Visok unos soli i njeni efekti na prirodni mikrobiom crijeva kod divljih miševa

1. Uvod

Crijeva sisara kolonizirana je složenom i raznolikom bakterijskom zajednicom, koja zajedno s domaćinom stvara delikatan simbiotski odnos [1,2]. Ova bakterijska zajednica ima mnoge funkcije korisne za domaćina, uključujući metaboličke, imunomodulatorne i trofičke funkcije [3–7], a sastav crijevne mikrobiote može se mijenjati tijekom života, u skladu sa specifičnim potrebama i fiziologijom domaćina [1,8, 9]. Mnoge korisne funkcije bakterija koje potiču zdravlje crijeva posredovane su metabolitima dobivenim anaerobnom fermentacijom [10–13], a disbiotska stanja mogu značajno utjecati na zdravlje domaćina [2,11,14,15]. Rastuća zabrinutost za uticaj načina života na zdravlje dovela je do povećanog naučnog interesa za uključenost crijevne mikrobiote i njene translacijske implikacije [16,17]. Zaista, crijevnu mikrobiotu oblikuju i ekstrinzični (npr. način života, ishrana i medicinski tretmani) i unutrašnji (npr. genetika domaćina, imunološka i metabolička regulacija) faktori [8,18–20]. Općenito je poznato da vanjski elementi mogu izazvati uticajne efekte, pri čemu je prehrana jedan od glavnih faktora koji doprinose utjecanju na sastav i funkciju crijevne mikrobiote [1,2,21]. Poznato je da komponente zapadne ishrane, kao što je visok unos soli, narušavaju homeostazu domaćina utičući na imuni sistem i menjajući crevnu mikrobiotu i bolest [18,22–37]. U mikrobioti crijeva miša, dijeta s visokim udjelom soli (HSD) povezana je sa smanjenjem bakterija koje promiču zdravlje poznatih kao proizvođači kratkolančanih masnih kiselina (SCFA), kao što su Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia i Faecalibaculum [28, 29,38–41], uz povećanje brojnosti Akkermansia, još jednog oportunističkog SCFA-proizvođača za koji se pokazalo da utiče na imunitet i bolest domaćina u različitim modelnim sistemima [42,43]. Mišji životinjski modeli se često koriste za proučavanje kako faktori ishrane mogu oblikovati crevnu mikrobiotu, imuni sistem i bolesti [29,44–46]. Iako je upotreba konvencionalnih laboratorijskih miševa (CLM) još uvijek valjana opcija za mnoge studije, ponekad ne uspijeva pravilno prevesti aplikacije usmjerene na crijevnu mikrobiotu [47–49]. Na primjer, pokazalo se da imunološka i metabolomska istraživanja na mišjim modelima upalne bolesti crijeva (IBD) i gojaznosti loše predviđaju translacijske rezultate studija crijevne mikrobiote [50]. To bi moglo biti zbog mnogih inherentnih razlika u ovim modelnim sistemima, kao što su različita anatomija crijeva, genetika i fiziologija [16,50]. Međutim, drugi problem korištenja CLM-a za proučavanje mikrobiota-imunih interakcija je pripitomljavanje sastava crijevnih bakterija u CLM-u, što se ogleda u smanjenju složenosti i otpornosti CLM crijevne mikrobiote u usporedbi s divljim miševima [51]. Potreba za saniranim i kontrolisanim okruženjem suočava se sa smanjenim prisustvom potencijalnih patogena i parazita, za koje se veruje da posledično dovodi do manje „obrazovanog“ imunog sistema kod CLM u poređenju sa divljim miševima [51–53]. Da bi se riješio ovaj problem, model divljih miševa razvijen je putem prijenosa embriona C57BL/6 miševa u divlje miševe kako bi se dobila crijevna mikrobiota divljeg porijekla, kako bi se prevazišao translacijski problem studija imunološke mikrobiote crijeva [54]. Nedavne studije koje su uključivale ovaj model miša pokazale su superiorne rezultate u predviđanju translacione vrednosti eksperimentalnih imunoterapija u poređenju sa CLM [54,55]. Štaviše, mikrobiota crijeva divljih životinja bila je otpornija i otpornija na liječenje antibioticima i dijetu s visokim udjelom masti u poređenju sa CLM, uporedivo sa složenijom situacijom kod ljudi [54,55]. Međutim, uprkos utvrđenim efektima HSD-a na mikrobiotu crijeva, imunološki sistem i različite modele bolesti u CLM-u, efekti unosa visokog sadržaja soli na prirodnu crijevnu mikrobiotu divljeg porijekla nisu poznati. U ovoj studiji procijenili smo učinak HSD-a na različite sastave crijevnih bakterijskih ekosistema i prediktivne funkcije CLM-a u usporedbi s divljim miševima.

