Tandem masena spektrometrija visoke rezolucije identifikuje poseban gangliozidni obrazac u ranoj dijabetičkoj bubrežnoj bolesti pacijenata sa dijabetes melitusom tipa 2 Ⅱ
Dec 08, 2023
2.2. Detaljna strukturna analiza polizijaliranih vrsta povezanih s makroalbuminurijom od strane HCD MS/MS
HR-MS skrining je pokazao da gangliozid pacijenata sa makroalbuminurijom karakteriše povećan ukupni sadržaj sijalične kiseline. Ne manje od četiri pentasialo gangliotetraoze klase GQ1 identifikovane su u uzorku A3 sa visokom preciznošću mase. Jon na m/z 812.7{{10}}68, detektovan samo u spektru mase A3, pripisan je, prema proračunu mase, triput deprotoniranom i natriranom GQ1 (d18:1/18 :0). Kako bismo detaljno okarakterisali ovu vrstu povezanu sa makroalbuminurijom, izolovali smo jon na m/z 812.7068 i predali ga HCD MS/MS na HR u režimu negativnih jona. Ciljevi ovog tandem MS eksperimenta bili su: (i) istraživanje strukture lanca oligosaharida; (ii) potvrda sastava ceramida, koji je postavljen s obzirom na masu čitavih GQ1 molekula; (iii) prikupljanje specifičnih podataka o lokalizaciji Neu5Ac monosaharida duž kičme oligosaharida, što dovodi do diskriminacije izomera od pet najčešćih GQ1(d18:1/18:0) struktura (Slika 3) koje mogu biti prisutne u urinu pacijenata sa makroalbuminurijom.
Prikazan je spektar fragmentacije jona prekursora [M-4H+Na]3− detektovan na m/z 812.7068, generisan kombinovanjem TIC-a dobijenog tokom dva minuta pod promenljivom energijom sudara u opsegu od 30-80 eV. na slici 4.
Slika 3. Pet najčešćih izomera GQ1(d18:1/18:0): (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}) izomer; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) izomer; (C) GQ1c(d18:1/18:0)izomer; (D) GQ1d(d18:1/18:0) izomer; (E) GQ1e(d18:1/18:0) izomer.
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA INFEKCIJU BUBREGA
Podaci MS/MS potvrđuju (d18:1/18:0) sastav ceramida po Y0 na m/z 564.8704 i Y1 na m/z 726.5845 koji odgovara Glc-Cer sekvenci, kao i jonu unutrašnjeg cijepanja, S, na m/z 325.1828 koji odgovara C18:0 masnoj kiselini (Slika 5). Isto tako, dokumentovan je i ukupni status sijalicije molekula. Dakle, ion B1 detektovan na m/z 290.0868 i njegov sodirani par na m/z 312.0686 koji odgovara odvajanju jednog Neu5Ac ostatka od matičnog jona, zajedno sa distalnim elementom detektovanim na m/z 581.1807 i 60 m3 , potvrditi pojavu Neu5Ac-Neu5Ac veze.
Slika 5. Šema fragmentacije pomoću HCD MS/MS koju je doživio [M-4H++Na+ ] 3− prekursor na m/z 812.7068 i dijagnostički niz jona za strukturni izomer GQ1d.
Uzimajući u obzir najčešći položaj veze Neu5Ac ostataka bilo na unutrašnjem ili vanjskom Gal-u, postoji pet mogućih strukturnih kandidata za GQ1(d18:1/18:0), kao što je prikazano na slici 3. Međutim, ion na m/z 1032,3662 formiran dvostrukom vezom i unutrašnjim ukrštenim cijepanjem prstena i dodijeljen Z4 /Y0/ 2,4A2 , zajedno sa jonom otkrivenim na m/z 936,7894 kao Y2 / 3,5A1, podržava pričvršćivanje sva četiri Neu5Ac ostatka na unutrašnji Gal. Iako se pojava drugih strukturnih izomera ne može u potpunosti isključiti, ova dva fragmentirana jona pokazuju da je strukturni motiv konzistentan sa (D) kandidatom, koji odgovara d izomeru GQ1 (d18:1/18:0) , definitivno je prisutan u uzorku A3. Šema na Slici 5 prikazuje putanju fragmentacije koju doživljava ion prekursora koji odgovara GQ1d(d18:1/18:0).
