).
Tretman ekstraktom Cistanche stimulira citotoksičnost splenocita in vivo i in vitro
Imuni odgovor nije ovisio samo o broju splenocita već io njihovoj funkciji, kao što je citotoksičnost. Efekat odCistancheekstrakttretman na funkciju splenocita (tj. citotoksičnost) ispitivan je u kokulturama sa SW480 stanicama. Kao što je prikazano na slici 4A, citotoksičnost splenocita miševa tretiranih sCistancheekstraktbio je veći od ćelija miševa tretiranih nosačem, na šta ukazuje 39,38 plus -2.64 posto oslobađanja kalceina-AM u ko-kulturama splenocita tretiranih ekstraktom sa SW480 ćelijama na 6 :1 odnos, 51,11 plus -2,6 posto u odnosu 3:1 i 57,33 plus -2,53 posto u omjeru 1,5:1, u poređenju sa 27.75- 0.18 procenat u ko-kulturama splenocita tretiranih nosačem sa ćelijama SW480 u omjeru 6:1, 40.97 =-2.85 posto u omjeru 3:1 i 45,16 plus -0.18 posto u Omjer 1,5:1 (ekstrakt naspram vozila: p < 0,0001,="" dvosmjerna="" anova).="" da="" bi="" se="" dodatno="" potvrdio="" stimulativni="">Cistancheekstrakto citotoksičnosti splenocita, citotoksičnostiCistanche-ekstrakt-tretirani naivni splenociti B6 miševa, koji sadrže funkcionalne T i B ćelije, ispitivani su u kokulturama sa SW480 ćelijama. Kao što je prikazano na slici 4B, dodavanje odCistancheekstrakt(100 mg/mL) značajno povećava oslobađanje kalceina-AM u ko-kulturama na način zavisan od splenocita: 57,64 plus -3,41 posto u odnosu 12:1, 52,25 plus { {11}},77 posto u omjeru 6:1 i 45,72 plus -2,43 posto u omjeru 3:1, u poređenju sa 14,36 plus -0,05 posto u omjeru 12:1 , 20,67 plus -2,03 posto u odnosu 6:1 i 23,1 plus -3,73 posto u omjeru 3:1 u nestimulisanim kokulturama (ekstrakt naspram nosača: p < 0,0001,="" dva="" -način="" anova).="" ovi="" rezultati="" ukazuju="" na="">Cistancheekstraktstimuliše litičku aktivnost splenocita. Nepoznat je razlog zašto je uočena manja citotoksičnost kada je dodano više efektorskih splenocita. Jedna od mogućnosti je bila da nivo oslobađanja kalcein-AM u ovom sistemu ko-kulture možda neće tačno odražavati smrt ciljne ćelije jer bi kalcein-AM mogao biti reapsorbovan od strane efektorskih splenocita nakon dugog perioda inkubacije.
Ekstrakt Cistanche aktivira makrofage
Aktivacija makrofaga je jedan od kritičnih imunoloških odgovora protiv infekcije i razvoja tumora (Mantovani et al., 2002, 2008). Da bi se dodatno otkrio uvid u mehanizme pomoću kojihCistancheekstrakttretmanom smanjena crijevna hiperplazija i sadržaj mikroba, učinakCistancheekstraktna proizvodnju NO i fagocitozu makrofaga, RAW264.7 ćelija, ispitan je. Kao što je prikazano na slici 5A, ekspresija proteina NOS II je bila pojačano regulirana u kulturama nakon inkubacije saCistancheekstrakt. Ovi rezultati su dodatno potkrijepljeni povećanjem proizvodnje NO uStimulisan ekstraktom cistanchekulture (slika 5B), o čemu svjedoči 3,88 plus -0.13 mM nitrita u 50 mg/mLCistancheekstraktstimulirane ćelijske kulture RAW264.7 u poređenju sa 0.11 plus -0.12 mM nitrita u nestimuliranim kontrolnim kulturama (jednosmjerna ANOVA, p<>
Fagocitoza je ćelijski proces gutanja čvrstih čestica, kao što su bakterije. Kao što je prikazano na sl. 5C i D, dodavanje odCistancheekstraktistimulirana fagocitoza makrofaga, na što ukazuje više fagocitnih ćelija (9,8 plus -0,1 posto) koje se nalaze uCistanche-ekstrakt-stimulirane kulture makrofaga u poređenju sa onima (5,2 plus -0,4 posto) u kulturama stimuliranim nosačem (ekstrakt naspram nosača: p=0.0007, t-test, n=3) nakon 2 h inkubacije. Ovi podaci ukazuju na toCistancheekstraktmože direktno aktivirati makrofage povećanjem lokalne proizvodnje NO i stimulacijom fagocitoze makrofaga u crijevima miševa.