2. Materijali i metode

2.1. Životinje i ishrana

Divlji tip C57BL/6 miševi (ženke stare 7-8 sedmica, n=20) kupljeni su od Charles Rivera i smješteni u objektu za životinje Univerziteta Hasselt pod standardiziranim uvjetima. Divlji miševi (C57BL/6 genetska pozadina, mužjaci n=12 i ženke n=11) [54] bili su smješteni u objektu za životinje UHasselt pod standardiziranim uvjetima. Studije na životinjama odobrila je Etička komisija za eksperimente na životinjama (ECAE) na Univerzitetu Hasselt (ID201618A4V1, ID202235). Miševi su smešteni (4 miša/kavez) u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom (21-23 ◦C) sa ciklusom svetlosti/tama od 12:12 h. Sljedeće prečišćene dijete su kupljene od Ssniffa (Soest, Njemačka): 0,5% NaCl/kontrolna dijeta (E15430-04) i 4% NaCl/HSD (E15431-34). Za HSD, životinje su hranjene sa 1% NaCl u vodi za piće uz E15431-34, kao što je opisano u [28]. CLM miševi su bili podjednako raspoređeni između kontrolne grupe (n=10) i HSD (n=10). Za divlje miševe, mužjaci i ženke su također bili podjednako raspoređeni u kontrolnoj i HSD dijetalnim grupama (6 mužjaka za kontrolu, 6 mužjaka za HSD, 5 ženki za kontrolu i 6 ženki za HSD).

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

2.2. Ekstrakcija DNK

Ekstrakcija mikrobne DNK izvedena je kako je opisano u [28], korištenjem modificiranog protokola QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka). Ukratko, fekalne pelete su dodane u 2-mL Eppendorf koji sadrži 0,5 mm staklene perle i 1,5 mL pufera za lizu (ASL) (Qiagen, Hilden, Njemačka). Za mehaničku homogenizaciju peleta korišteno je tucanje kuglicama. Potpuna ekstrakcija je izvedena prema protokolu proizvođača uz manje modifikacije (produžavanje vremena inkubacije proteinaze K na 2 h na 70 ◦C). Koncentracije DNK su procijenjene korištenjem NanoDrop ND-1000 spektrofotometra (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) i pohranjene na -20 ◦C prije amplifikacije gena 16S rRNA.

2.3. Amplifikacija i sekvenciranje gena 16S rRNA

Slijed gena 16S rRNA je amplificiran korištenjem prajmera specifičnog za V4 regiju (F515/R806), kao što je prethodno opisano [56]. Ukratko, 25 ng DNK je korišteno po PCR reakciji (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) početne denaturacije tokom 30 s na 98 ◦C, nakon čega je uslijedilo 25 ciklusa (10 s na 98 ◦ C, 20 s na 55 ◦C i 20 s na 72 ◦C). Reakcije su izvedene u tri primjerka, objedinjene po uzorku i pročišćene pomoću sistema za čišćenje na bazi magnetnih kuglica (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, SAD). Priprema biblioteke izvršena je PCR-om ograničenog ciklusa kako bi se dobila indeksirana biblioteka korištenjem Nextera tehnologije (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, SAD), nakon čega je uslijedio drugi korak čišćenja magnetnih kuglica AMPure XP. Indeksirani uzorci su zatim normalizirani na istu koncentraciju od 4 nM, skupljeni i sekvencionirani na Illumina MiSeq platformi PE300 s 2 × 300 bp protokolom uparenog kraja prema protokolu kompanije (Illumina, Inc., San Diego, Kalifornija, SAD).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Obrada i statistička analiza podataka sekvenciranja gena 16S rRNA