Sljedeći polizijalični kandidat povezan s makroalbuminurijom za detaljnu strukturnu analizu je ion [M-3H+ ] 3− detektovan isključivo u spektru mase za skrining uzorka A3 na m/z 708,3379 i dodijeljen, na osnovu tačnog izračuna mase, do GT1(d18:1/18:0). Ovaj ion je izolovan i podvrgnut analizi fragmentacije pomoću tandem MS koristeći HCD. Spektar jona proizvoda generiran sumiranjem skeniranja dobijenih tokom 2 minute pri varijabilnim energijama sudara između 30 i 80 eV prikazan je na slici 6, zajedno sa kemijskom strukturom ove vrste i dodjeljivanjem glavnih signala. Mehanizam fragmentacije u korištenim MS/MS uvjetima, zajedno sa dijagnostičkim fragmentiranim jonima, prikazan je na slici 7. Da bi se poboljšala vidljivost svih dodijeljenih jona proizvoda, tabela 3 dopunjuje listu identificiranih signala u spektru prikazanom na slici 6.
Slika 6. Strukturna analiza pomoću (−) nanoESI HR HCD MS/MS prekursorskog jona [M-3H+ ] 3− detektovanog u uzorku A3 na m/z 708,3379, što je prema za proračun mase, odgovara GT1(d18:1/18:0). Vrijeme preuzimanja: 2 min; varijabilne energije sudara unutar 30–80 eV. Umetak: struktura GT1b(d18:1/18:0) izomera izvedena iz MS/MS podataka.
HCD fragmentacija je dovela do nekoliko sekvencijskih jona, koji su nastali kao rezultat glikozidnih veza i cijepanja unakrsnih prstenova. Ovi joni su veoma korisni za dodeljivanje celokupne sekvence ugljenih hidrata, uz identifikaciju pozicionih izomera GT1, i za potvrdu sastava ceramid aglikona.
Tip ceramida d18:1/18:0 otkriven je Y{4}} jonom na m/z 564.5353 i podržan od strane Glc-Cer sekvence identifikovane preko Y1 na m/z 726.5879. Nadalje, dodjela jona dokazuje prisustvo GT1 izoforme. Jon na m/z 493.1669, sa NeuAc–GalNAc sastavom, može nastati isključivo iz GT1, koji je karakteriziran sijalicijom GalNAc ostatka. Ostali fragmenti jona sugerišu postojanje strukturnog izomera GT1b u uzorku A3. Strukturu GT1b podržavaju svi joni koji nastaju iz nereducirajućeg kraja molekula, dokumentovani nizom Y-tipa, u pratnji dva Z jona, od kojih se jedan pojavljuje u manjoj količini (slika 6). Međutim, Y2 /B2 detektovan kao ion priličnog izobilja na m/z 888.6405 daje dokaze o Gal–Glc–Cer sekvenci, koja vjerovatno potiče od GT1a ili GT1b izomera nakon odgovarajuće desijalacije od strane Neu5Ac ili Neu5Ac-Neu5Ac unutrašnjeg Gal ili izomera koji sadrži nesupstituirani unutrašnji Gal, kao što je GT1d.
S druge strane, Y2 detektovan na m/z 734.5701 potvrđuje lokalizaciju disialo Neu5AcNeu5Ac elementa na unutrašnjem Gal-u, konfiguraciju koja je u skladu sa GT1b izomerom. Prisustvo distalne grupe je takođe dokazano jonom B2 na m/z 581.1828.