DISKUSIJA
Ova studija po prvi put pokazuje da oralna primjenaCistancheekstraktznačajno smanjuje učestalost hiperplazije i infekcije H. hepaticusom u crijevima miševa sklonih raku debelog crijeva. Blagotvorno dejstvo odCistancheekstraktliječenje je povezano s povećanjem broja i citotoksičnosti NK stanica i makrofaga slezene. In vitro dodatakCistancheekstraktstimuliše proizvodnju NO i fagocitozu u makrofagima. Rag2 sa nedostatkom TGF-b1-/-pokazalo se da kod miševa razvija rak debelog crijeva (hiperplaziju, adenom ili adenokarcinom) u dobi od 3 do 6 mjeseci i pokazano je dainflamatornožarišta su uvijek povezana sa ovim tumorogenim lezijama (Engle et al., 1999). Dalja istraživanja su pokazala da je kod ovih miševa razvoj karcinoma debelog crijeva neophodan zbog prisutnosti infekcije patogene mikrobne flore jer se karcinom debelog crijeva potpuno eliminira smještajem miševa u uvjetima bez klica (Engle et al., 2002.) i H. hepaticus infekcija također izaziva kolitis i karcinom debelog crijeva u Rag2-/-miševi (Erdman et al., 2003). Slično, kod ljudi, mikrobiološki status i imunitet domaćina su ključni faktori za progresiju IBD (Fiocchi, 1998), a prijavljeno je da je karcinom želuca povezan s hroničnom infekcijom ili upalom izazvanom H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar i Malfertheiner, 2001). Nalazi ovih studija sugeriraju da gastrointestinalna infekcija može igrati ključnu ulogu u razvoju raka debelog crijeva. Stoga, ciljanje na gastrointestinalnu infekciju može postati terapijska strategija za prevenciju ili liječenje raka debelog crijeva, kao i IBD. Naša studija po prvi put pokazuje da oralna primjenaCistancheekstraktsmanjuje učestalostinflamatornohiperplazijau crijevima, i broj H. hepaticus u fecesu kod miševa s nedostatkom TGF-b1. Blagotvorno dejstvo odCistanche ekstraktmože biti posljedica njegove aktivacije makrofaga, što se vidi po povećanju proizvodnje NO i fagocitoze nakon tretmana sCistanche ekstrakt(Sl. 5), što može ograničiti crijevnu patogenu mikrofloru uključujući helikobakter (Mantovani et al., 2002, 2008). Kao posljedica toga, lezija odinflamatornohiperplazijaje smanjen.
U ekstraktima C. deserticola identifikovana su različita bioaktivna jedinjenja uključujući feniletanoidne glikozide i polisaharide (Jiang i Tu, 2009). Feniletanoidni glikozidi su citoprotektivni, na šta ukazuje činjenica da ovi spojevi sprečavaju ćelijsku smrt u kultivisanim hepatocitima i neuronima cerebelarne granule (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Dok polisaharidi stimulišu proliferaciju T- i B-limfocita izazvanu mitogenom (Wu i Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Dobro je dokumentovano da biljni polisaharidi moduliraju imuni odgovor (Jiang et al., 2010).Cistancheekstraktsadrži 2-3 posto feniletanoida i 65-70 posto polisaharida, što sugerira da imunomodulacijski učinakCistancheekstraktliječenje može biti posljedica imunoregulatorne aktivnosti polisaharida, većine bioaktivnih supstanci u ekstraktu Cistanchea. Međutim, njegove ciljne imunološke ćelije (npr. makrofagi ili NK ćelije, ili oboje) i molekularni putevi zahtijevaju dalja istraživanja. Osim toga, nedavna studija pokazuje da primjena biljnog feniletanoid acetonida, jednog od bioaktivnih feniletanoida u ekstraktu C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang i Tu, 2009), ima povoljan učinak na smanjenje dekstrana sulfat-natrijum izazvan kolitis kod miševa (Hausmann et al., 2007), što dokazuje da feniletanoidi (2-3 procenta) uCistancheekstraktmože barem djelomično doprinijeti njegovoj efikasnosti u smanjenjuinflamatornohiperplazija, što takođe zahteva evaluaciju u budućnosti.