Sirove sekvence su obrađene pomoću QIIME 2 [57] cevovoda. Nakon filtriranja dužine i kvaliteta (podrazumevani parametri), čitanja su filtrirana i dodijeljena operativnim taksonomskim jedinicama (OTU) pomoću DADA2 [58]. Taksonomsko dodjeljivanje je obavljeno pomoću algoritma VSEARCH (https://github.com/torognes/vsearch; pristupljeno 9. novembra 2022) i baze podataka Silva v128 (https://www.arb-silva.de / pristupljeno 9. novembra 2{{40}}22). ASV tabela je zatim normalizovana razrjeđivanjem na dubini od 6,147, tako da je svaki uzorak dostigao plato na kraju krivulje razrjeđivanja. Alfa-raznolikost je procijenjena korištenjem dvije različite metrike: ekološki indeksi bogatstva OTU-a (Observed), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson). Za beta-diverzitet, Bray-Curtisova različitost, sličnost po Jaccardu, te ponderisane i neponderisane UniFrac metrike [59] su izračunate i nacrtane pomoću Principle Coordinates Analysis (PCoA) kako bi se vizualizirala stvarna udaljenost između uzoraka. Da bi se normalizirala tabela brojanja OTU, razrjeđivanje je izvedeno na dubini od 6305 sekvenci po uzorku 100 puta. Izlaz dobijen iz dodjeljivanja taksonomije OTU, kao taksonomska tabela, korišten je za sažimanje normalizirane OTU tablice u tablice za nivoe taksonomije L2 (tip), L5 (porodica) i L6 (rod). Statističke analize su obavljene korištenjem R (https://www.R-project.org/; pristupljeno 25. novembra 2022; verzija 4.2.0). R paket "vegan" (verzija 2.6-4) [60] je korišten za generiranje metrike beta-diverziteta za poređenje kompozicionih razlika grupa prema PCoA ili analizom glavnih komponenti (PCA). Paketi i razdvajanje podataka testirani su permutacijskim testom sa pseudo-F omjerima (funkcija "Adonis" u "vegan"). Razdvajanje u smislu beta diverziteta između grupa testirano je permutacijskom multivarijantnom analizom varijanse korištenjem matrica udaljenosti (PERMANOVA, funkcija "Adonis" u "vegan"), dok su razlike za unutargrupnu disperziju testirane multivarijantnom homogenošću disperzijskog testa grupa (PERMDISP , funkcija "betadisper" u "vegan"). Taksoni koji nisu bili prisutni u najmanje 4 uzorka su isključeni iz analize. Razlike u pogledu relativne zastupljenosti svojti prvo su procijenjene preliminarnim Kruskal-Wallisovim testom između 4 grupe, a zatim dalje procijenjene Wilcoxonovim testom između sljedećih parova poređenja: CLM kontrola naspram CLM HSD, kontrola divljih životinja naspram divlja HSD, CLM kontrola vs. divljač Control, CLM HSD vs. divljač HSD. Za procjenu taksonomskih razlika između divljači i CLM-a, korišćena je veličina efekta linearne diskriminantne analize (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; pristupljeno 25. novembra 2022.) za razlikovanje glavnih karakteristika na nivou roda [ 61]. LEfSe rezultati su zatim prikazani kao trakasti grafikon, sa pragom rezultata linearne diskriminantne analize (LDA) višim od 1,0. Kad god je bilo potrebno, p-vrijednosti višestrukih poređenja su prilagođene Benjamini-Hochbergovom metodom. Stopa lažnog otkrivanja (FDR) manja ili jednaka 0,05 smatrana je statistički značajnom: * p Manje ili jednako 0,05; ** p Manje ili jednako 0,01; *** p Manje ili jednako 0,001. Funkcionalne razlike između mikrobioma različitog sadržaja NaCl u hrani (0,5% i 4% sadržaja NaCl u hrani) analizirao je PICRUSt2, bioinformatički softverski paket za predviđanje funkcionalnog sadržaja metagenoma iz podataka sekvenciranja gena 16s rDNA (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/ pristupljeno 29. novembra 2022. PICRUSt2 2.4.1) [62]. PICRUSt2 cjevovod je primijenjen na reprezentativne sekvence i njihovu tablicu obilja iz DADA2 korištenjem standardnih parametara (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; pristupljeno 29. novembra 2022.). Iz kompletnog izlaza, metagenomsko predviđanje za KEGG Orthology i MetaCyc puteve napravljeno je kao tabele, sa prediktivnim funkcijama kao redovi i uzorci kao kolone, i korišteno za poređenje funkcija crijevne mikrobiote kod divljih životinja i CLM-a u HSD režimu. Prediktivne funkcije mikrobne zajednice koje su najviše doprinijele varijaciji između divljači i CLM-a po prvoj (PC1), drugoj (PC2) i trećoj glavnoj komponenti (PC3) odabrane su za dalju analizu nakon potrošnje HSD-a u dva modela. Matrica sa obiljem prediktivnih funkcija je zatim normalizovana, transformisana u vrednosti Centred Log Ratio (CLR) i izračunat je log2mean odnos (HSD/Control) i za divlje i za CLM. Konačno, log2mean omjeri su upoređeni između grupa Wilcoxon-ovim testom i nacrtani kao klinasti dijagram. Razlike između grupa su statistički upoređene u R softveru koristeći Wilcoxon-test i Kruskal-Wallis test funkcije i p vrijednosti prilagođene Holm ili Benjamini-Hochberg metodom.