U HCD MS/MS, nekoliko signala se odnosi na parcijalnu desijalilaciju molekula, kao što su Y4 i/ili Y3 joni koji odgovaraju desijalilovanoj sekvenci Gg4Cer; međutim, ovi joni ne mogu ukazivati na mesta vezivanja Neu5Ac na neutralnom Gg4 glikanskom jezgru. Dodatno, signal na m/z 364.1243 koji odgovara Gal–GalNAc sekvenci koja je dodijeljena GT1b internom cijepanju B3/B1 jonu može se pripisati GT1c izomeru jer ovaj glikoform sadrži nesupstituirani terminalni Gal–GalNAc disaharid. Stoga, osim Y2, koji je povezan s GT1b, svi ioni mogu nastati iz drugih Neu5Ac pozicijskih izomera, kao što su GT1a, GT1, GT1c, ili čak rijetko prijavljeni GT1d. S druge strane, sam Y2 mogao bi biti rezultat događaja male vjerovatnoće, koji je također eliminirao Neu5Ac iz elementa ispitivanja povezanog sa unutrašnjim Gal-om.
S obzirom da, osim otkrivanja GT1, MS/MS podaci koji se odnose na cijepanje glikozidne veze nisu bili u mogućnosti nedvosmisleno dodijeliti druge GT1 izomere u mješavini A3, pažljivije smo analizirali jone cijepanja prstena kako bismo otkrili moguću unutarnju fragmentaciju koja podržava GT1b. Primijetili smo trostruko nabijeni ion niskog intenziteta na m/z 634,6067, što je u skladu sa 0,2 tipom cijepanja unakrsnog prstena na jednom od terminalnih ostataka sijalične kiseline, koji je u u slučaju GT1b vrsta, može se pojaviti od 0, 2X4 ili 0,2X3 ili oboje. Budući da je GT1b izomer općenito češći od GT1, slike 6 i 7 prikazuju dodjelu jona i šemu fragmentacije specifičnu za GT1b.
Zbog simetrije Gal-GalNAc-Gal lanca, ne postoji mogućnost potpunog isključivanja drugih strukturnih izomera. Iako HCD MS/MS podaci pokazuju postojanje GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18: 0) u uzorku A3 ne može se isključiti moguća pojava drugih GQ1 i GT1 izomera. Međutim, naši nalazi pokazuju da tri izomera-GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}) i GT1 (d18:1 /18:0) su definitivno prisutni u uzorku A3 i mogu se dalje proučavati kao molekularni markeri makroalbuminurije.
3. Materijali i metode
3.1. Kriterijumi za upis predmeta
Kako bi se razvila i validirala metoda, procijenjena je kohorta skrining pacijenata sa DM tipa 2 i zdravih kontrolnih subjekata u poprečnoj pilot studiji. Ukupno 30 pacijenata sa DM tipa 2 koji pohađaju ambulantu nefrologije i ambulantu dijabetesa i bolesti metabolizma podijeljeno je u 3 grupe premaalbumin u urinu/odnos kreatinina(UACR) kako slijedi: 10 pacijenata s normoalbuminurijom (A1, definiran kao UACR < 30 mg/g), 10 s mikroalbuminurijom (A2, UACR 30–300 mg/g) i 10 s makroalbuminurijom (A3, UACR > 300 mg/ g). Deset zdravih kontrolnih subjekata (C) koji idu u ordinaciju opće prakse na rutinske preglede bez poznate istorije bolesti bubrega i bez DM (isključeno vrijednošću HbA1c manjom ili jednakom 5,6%) također je uključeno u ovu studija
Svi pacijenti uključeni u studiju imali su minimalno 5-godišnje trajanje DM, stabilnu funkciju bubrega najmanje 2 godine, dobru kontrolu krvnog pritiska (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for biopsija bubrega(nedostatak hematurije i drugih uzroka proteinurije, bez brzog pada GFR).