Zaključno, kolorektalni karcinom je jedan od najčešćih karcinoma u svijetu i u većini slučajeva se može spriječiti. Upotreba netoksičnih biljnih ekstrakata može ponuditi efikasnu strategiju za prevenciju razvoja kolorektalnog karcinoma, a može se primijeniti i kao kemo-adjuvans, što može imati koristi od poboljšanja kemoterapijske antikancerogene učinkovitosti i/ili smanjenja kemoterapeutskog nuspojave. Podaci predstavljeni u ovoj studiji jasno pokazuju da tretman vodenim ekstraktom C. deserticola smanjuje hiperplaziju i infekciju H. hepaticus u crijevima miševa sklonih raku debelog crijeva. Helicobacter infekcija ili crijevaupalahiperplazijaje faktor rizika za razvoj kolorektalnog karcinoma. Naša trenutna studija pokazuje da upotreba ove biljke može imati potencijal za prevenciju i liječenje kolorektalnog karcinoma, posebno za one osobe koje imaju IBD.
Priznanje
YM je podržan stipendijom diplomiranih studenata iz Kineskog vijeća za stipendije.
Sukob interesa
Autori nemaju sukob interesa.
Cistancheekstraktmože smanjitiInflamatornohiperplazija
Od: 'Smanjenje odInflamatornoHiperplazijau crijevima kod miševa sklonih raku debelog crijeva pomoću vodenog ekstraktaCistanchedeserticola ' autora Yamin Jia,1,2 et al
---Autorska prava © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637
REFERENCE
Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Imunoterapija u kolorektalnom karcinomu. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Aktivnost protiv umora ekstrakta bogatog feniletanoidima izCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Konzumacija mesa i rizik od raka debelog crijeva. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Kolorektalni karcinom. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Strukturna karakterizacija i imunološka aktivnost dva polisaharida koja se ekstrahuju hladnom vodom izCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Dušikov oksid inducira apoptozu u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama kroz aktivaciju kaspaze-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Kolorimetrijske metode za određivanje šećera srodnih supstanci. Anal Chem 28: 350–356.
Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Rizik od kolorektalnog karcinoma kod ulceroznog kolitisa: meta-analiza. Gut 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori i rak želuca. Curr Opin Gastroenterol 17 (Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Transformirajući faktor rasta beta1 potiskuje nemetastatski rak debelog crijeva u ranoj fazi tumorigeneze. Cancer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Eliminacija raka debelog crijeva kod miševa s nedostatkom beta 1-faktora rasta bez klica. Cancer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 plus CD25 plus regulatorni T limfociti inhibiraju mikrobiološki inducirani rak debelog crijeva kod miševa s nedostatkom Rag{3}}a. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Procjene svjetskog tereta raka u 2008.: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Inflamatornobolesti crijeva: etiologija i patogeneza. Gastroenterologija 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Rad DH, et al. 2007. In vivo tretman biljnim feniletanoidnim akteozidom ublažava intestinalnu upalu kod kolitisa izazvanog dekstran sulfatom. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Imunoregulatorno djelovanje polisaharida iz kineske biljne medicine. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analiza hemijskih sastojaka uCistanchevrste. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Antinociceptivna i anti-inflamatornoaktivnost uzrokovanaCistanchedeserticola kod glodara. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukas M. 2010.Inflamatornobolest crijeva kao faktor rizika za kolorektalni karcinom. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Cancer-related inflammation. Nature 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarizacija makrofaga: makrofagi povezani s tumorom kao paradigma za polarizirane M2 mononuklearne fagocite. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Ispitivanje citotoksičnosti kalcein-acetoksimetil: standardizacija metode koja omogućava dodatne analize na obnovljenim efektorskim ćelijama i supernatantima. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Poboljšana proizvodnja feniletanoidnih glikozidaCistanchećelije deserticola uzgajane u bioreaktoru za vazdušni transport sa unutrašnjom petljom sa usponom za sito. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Unos dijetalnih vlakana i rizik od kolorektalnog karcinoma: objedinjena analiza prospektivnih kohortnih studija. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Helicobacter pylori infekcija i rizik od karcinoma želuca. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside fromCistanchesalsa inhibira apoptozu 1-metil-4-fenilpiridinijum jona u neuronima cerebelarne granule. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identifikacija široko rasprostranjene infekcije Helicobacter hepaticus u fecesu u komercijalnim kolonijama miševa pomoću kulture i PCR testa. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Sindromi nasljednog kolorektalnog karcinoma. Kontrola uzroka raka 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Rizik od raka kod pacijenata sa Crohnovom bolešću. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Proteomska analiza efekata piknogenola u RAW 264.7 makrofagu otkriva indukciju ekspresije katepsina D i pojačanje fagocitoze. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Arabinogalaktan izolovan iz stabljikaCistanchedeserticola izaziva proliferaciju kultiviranih limfocita. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glukani izCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Hepatoprotektivna aktivnost feniletanoida izCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Antioksidativni efekti feniletanoida izCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.