3. Rezultati

3.1. HSD utječe na raznolikost i sastav mikrobiote CLM i crijeva divljih životinja

Da bismo istražili utjecaj HSD-a na ekosistem crijevnih mikroba iz divljeg porijekla kod miševa, hranili smo HSD ili kontrolnim dijetama divlje miševe i CLM. Miševi su držani na režimu ishrane dvije sedmice, a sastav fekalne crijevne mikrobiote je naknadno istražen sekvenciranjem gena 16S RNK iz fekalnih peleta prikupljenih 14. dana (Slika 1A). U skladu s prethodnim izvještajem, nisu otkrivene velike razlike u pogledu tjelesne težine između kontrolnih i HSD grupa CLM i divljih miševa [29]. Da bismo procijenili različitu mikrobiotu crijeva između dva modela CLM i divljih miševa na početku, procijenili smo alfa raznolikost (uočeni ili Richness, Chao1, Shannon, Simpson i Inverse Simpson indeksi), beta raznolikost (različitost Bray-Curtis) i glavnu taksonomske razlike. U skladu s prethodnim studijama [54], mikrobiotu crijeva divljih životinja karakteriziralo je veće mikrobno bogatstvo (Slika 1B, svi indeksi alfa raznolikosti), kao i jasan i heterogeniji mikrobni sastav od CLM (Slika 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, divlji naspram CLM i slika S1); U smislu mikrobnih potpisa, mikrobiotu crijeva CLM i divljih miševa karakteriziraju različite bakterijske taksone (Slika S1). U skladu sa Rosshart et al. [54], bakterijske taksone divljih miševa pripadaju Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter i patogenom rodu Helicobacter, koji je karakterizirao neudomaćeni profil ovog modela (slika S1).