3.2. Etička izjava
Studija je sprovedena u skladu sa Helsinškom deklaracijom, a protokol je odobrio Etički komitet za istraživanje Institucije (Board of Human Studies-"Victor Babes" Univerzitet medicine i farmacije Temišvar, br. 15/12.09.2016. Županijska hitna bolnica, br. 100/23.11.2016.). Svi pacijenti i kontrolne grupe pristali su da učestvuju u studiji potpisivanjem obrasca za informirani pristanak.
3.3. Laboratorijske procjene
Gangliozid urina kod 30 pacijenata sa DM tipa 2 istražen je u pilot studiji poprečnog presjeka komparativnim testom sa 10 zdravih kontrola. Biohemijski parametri su se odnosili na ureu i kreatinin u serumu, 24 h proteinuriju, UACR, sediment urina i urinokulturu. Svi pacijenti su bili negativni na urinarne infekcije. Sastav nativnih mješavina gangliozida je detektovan iz 24 sata prikupljenih uzoraka urina. Uzorci urina pacijenata i kontrola su kratkotrajno pohranjeni na -20 ◦C i odmrznuti prije analize.CKDdefinisano je prema KDIGO smjernicama za evaluaciju izbrinjavanje hronične bolesti bubrega. eGFR je izračunat korištenjemhronična bolest bubregaformula jednadžbe epidemiološke saradnje (CKD-EPI creatinine 2009 equation) [16].
3.4. Ekstrakcija i prečišćavanje gangliozida
Ekstrakcija gangliozida slijedila je metodu koju su razvili Svennerholm i Fredman [17] i modificirali Vukeli´c et al. [18]. Prethodno smo prilagodili ovaj protokol za ekstrakciju i pročišćavanje gangliozida iz tjelesnih tekućina i primijenili ga na gangliozide cerebrospinalne tekućine (CSF). Metoda je detaljno opisana u našoj prethodnoj studiji vezanoj za profiliranje i analizu fragmentacije gangliozida CSF masenom spektrometrijom [19]. Ukratko, lipidi su ekstrahovani dva puta primenom mešavine hloroforma (C)/metanola (M)/vode (W) do ukupnog zapreminskog omjera od 1:2:0.75 C/M/W, pri čemu „W“ odgovara do urina; stoga je mješavina sadržavala 4 mL C, 8 mL M i 3 mL uzorka urina. Hloroform i metanol analitičke čistoće nabavljeni su od Mercka (Darmstadt, Njemačka) i korišteni bez daljnjeg prečišćavanja. Nakon potpunog razdvajanja faza, slijedeći postupke opisane u [19], sakupljena je gornja faza koja sadrži polarne glikosfingolipide.
Pročišćavanje sakupljenih sirovih gangliozida je postignuto u nekoliko koraka [19]: uklanjanje precipitiranih proteinsko-solnih kompleksa, nakon čega slijedi centrifugiranje, gel filtracija na Sephadex G-25 koloni (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA ) kako bi se uklonili zagađivači male molekularne težine, i konačno, dijaliza preko noći na 4 ◦C protiv vode. Gangliozidi su ekstrahovani pod identičnim uslovima iz svih alikvota urina, dajući smeše A1 (normoalbuminurija), A2 (mikroalbuminurija), A3 (makroalbuminurija) i C (kontrolna).
3.5. Priprema uzoraka za masenu spektrometriju
Prečišćeni ekstrakti gangliozida A1, A2, A3 i C ispareni su do potpunog sušenja u sistemu SpeedVac Concentrator SPD 111 V (Savant, Dizeldorf, Njemačka) spojenom na vakuum pumpu. Za MS skrining, svaki suvi ekstrakt je otopljen u čistom metanolu da bi se dobio osnovni rastvor i čuvan na -20 ◦C. Prije MS analize, osnovni rastvori su centrifugirani u Sigma 2–16 model centrifugi (Sartorius AG, Göttingen, Njemačka). Za Orbitrap MS infuziju, radni uzorci sa koncentracijom od 5 pmol·µL −1 u čistom metanolu su dobijeni razblaživanjem alikvota iz matične otopine. Koncentracija gangliozida u rastvoru za infuziju izračunata je za prosečnu molekulsku masu od 2000 g mol-1.