Slika 1. Utjecaj HSD na bakterijski sastav CLM (n=10/grupa) i divljih miševa (n=11 za divlje Ctrl i n=12 za divlje HSD). (A) Eksperimentalni dizajn. C57BL/6 CLM ili divlji miševi hranjeni su sa 0.5% NaCl (kontrola, Ctrl) ili visokim sadržajem soli 4% NaCl (HSD) i crijevima bakterijske zajednice crijeva okarakterizirana sekvenciranjem amplikona 16S rRNA gena. (B) Indeksi alfa raznolikosti fekalne crijevne mikrobiote CLM i divljači; s lijeva na desno prikazani su sljedeći indeksi: Posmatrano (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Razlike između grupa se statistički procjenjuju Wilcoxon-ovim testom. (C) Grafikon analize glavnih koordinata ordinacije beta raznolikosti iz Bray-Curtisove metrike različitosti između CLM naspram divljeg (gore), CLM kontrole naspram CLM HSD (dolje lijevo) i kontrole divljeg naspram divljeg HSD (dolje desno); razdvajanje i homogenost između grupa izračunati su PERMANOVA i PERMDISP testovima. * p Manje ili jednako 0.05; ** p Manje ili jednako 0.01; **** p Manje ili jednako 0.0001. Slika 1. Utjecaj HSD-a na sastav bakterija CLM (n=10/grupa) i divljih miševa (n=11 za divlje Ctrl i n=12 za divlje HSD). (A) Eksperimentalni dizajn. C57BL/6 CLM ili divlji miševi hranjeni su 0,5% NaCl (kontrola, Ctrl) ili visokim sadržajem soli 4% NaCl (HSD) i crijevima bakterijske zajednice crijeva okarakterizirana sekvenciranjem amplikona 16S rRNA gena. (B) Indeksi alfa raznolikosti fekalne crijevne mikrobiote CLM i divljači; s lijeva na desno prikazani su sljedeći indeksi: Posmatrano (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Razlike između grupa se statistički procjenjuju Wilcoxonovim testom. (C) Grafikon analize glavnih koordinata ordinacije beta raznolikosti iz Bray-Curtisove metrike različitosti između CLM naspram divljeg (gore), CLM kontrole naspram CLM HSD (dolje lijevo) i kontrole divljeg naspram divljeg HSD (dolje desno); razdvajanje i homogenost između grupa izračunati su PERMANOVA i PERMDISP testovima. * p Manje ili jednako 0,05; ** p Manje ili jednako 0,01; **** p Manje ili jednako 0,0001.

HSD je izazvao značajno smanjenje bakterijske raznolikosti (slika 1B, svi indeksi alfa raznolikosti) kao i značajan mikrobni pomak u sastavu CLM (slika 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl naspram CLM HSD). Nasuprot tome, mikrobiota crijeva divljih miševa je bila okarakterisana većom raznovrsnošću na HSD (Slika 1B, Observed & Chao1 indeksi), divergentno od CLM, a također su bili karakterizirani manje izraženim pomakom mikrobnog sastava nakon HSD u odnosu na CLM (Slika 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, divlji Ctrl naspram divlji HSD).

3.2. Mikrobni sastav crijeva divljih miševa otporniji je na HSD nego na CLM

Razlike u sastavu bakterija između divljači i CLM su dalje taksonomski okarakterizirane. Na nivou tipa, najzastupljeniji tip u smislu relativnog obilja bili su: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, divlji: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, divlji: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7%, divlji: 0,7 ± 1,3%) i Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%, divlji: 0%/nije otkriveno) (Slika 2). Profil crijevnih mikroba pokazao je daljnju različitu zastupljenost za sve vrste otkrivene u fekalnim uzorcima između divljih miševa i CLM (Slika 2). Konkretno, core microbiota phyla Firmicutes, Bacteroidota i Verrucomicrobiota značajno su se razlikovale između dva modela (Slika 2). Konkretnije, na nivou porodice, uočen je drugačiji doprinos kod divljači u odnosu na CLM crijevnu mikrobiotu za većinu bakterija koje su ranije prijavljene kao osjetljive na HSD [28], uključujući Lactobacilaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae i Akkermansiaceae (Slika 3). U skladu s tim, potvrđeni su slični trendovi na nivou roda između uzoraka divljači i CLM za glavne članove navedenih porodica; među njima su najreprezentativniji bili Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum i Akkermansia (Slike S1 i 4). Da bismo dalje okarakterizirali utjecaj HSD-a na CLM i sastav mikrobiote crijeva divljih životinja, također smo analizirali utjecaj režima ishrane na različitim nivoima klasifikacije. Na nivou tipa, HSD-tretirana CLM crijevna mikrobiota je okarakterizirana značajnim iscrpljivanjem Firmicutes i obogaćivanjem Verrucomicrobiota (Slika 2), ali nijedan od glavnih tipova nije bio pogođen HSD u uzorcima divljih životinja (Slika 2). Na nivou porodice, CLM crijevnu mikrobiotu karakterizira značajno smanjenje bakterija koje proizvode mliječnu kiselinu kao što su Lactobacilaceae, kao i SCFA-proizvođača kao što su Peptostreptococcaceae i Clostridiaceae (Slika 3). Dodatno, u CLM-u koji se hrani HSD, uočili smo porast Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae i Eggerthelaceae (Slika 3). Nasuprot tome, HSD je utjecao na različite porodice bakterija u mikrobioti crijeva divljih životinja, među njima i na dvije vrlo rasprostranjene Muribaculaceae i Prevotellaceae, od kojih su obje povećane nakon HSD (Slika 3). Bakterijska modulacija koja je najviše doprinijela HSD-efektu u CLM uključivala je povećanje rodova Akkermansia, Parasutterella i Enterorhabdus, kao i smanjenje Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens grupe, Muribaculum i Anaervorax (Slika 4). Osim Roseburia, nijedan od navedenih rodova nije bio zahvaćen HSD u mikrobioti crijeva divljih životinja, dok je rod Anaerovorax pokazao suprotnu tendenciju od one kod CLM (Slika 4).