3.6. Masena spektrometrija orbitrap sa nanoESI
MS eksperimenti su izvedeni na LTQ Orbitrap Velos Pro™ masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Njemačka) opremljenom offline nanoES izvorom ES 259 (Thermo Fisher, Bremen, Njemačka).
Instrument je hibridni maseni spektrometar koji kombinuje dva različita tipa analizatora mase i pruža mnoštvo prednosti: visoku osetljivost i tačnost, dobar kvalitet podataka i brzinu analize, potencijal za detekciju manjih komponenti u složenim smešama, nisku potrošnju uzoraka, i izbjegavanje unakrsnog ispitivanja i prenošenja sa uzorka na uzorak.
Prvi analizator je linearna kvadrupolna ionska zamka dvostrukog pritiska koja može izolirati ion sa specifičnim omjerom mase i naboja (m/z) i aktivirati ga unošenjem kinetičke energije u ion sa specifičnim m/z po redu. da izazove disocijaciju izazvanu sudarom. Drugi analizator je Orbitrap, koji se sastoji od cilindrične vanjske elektrode i bačvaste unutrašnje elektrode, zarobljavajući ione u kružnim orbitama oko unutrašnje elektrode. Ima odličnu moć razlučivanja i nudi mogućnost sekvenciranja složenih jonskih vrsta u višestepenim MS (MSn) eksperimentima pomoću efikasnih tehnika fragmentacije.
Borosilikatne kapilare (dužine 10 cm) su izvučene sa Sutter p-97 izvlakačem mikropipeta kako bi se dobile kapilare elektrosprej sa 10 µm veličinom vrha i dužinom konusa od 4 mm. Zapremina od 10 µL otopine u koncentraciji od 5 pmol·µL -1 u metanolu je uvedena u stražnji dio emitera, a u otopinu je umetnuta platinasta žica od 0,25 mm. Vrijednosti potencijala primijenjene na platinastu žicu i konus su trajno podešene kako bi se postigla efikasna jonizacija komponenti. NanoESI proces je pokrenut postavljanjem instrumentalnih parametara kako slijedi: nanoESI napon, 0,80 kV; napon konusa, 40–60 V; temperatura desolvatacije, 80 ◦C; S-lens RF nivo, 60%. Ove vrijednosti MS parametara su poboljšale ionizaciju i postojano raspršivanje i, u isto vrijeme, minimizirale fragmentaciju labilnog Neu5Ac ostatka vezanog za oligosaharidnu jezgru molekula gangliozida.
Svi maseni spektri (MS i tandem MS) snimljeni su u HR modu, detekciji načina negativnih jona i unutar opsega 200–2000 m/z. MS skenovi su napravljeni sa rezolucijom postavljenom na 60.000. Masenim spektrometrom je upravljao i kontrolisao LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Bremen, Nemačka), a MS prikupljanje i obrada podataka postignuti su korišćenjem softvera Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Bremen, Nemačka).
MS/MS eksperimenti su izvedeni u LTQ pomoću CID-a u kolizijskoj ćeliji koristeći helijum 5{1}} čistoće pri pritisku od 50 psi kao kolizioni plin. MS/MS skeniranja su snimljena sa rezolucijom postavljenom na 20,000. Selekcija jona i fragmentacija izvršeni su ručno. Prekursorski joni su odabrani unutar izolacijske širine od 1 m/z jedinice i fragmentirani pomoću HCD-a koristeći promjenjive energije sudara u rasponu od 30-80 eV kako bi se poboljšala pokrivenost fragmentiranih jona.
TIC i maseni spektri dobijeni kombinovanjem akumuliranih skeniranja obrađeni su pomoću softvera Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), koji omogućava ekstrakciju spektra, kao i njihovo izglađivanje i oduzimanje.
Prije eksperimenata, m/z skala je eksterno kalibrirana korištenjem namjenske reference komercijalno poznate kao Pierce® ESI Negative Ion Solution iz Thermo Scientifica (Waltham, MA, SAD). U režimu negativnih jona, ovaj standard je dao spektar sa poštenom ionskom pokrivenošću m/z opsega skeniranog u MS i tandem MS eksperimentima.
Za optimizaciju uslova nanoESI MS i MS/MS u režimu negativnih jona, poređenje i evaluaciju podataka, izmjerene su sljedeće standardne frakcije gangliozida, koje su komercijalno dostupne: GM1 (goveđi mozak); GD1a, GD1b, GT1b i GQ1b (svinjski mozak); i GM3 i GD3 (goveđe mlijeko) iz Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, SAD), kao i cijeli ekstrakt gangliozida iz goveđeg mozga, komercijalno poznat kao Cronassial mješavina, iz Abano Terme (Padova, Italija).
3.7. Skraćenica od Gangliosides
Za dodelu gangliozida, sistem skraćenica koji je 1980. godine uveo Svenner-holm [20], zajedno sa preporukama iz 1998. godine IUPAC-IUB Komisije za biohemijsku nomenklaturu, [21] je primenjen na sledeći način:
LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a ili GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 ili 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 ili 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.
3.8. MS interpretacija podataka
Budući da do danas nije dostupan namjenski kompjuterski softver, baze podataka ili drugi IT servisi koji bi pomogli u tumačenju gangliozidnog skrininga i tandemskih masenih spektra, u ovoj studiji otkriveni molekularni ioni su dodijeljeni vrstama gangliozida tačnim proračunom mase i na osnovu informacija koje smo prethodno prikupili o ovoj vrsti glikosfingolipida i poznatim putevima biosinteze. U tumačenju MS i MS/MS podataka i proračunima mase, pomogao nam je veliki inventar gangliozidnih molekularnih i fragmentiranih jona koje smo do sada identificirali i okarakterizirali u različitim ljudskim tkivima i tekućinama koristeći napredne MS pristupe. Ove strukture predstavljaju naše originalne baze podataka, koje su uključene u naše ranije objavljene studije [12,19,22–31]. Nove vrste prijavljene u ovom radu upotpunjuju naš trenutno postojeći zapis o gangliozidima.
Dodjela jona oligosaharidne kičmene sekvence generiranih u HCD MS/MS slijedila je općenito prihvaćenu nomenklaturu [24,25].
4. Zaključak
U ovoj studiji razvili smo pristup baziran na HR MS i tandem MS za određivanje gangliozida u DKD uporednim testom urinarnih ekstrakata normo, mikro- i makroalbuminuričnih pacijenata, kao i zdravih kontrola, obavljenim pod identičnim rastvorom. i instrumentalni uslovi. Konačni cilj našeg istraživanja bio je utvrditi promjene koje se javljaju u sastavu i strukturi renalnih gangliozida izraženih u DKD u odnosu na kontrolne skupine iu različitim stadijumima bolesti.
Visoka osjetljivost, reproducibilnost, rezolucija i masovna preciznost koju obezbjeđuje MS platforma optimizirana za ovu svrhu omogućila nam je da ustanovimo da stupanj sialilacije izražene vrste igra važnu ulogu u napredovanju bolesti, što predstavlja marker DKD-a. , čak iu stadijumu normoalbuminurije kod pacijenata sa DM tipa 2. Dodatno, uočene modifikacije u sastavu Cera pokazuju da se, pored strukture glikana, lipidni deo takođe može smatrati molekularnim otiskom prsta za DKD stadijume.