Slika 2. HSD-efekat na bakterijsku vrstu iz crijevne mikrobiote CLM (n=10/grupa) i divljih miševa (n=11 za divlje Ctrl i n=12 za divlje HSD). Ukupni sastav u smislu relativne rasprostranjenosti tipova prikazan je linijskim dijagramom po svakoj individui (gore) i okvirom za specifičnu filu (dolje); vršena su statistička poređenja između grupa Wilcoxon-ovim testom. * p Manje ili jednako 0.05; ** p Manje ili jednako {{10}}.01; *** p Manje ili jednako 0,001; **** p Manje ili jednako 0,0001.

Slika 3. Utjecaj konzumiranja hrane sa visokim sadržajem soli na bakterijske porodice CLM (n=10/grupa) i divlje miševe (n=11 za divlje Ctrl i n=12 za divlje HSD). Ukupni sastav na nivou porodice predstavljen je linijskim grafikonom po svakom pojedincu (na vrhu) i boxplotom za određene porodice (dole); vršena su statistička poređenja između grupa Wilcoxon-ovim testom. * p Manje ili jednako 0.05; ** p Manje ili jednako {{10}}.01; *** p Manje ili jednako 0,001; **** p Manje ili jednako 0,0001.

Slika 4. Promjene bakterijskih rodova kod CLM (n=10/grupa) i divljih miševa (n=11 za divlje Ctrl i n=12 za divlje HSD). Ukupni doprinos relativnog obilja na nivou roda je prikazan kao kružni dijagram po svakoj individui (na vrhu) i okvirni dijagram za specifične rodove (dole); vršena su statistička poređenja između grupa Wilcoxon-ovim testom. * p Manje ili jednako 0.05; ** p Manje ili jednako 0.01; *** p Manje ili jednako 0,001; **** p Manje ili jednako 0,0001.

3.3. HSD utječe na prediktivne mikrobne funkcije u CLM, ali ne i na divlje miševe

PICRUSt 2 izlaz nije otkrio nikakvu značajnu razliku između funkcija mikrobne zajednice divljih HSD u odnosu na netretirane divlje miševe i za KEGG Orthology i za oznake puteva MetaCyc, s jedinim izuzetkom povećane funkcije na recG genu izazvane HSD-om za helikazu zavisnu od ATP-a iz KEGG ortologija (slika 5A). Utjecaj HSD-a na CLM karakterizirao je značajno smanjenje prediktivnih funkcija za KEGG Orthology, među kojima su gen spp (saharoza-6-fosfataza) i pfkA (fosfofruktokinaza 1), oba uključena u metabolizam škroba i saharoze, što je u skladu sa prethodnim nalazima [28] (Slika 5A). Osim toga, crijevnu mikrobiotu CLM-a hranjenog HSD-om karakteriziraju smanjene prediktivne funkcije gena uključenih u membranski transport (feoB za transport željeza, AB 2P AB 2 protein permeaze, AB 2A AB 2 ATP vezujući protein), biosinteza glutamina (glnA) , regulator transkripcije porodice LacI (lacI, galR) i transketolaza (tktA, tktB) (slika 5A). Za MetaCyc puteve, HSD je značajno obogatio CLM crijevnu mikrobiotu prediktivnih funkcija povezanih sa redukcijom nitrata (put denitrifikacije), razgradnjom galaktoze (razgradnja D-galaktarata, super put razgradnje D-glukarata i D-galaktarata), razgradnjom fenil-propanoata, masnim spasavanje kiseline, razgradnja sukcinata do butanske kiseline i razgradnja aminokiselina (razgradnja aromatičnih amina, razgradnja L-leucina) (Slika 5B). Nadalje, u skladu s prethodnim nalazima [28], mikrobiota crijeva HSD u CLM-u izgubila je prediktivne funkcije za biosintezu aminokiselina (super put biosinteze L-alanina, biosinteza L-lizina), miješanu kiselu fermentaciju, s dodatnim novim potpisom izgubljenim poput N- Razgradnja acetilglukozamina/N-acetil-manozamina/N-acetilneuraminata i dezoksiribonukleozida (razgradnja pirimidina i purina, biosinteza inozin-5 fosfata III) (Slika 5B).

Slika 5. Nastavak.

Slika 5. Utjecaj HSD-a na metagenomske funkcije crijeva za predviđanje u mikrobioti crijeva CLM (n=10/grupa) i divlje (n=11 za divlje Ctrl i n=12 za divlje HSD). PICRUSt2 izlaz iscrtan kao klinasti dijagram za KEGG Orthology anotaciju (A) i MetaCyc puteve (B) izražen kao log2 srednji omjer broja prediktivnih funkcija između HSD i Ctrl uzoraka. Sva statistička poređenja su obavljena između Ctrl i HSD grupa Wilcoxon-ovim testom.

4. Diskusija

Poznato je da je složena i raznolika crijevna mikrobiota divljih životinja otpornija na određene modele bolesti [51] i režime ishrane, kao što je unos s visokim sadržajem masti [54,55]. Međutim, nijedna prethodna studija nije procijenila efekte visokog unosa natrijuma na mikrobiotu crijeva divljeg porijekla. Ovdje smo po prvi put istražili kako HSD utječe na mikrobiotu crijeva divljih životinja u usporedbi s CLM. Zanimljivo je da su naši rezultati pokazali da je u poređenju sa CLM-om, mikrobiom divljih životinja otporniji na poremećaje HSD-a na kompozicionom i prediktivnom funkcionalnom nivou. Dobro je poznato da veliki unos soli može pogoršati rizik od raznih bolesti, kao što su kardiovaskularne ili autoimune bolesti, promjenom sastava crijevnog mikrobioma i imunološke homeostaze [25,29,31,34,63–65]. U skladu s prethodnim izvještajima, HSD-inducirane pomake u crijevnoj mikrobioti u CLM-u karakterizirale su značajne promjene u mikrobnoj raznolikosti, sastavu i prediktivnim funkcijama [28]. Bakterije koje promovišu zdravlje kao što su porodica Peptostreptococcaceae i rodovi Lactobacillus, Roseburia i Tuzzerella smanjile su se u smislu relativne zastupljenosti u CLM, dok se Akkermansia značajno povećao u grupama koje su hranjene HSD. Također smo otkrili veću relativnu zastupljenost HSD-a u Defluvitaleaceae, Enterorhabdusu i Parasutterella. Zanimljivo je da je rod Parasutterella osnovna komponenta crijevne mikrobiote i CLM i ljudi, gdje se ponaša kao asaharolitik i proizvođač sukcinata [66]. Poznato je da su Enterorhabdus iz porodice Eggerthelaceae i Parasutterella iz porodice Sutterellaceae obogaćeni kod pacijenata sa IBD [67,68], što dalje ukazuje na to kako HSD može uticati na razvoj bolesti. Međutim, zanimljivo je da divlji miševi nisu pokazali sličan entitet mikrobnih pomaka izazvanih HSD-om, kao što je CLM. Unatoč tome, raznolikost divljih životinja značajno se povećala na HSD-u za uočene OTU-ove i Chao1 metrike, a samo je nekoliko taksona bilo uključeno u HSD-poremećaj mikrobiote crijeva divljih životinja, među njima povećanje Anaerovoraxa, zajedno sa smanjenjem Erysipelatoclostridium, Roseburia i Lachnospiraceae UCG{19}} rod. Roseburia je bio jedini bakterijski potpis koji se uobičajeno dijeli između HSD grupa u usporedbi s odgovarajućim kontrolama, unatoč tome što se CLM hranjen HSD i dalje karakterizira većom zastupljenošću ove bakterije u usporedbi s divljim miševima hranjenim HSD-om. Treba napomenuti da se pokazalo da bakterije koje proizvode butirat, kao što je Roseburia, imaju nižu relativnu zastupljenost kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom [69], a uočeno je i da je ovo smanjenje u korelaciji sa genetskim rizikom od IBD kod ljudi [70]. Ovo je u skladu s prethodnim nalazima, gdje je utvrđeno da su promjene u bakterijskim rodovima, kao što su Roseburia ili Lactobacillus, povezane s rizikom od hipertenzije, što je moguće promovirati zapadnjačkom ishranom [71]. Bakterijski sastav crijeva također je povezan s pokretljivošću i fiziologijom crijeva [72].