U naprednijoj fazi istraživanja, MS/MS by HCD je korišten za strukturnu analizu vrsta s mogućom ulogom biomarkera. U slučaju uzorka A3, molekularni joni, za koje je prema proračunu mase utvrđeno da odgovaraju GQ1(d18:1/18:0) i GT1(d18:1/18:{{1 0}}), respektivno, izolovani su i podvrgnuti fragmentaciji u ćeliji sudara instrumenta. Cilj ovih eksperimenata bio je prikupljanje informacija o detaljnoj strukturnoj konfiguraciji molekula. Optimizirani uvjeti sekvenciranja, posebno raspon energije sudara i tlak plina sudara, izazvali su specifične cijepanje glikozidnih veza, što je rezultiralo formiranjem fragmentiranih jona koji su detektovani kao relevantni signali u tandem spektru mase. Nekoliko jona je pronađeno kao dijagnostički za određene izomere vezane za lokalizaciju Neu5Ac dijelova u lancu ugljikohidrata molekula gangliozida. Na osnovu ovih strukturno informativnih sekvenci jona, otkrili smo da GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18: 0) izomeri su prisutni u uzorku A3 i povezani su sa makroalbuminurijom.
Dobijeni rezultati zahtijevaju daljnju validaciju nekih hipoteza u longitudinalnim studijama provedenim na većim kohortama kako bi se dokazala veza uzročnosti između složenosti gangliozida otkrivenih u urinuDKD pacijentii vrlo rano zahvaćenost bubrega u toku DM tipa 2, čak iu fazi normoalbuminurije. Međutim, smatramo da sadašnji nalazi otvaraju istraživački pravac ka istraživanju uloge sialilacije, O-acetilacije i O-fukozilacije gangliozida u progresiji bolesti, kao i njihovih modifikacija O-GalNAc i CH3COO−. Još jedan koristan aspekt ovih rezultata je mogući razvoj procedura za ranu dijagnozu DKD zasnovanih na profiliranju gangliozida upotrebom napredne masene spektrometrije.
Reference
1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS Uloga dijabetes melitusa i hipertenzije u hroničnoj bolesti bubrega.J. Ren. Inj. Prev.2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed]
2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, A.; Israni, AK; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. US Renal Data System 2020 Godišnji izvještaj o podacima: Epidemiologija bolesti bubrega u Sjedinjenim Državama.Am. J. Kidney Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed]
3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Ažuriranje patofiziologije i liječenja dijabetesne bolesti bubrega.J. Med. vanr.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed]
4. Vallon, V.; Thomson, SC Bubrežna funkcija u modelima dijabetičke bolesti: Tubularni sistem u patofiziologiji dijabetičkog bubrega.Annu. Rev. Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef]
5. Milas, O.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; et al. Proupalni citokini su povezani s oštećenjem podocita i proksimalnom tubulnom disfunkcijom u ranoj fazi dijabetesne bolesti bubrega kod pacijenata sa dijabetesom mellitusom tipa 2.J. Diab. Komplikovano.2020, 34, 107479. [CrossRef]
6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; et al. Nivoi mRNA povezane s podocitima u urinu koreliraju s disfunkcijom proksimalnih tubula u ranoj dijabetičkoj nefropatiji dijabetes melitusa tipa 2.Diabetol. Metab. Syndr.2017, 9, 31–43. [CrossRef]
7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Song, JH; Choo, YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Smanjenje gangliozida GM3 u dijabetičkim glomerulima pacova izazvanim streptozocinom.Life Sci.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef]
8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. a-serije Gangliozidi posreduju u efektima naprednih krajnjih proizvoda glikacije na proliferaciju pericita i mezangijalnih ćelija: Uobičajeni posrednik za mikroangiopatiju retine i bubrega?Dijabetes2005, 54, 220–227. [CrossRef]
9. Zador, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Uloga akumulacije glikosfingolipida u hipertrofiji bubrega kod dijabetes melitusa izazvanog streptozocinom.J. Clin. Investig.1993, 91, 797–803. [CrossRef]
10. Ene, CD; Penescu, M.; Anghel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Monitoring Diabetic Nephropathy by Circulating Gangliosides.J. Immunoass. Immunochem.2016, 37, 68–79. [CrossRef]