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Rod Anaervorax je ranije uočen kod miševa s abnormalnom fiziologijom crijeva i smanjenom pokretljivošću [73]; međutim, obogaćivanje Anaerovoraxa u HSD za divlje miševe može dovesti do drugačije uloge ove taksone u kontekstu homeostaze crijeva i pravilne funkcije. U skladu s prethodnim nalazima, uočili smo porast u rodu Akkermansia u HSD grupi CLM [28], dok je mikrobiota crijeva divljih miševa iscrpljena ovim rodom, što je također u skladu s ranijim studijama na ovom modelu [51, 53–55]. Iako je rod Akkermansia potencijalni probiotik zbog svog pozitivnog učinka na poboljšanje imunološkog i metaboličkog profila domaćina (npr. kod gojaznosti i dijabetesa tipa 2) [42,74–77], uloga ovog roda je još uvijek nejasna zbog negativnosti. korelacija sa kliničkim ishodima kod kolorektalnog karcinoma [78], Parkinsonove bolesti [79,80] i pacijenata sa multiplom sklerozom [81]. U skladu s našim prethodnim rezultatima dobivenim s MetaCyc putevima [28], CLM nakon HSD pokazao je smanjene prediktivne mikrobne funkcije povezane s metabolizmom škroba i saharoze za KEGG ortologiju. Međutim, manji pomaci u sastavu crijevnih bakterija divljih miševa hranjenih HSD-om nisu uspjeli inducirati bilo kakve značajne varijacije u prediktivnim bakterijskim funkcijama, što ukazuje da su crijevna mikrobiota i metaboličke/ekološke mreže dobivene iz divljih životinja mnogo stabilnije i da se mogu mnogo lakše prilagoditi na HSD-indukovane varijacije u ishrani u poređenju sa CLM crevnim ekosistemima, što zahteva dalje istraživanje. Vrijedi spomenuti i mogući utjecaj zajednice crijevnih gljivica na crijevnu bakterijsku mrežu na različite režime ishrane. Ranije studije su već sugerirale kako su potencijalne interakcije između bakterija i gljivica uključene u homeostazu imunološkog sistema domaćina i razvoj bolesti [82-85]. U tom kontekstu, CLM je dodatno ograničen njihovom nižom bakterijskom složenošću u poređenju sa divljim miševima, što može ometati uspostavljanje raznolike crijevne mikobiote [54]. Buduće studije će moći da odrede doprinos zajednica crevnih gljivica u okruženju crevne mikrobiote i imuniteta domaćina korišćenjem modela divljih životinja. Ukratko, naša studija pruža podatke o tome kako visok unos natrijuma utiče na prirodni, divlji ekosistem crijevnih mikroba u usporedbi s pripitomljenim crijevnim bakterijama CLM. Naša studija je pokazala da HSD ne utječe na bakterijske taksone i crijevnu mikrobiotu kod divljih miševa na isti način kao na pripitomljene crijevne mikrobiote iz CLM. Ova divergencija, kao što je ranije navedeno za druge režime ishrane ili stanja kao što su dijeta s visokim udjelom masti [54,55], ukazuje da su potrebna buduća istraživanja u prirodnim sistemima mišjih modela kako bi se rekapitulirao i procijenio utjecaj dijetetskih intervencija na složenije crijevne ekosisteme, kao kod ljudi.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem