Ishrana bogata fosforom izaziva pojačanu regulaciju ekspresije Bmp2 i Spp1 MRNA u bubrezima pacova

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Kako bismo razjasnili mehanizam razvoja nefrokalcinoze izazvane dijetom s visokim sadržajem fosfora (P), fokusirali smo se na proteine ​​povezane s kostima kao što su koštani morfogenetski protein 2 i osteopontin. Ova studija je istraživala efekte prehrane s visokim P na ekspresiju mRNA Bmp2 i Spp1 kod štakorabubreg. Wistar pacovi su podijeljeni u dvije grupe i hranjeni su kontrolnom prehranom (kontrolna grupa) ili ishranom s visokim sadržajem P (grupa sa visokim P).Bubregkoncentracije kalcija i P su značajno povećane u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom. Ekspresija mRNA i Bmp2 i Spp1 je značajno povećana u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom. Ovi rezultati pokazuju da dijeta s visokim P-om inducira povećanje mRNA Bmp2 i Spp1 ububreg.

Ključne riječi: dijeta bogata fosforom, nefrokalcinoza, Bmp2, Spp1,bubreg, pacov

Za više informacija kontaktirajte:emily.li@wecistanche.com

cistanche za liječenje bolesti bubrega

Uvod

Nefrokalcinoza je poremećaj karakteriziran naslagama kalcija (Ca) u bubrežnom parenhima. Fosfor u ishrani (P), posebno, je ključni faktor u razvoju ovog poremećaja. Pokazalo se da primjena dijete s visokim sadržajem P rezultira povećanom koncentracijom Ca ububregi depoziti Ca u bubrežnom parenhimu1-6）. Iako je učinak prehrane s visokim P na razvoj nefrokalcinoze bio u fokusu studija koje su u toku, malo se zna o mehanizmu odgovornom za razvoj ovog poremećaja. Stoga je potrebno pravovremeno rješavanje ovog pitanja.

Izvijestili smo da su nakon histološkog pregleda korištenjem transmisione elektronske mikroskopije uočeni kristali u obliku igle nalik hidroksiapatitu u bubrežnim tubulima pacova hranjenih hranom s visokim sadržajem P6, 7）. Mikroanaliza rendgenskih zraka pokazala je da se naslage Ca izazvane ishranom s visokim sadržajem P uglavnom sastoje od Ca i P7）. Ovi rezultati su otkrili da su naslage Ca izazvane ishranom s visokim sadržajem P oblik hidroksiapatita. Na osnovu ovog nalaza, pretpostavljamo da je razvoj nefrokalcinoze kontroliran mehanizmom sličnim onom u formiranju kosti. Stoga se ova studija fokusirala na proteine ​​povezane s kostima, kao što je koštani morfogenetski protein 2 (BMP2). BMP2 je osteogeni faktor koji pokazuje aktivnost koja indukuje osteogenezu8, 9）. Važno je napomenuti da je BMP2 identificiran kao faktor koji izaziva ektopičnukostformiranje10, 11). Stoga smo pretpostavili da ako BMP2 igra važnu ulogu u razvoju nefrokalcinoze, ekspresija ovog proteina ububregbi se dodatno regulisalo dijetom sa visokim P. Ova studija imala je za cilj da utvrdi da li ishrana sa visokim sadržajem P utiče na ekspresiju mRNA Bmp2 ububreg.

U međuvremenu, naša prethodna studija je objavila da dijeta s visokim sadržajem P povećava ekspresiju osteopontina (OPN) u bubrežnim tubulima koristeći imunohistokemijsku analizu, što sugerira da OPN može biti impliciran u razvoju depozita Ca izazvanih dijetom s visokim sadržajem P12）. Stoga smo istraživali promjene u ekspresiji mRNA Spp1 ububregtakođe.

Rezultati ove studije mogu pružiti vrijedan uvid u mehanizam koji je odgovoran za razvoj nefrokalcinoze izazvane ishranom s visokim sadržajem P.

materijali i metode

Životinje i dijeta.

Ova studija je odobrena od strane Komiteta za korištenje životinja Poljoprivrednog univerziteta u Tokiju, a sve životinje su održavane u skladu sa smjernicama univerziteta za njegu i korištenje laboratorijskih životinja (odobrenje br. 300049).

Važno je napomenuti da ženke pacova lakše razvijaju nefrokalcinozu nego mužjaci štakora13, 14）. Osim toga, izvijestili smo da prehrana s visokim P povećava ekspresiju OPN u bubrežnim tubulima ženki pacova12）. Ova studija je zatim koristila ženke pacova kao eksperimentalne životinje. Četiri sedmice stare ženke Wistar pacova (Clea Japan, Tokyo, Japan) bile su smještene u pojedinačnim kavezima od nehrđajućeg čelika. Tokom eksperimentalnog perioda, kavezi su bili smješteni u prostoriji sa kontrolisanim osvjetljenjem pod 12-h svjetla: tamni ciklus (svjetlo, 0800-2000 h), temperatura 22 ± 1 stepen, i relativna vlažnost 60 posto na 65 posto.

Sastav eksperimentalnih dijeta prikazan je uTable 1. Eksperimentalne dijete su pripremljene u odnosu na AIN{{0}}G dijetu15). Eksperimentalne dijete sadržavale su dvije različite koncentracije P (kontrolna dijeta, 0,3 posto; dijeta s visokim sadržajem P, 1,5 posto). Koncentracija P u ishrani s visokim sadržajem P postavljena je na 1,5 posto jer su naše prethodne studije primijetile da koncentracija P u ishrani od 1,5 posto izaziva

teška nefrokalcinoza6, 7, 12, 14）i visoka ekspresija OPN12）. Sve eksperimentalne dijete imale su istu koncentraciju Ca (0,5 posto). Koncentracije P i Ca, određene analizom eksperimentalne prehrane, prikazane su uTable 1. Prije početka istraživanja, svi pacovi su aklimatizirani 7 dana, a za to vrijeme su dobili slobodan pristup kontrolnoj ishrani i dejoniziranoj vodi. Nakon perioda aklimatizacije, pacovi su nasumično podijeljeni u dvije grupe sa sličnom srednjom tjelesnom težinom i 14 dana hranjeni ili kontrolnom prehranom (kontrolna grupa) ili ishranom s visokim sadržajem P (grupa sa visokim P). Pacovima je dat slobodan pristup dodijeljenoj eksperimentalnoj ishrani i deioniziranoj vodi tokom eksperimentalnog perioda. Na kraju eksperimentalnog perioda, pacovi su eutanazirani intraperitonealnim ubrizgavanjem mješavine anestetika (medetomidin, midazolam i butorfanol), te krvi ibubreguzeti su uzorci za analizu. Uzorci krvi su centrifugirani, a supernatanti su korišteni kao uzorci seruma. Bubrezi su uklonjeni, a bubrežna kapsula je odbačena. Serum ibubreguzorci su čuvani na -80 stepeni dok nisu bili potrebni za analizu. Desni bubreg je korišten za kvantitativnu analizu mRNA Bmp2 i Spp1, a lijevibubregje korišten za analizu koncentracija Ca i P.

Analiza minerala.

Uzorci eksperimentalnih dijeta ibubrezipepeli su na 550 stepeni tokom 48 h u muflnoj peći, a minerali su ekstrahovani u 1 mol/L HCl za analizu. Koncentracije Ca u eksperimentalnim dijetama ibubreziodređivani su atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom16）. Koncentracije P u eksperimentalnim dijetama ibubrezianalizirani su metodom Gomori17）.

Kvantitativna analiza mRNA Bmp2 i Spp1.

Ukupna RNK je izolirana iz homogeniziranog bubrega pomoću TRIzol reagensa (Life Technologies, Kalifornija, SAD) prema specifikacijama proizvođača. Količina i čistoća RNK procijenjeni su korištenjem NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, SAD). cDNA je sintetizovana korišćenjem SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix za qRT-PCR (Life Technologies), a zatim podvrgnuta kvantitativnoj RT-PCR u realnom vremenu koristeći SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Specifični prajmeri18-20) korišćeni su za analizu Bmp2 (naprijed, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; obrnuto, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCCGAAA-3'), Spp1 (naprijed, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; obrnuto, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3'), i Gapdh (naprijed, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; obrnuto, 5'-GCAT-CACCGCCATTT{6} }'). PCR reakcija u realnom vremenu izvedena je korištenjem StepOne sistema za PCR u realnom vremenu (Applied Biosystems, Kalifornija, SAD), a nivoi ekspresije mRNA su normalizovani na nivoe Gapdh mRNA. Vrijednost kontrolne grupe je 1,00.

Statistička analiza.

Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM za svaku grupu od 6 pacova. Nakon sprovođenja F-testa za utvrđivanje homogenosti varijansi, korišćen je Studentov t-test za utvrđivanje značajnih razlika između dve grupe. Ako homogenost varijansi nije bila jednaka, umjesto Studentovog t-testa korišten je Welchov t-test. Razlike su se smatrale značajnim na p ＜ 0.05

Rezultati

Analiza tjelesne težine, unosa hrane i seruma.

Konačna tjelesna težina i unos hrane su značajno smanjeni u grupi sa visokim P u odnosu na kontrolnu grupu (Table 2). Bubregtežine i koncentracije minerala.Bubregmokre i suhe težine su značajno povećane u grupi sa visokim P u odnosu na kontrolnu grupu (Table 3). BubregKoncentracije Ca i P su takođe značajno povećane u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom.

Ekspresija mRNA bubrega Bmp2 i Spp1.

Nivoi Bmp2 mRNA u grupi sa visokim P su značajno povećani u poređenju sa kontrolnom grupom (Fig.1A). Ekspresija mRNA Spp1 je također značajno povećana u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom (Fig. 1B).

Diskusija

Jedan od dobro poznatih fizioloških efekata ishrane sa visokim P je razvoj nefrokalcinoze. U ovoj studiji, koncentracije Ca i P u bubrezima su povećane u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom, što je u skladu sa rezultatima prethodnih studija1-6）. Prethodne studije su objavile da su histološki rezultati nefrokalcinoze bili pozitivno povezani sa koncentracijama Ca i P u bubrezima4, 21）. Stoga, iako u ovoj studiji nije izvršeno histološko promatranje bubrega, povećane koncentracije Ca i P u bubregu ukazuju da je nefrokalcinoza izazvana ishranom s visokim sadržajem P.

Budući da se depoziti Ca izazvane ishranom s visokim sadržajem P općenito smatraju oblikom hidroksiapatita6, 7）, pretpostavili smo da je razvoj nefrokalcinoze kontroliran mehanizmom sličnim onom kod osteogeneze. Stoga smo ispitali efekte prehrane s visokim P na ekspresiju Bmp2 mRNA u bubrezima. Rezultati

pokazalo je da je ekspresija renalne Bmp2 mRNA povećana u grupi sa visokim P i da dijeta sa visokim P izaziva pojačanu regulaciju ekspresije Bmp2 mRNA u bubrezima. Ovaj nalaz može pomoći u objašnjavanju mehanizma razvoja nefrokalcinoze izazvane ishranom s visokim P. Iako nedostaju definitivni dokazi koji podržavaju našu hipotezu, jedna od mogućnosti je da je ekspresija osteogenih transkripcionih faktora povišena u kalcificiranim regijama u bubregu. BMP2 indukuje diferencijaciju osteoblasta i formiranje kostiju regulacijom osteogenih faktora transkripcije kao što su Osterix, Runx2 i Msx28, 9）; stoga, BMP2 može promovirati nefrokalcinozu putem regulacije takvih osteogenih faktora transkripcije. Trenutno, detaljna uloga BMP2 u razvoju nefrokalcinoze ostaje nejasna. Osim toga, budući da je u ovoj studiji mjerena samo ekspresija mRNA Bmp2, nije poznato da li postoji razlika u ekspresiji BMP2 proteina. Međutim, naši rezultati sugeriraju mogući mehanizam kojim promjene u ekspresiji BMP2 igraju snažnu ulogu u patogenezi nefrokalcinoze izazvane ishranom s visokim P.

Ova studija se fokusirala na ekspresiju mRNA Spp1 pored ekspresije mRNA Bmp2. Naša prethodna studija koja je koristila imunohistohemijsku analizu ukazala je na visoke nivoe ekspresije OPN u bubrežnim tubulima pacova koji su hranjeni hranom sa visokim sadržajem P12）. Ova studija je otkrila da je ekspresija mRNA Spp1 povećana za približno 10- puta u grupi sa visokim P. Rezultati sadašnjih i prethodnih studija otkrivaju da dijeta s visokim P izaziva ekspresiju OPN u bubrezima. S druge strane, drugi istraživači su pokazali da je OPN kao kameni matriks važan faktor u formiranju urinarnog kamenca22, 23）; stoga je naš prethodni izvještaj sugerirao da OPN može imati ulogu matriksne komponente u formiranju naslaga Ca izazvanih ishranom s visokim sadržajem P12）. Međutim, Paloian et al. nedavno su izvijestili da OPN igra ulogu u prevenciji nefrokalcinoze izazvane visokom P dijetom kod OPN KO miševa24）. Naime, čini se da je fiziološka uloga OPN-a na nefrokalcinozu izazvanu visokom P dijetom supresija, a ne promocija kalcifikacije ububreg. Štaviše, opisani su prethodni izvještaji da se nivoi OPN povećavaju kako bi se nadoknadila daljnja patološka ektopična kalcifikacijabubregi vaskulatura jer je OPN pojačan na mjestu patološke kalcifikacije.

Kao što je gore spomenuto, ova studija sugerira važnost BMP2 i OPN-a u nefrokalcinozi uzrokovanoj dijetom s visokim P. Važno je napomenuti da se smatra da su efekti BMP2 i OPN-a na razvoj nefrokalcinoze regulirani različitim mehanizmima. Ove mehaničke razlike mogu ukazivati ​​na to da je osnovni mehanizam nefrokalcinoze komplikovan. Sljedeća stvar koju treba uzeti u obzir je da je inhibicija rasta mogla utjecati na ekspresiju mRNA Bmp2 i Spp1 ububregjer je ova studija uočila smanjenje konačne tjelesne težine u grupi s visokim P. Zapažanja u našim prethodnim12） i sadašnjim studijama mogu pomoći u objašnjavanju ove tačke. Ranije smo prijavili povećanu ekspresiju proteina OPN u bubrežnim tubulima pacova čiji rast

nije inhibirana dijetom s visokim P12）. Štaviše, ova studija je pokazala inhibiciju rasta u grupi sa visokim P, ali visoke nivoe ekspresije Spp1 mRNA u bubrezima. Na osnovu ovih zapažanja, čini se da ova studija ima mali učinak na inhibiciju rasta ekspresije mRNA Bmp2 i Spp1. Međutim, detalji o odnosu između inhibicije rasta i ekspresije gena Bmp2 i Spp1 ostaju nejasni. Stoga su potrebna dalja istraživanja kako bi se razjasnila ova tačka.

U zaključku, da bi se razjasnio mehanizam razvoja nefrokalcinoze izazvane ishranom sa visokim sadržajem P, ova studija je utvrdila efekte ishrane sa visokim sadržajem P na ekspresiju mRNA Bmp2 i Spp1 ububreg. Koncentracije Ca i P u bubrezima bile su značajno povećane u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom. Nadalje, ekspresija mRNA Bmp2 i Spp1 je značajno povećana u grupi sa visokim P u poređenju sa kontrolnom grupom. Ovi rezultati ukazuju na to da ishrana s visokim P potiče regulaciju ekspresije mRNA Bmp2 i Spp1 ububreg.

Reference

1) Hitchman AJ, Ima li SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: kalcifikacija bubrega izazvana fosfatom kod pacova. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2) Parker HE: Međusobne veze magnezijuma i fosfora na adekvatnim ili prekomjernim nivoima fosfora u ishrani. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3) Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Nefrokalcinoza izazvana fosforom i funkcija bubrega kod ženki pacova. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Koncentracije i odnos kalcijuma i fosfora u ishrani utiču na razvoj nefrokalcinoze kod ženki pacova. J Nutr 132: 252-256, 2002

5) Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Efekti dijetetskih suplemenata kalcija na metabolizam kostiju, koncentraciju minerala u bubrezima i funkciju bubrega kod pacova hranjenih hranom bogatom fosforom. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6) Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Ishrana sa visokim sadržajem fosfora brzo izaziva nefrokalcinozu i proksimalne tubularne povrede kod pacova. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Efikasnost tradicionalne kineske medicine, Wulingsan, u suzbijanju razvoja nefrokalcinoze izazvane visokom fosfornom ishranom kod mladih pacova. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Ciljani poremećaj u mišjim ćelijama otkriva varijabilne potrebe za Smad4 u transformaciji signalizacije vezanog za faktor rasta. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 reguliše Osterix preko Msx2 i Runx2 tokom diferencijacije osteoblasta. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR : Kost: Formiranje autoindukcijom. Nauka 150: 893-899, 1965

11） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Novi regulatori formiranja kosti: Molekularni klonovi i aktivnosti. Nauka 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: dijeta bogata fosforom inducira ekspresiju osteopontina bubrežnih tubula kod pacova. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Cousins ​​FB, Geary CPM: kalcifikacija bubrega određena spolom kod pacova. Priroda 211 : 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Polne razlike u koncentraciji minerala u bubrezima i izlučivanju albumina u urinu kod pacova koji su dobili hranu bogatu fosforom. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 prečišćena dijeta za laboratorijske glodare: Konačni izvještaj ad hoc komiteta za pisanje Američkog instituta za ishranu o reformulaciji AIN-76prehrane za glodavce . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16）Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Određivanje kalcijuma i magnezijuma u serumu, urinu, ishrani i stolici atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: Modifikacija kolorimetrijskog određivanja fosfora za upotrebu sa fotoelektričnim kolorimetrom. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Prenil grupa doprinosi aktivnostima fitoestrogena 8-prenynaringenina u poboljšanju formiranja kostiju i inhibiranje resorpcije kosti in vitro. Endokrinologija 154: 1202-1214, 2013

19）Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Protok tekućine stimulira ekspresiju osteopontina i koštanog sijaloproteina u stromalnim stanicama koštane srži na vremenski ovisan način. Kost 36: 1047-1055, 2005

20）Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Karakterizacija onkostatin M receptorskog kompleksa pacova koji liči na ljudski, ali se razlikuje od mišjeg citokinskog receptora. PLoS One 7 : e43155, 2012

21）Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Utjecaj odnosa kalcija i fosfora u ishrani na izlučivanje minerala i nefrokalcinozu kod ženki pacova. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Molekularno kloniranje i sekvenciranje cDNK koja kodira protein urinarnog kamena, koji je identičan osteopontinu. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Struktura i ekspresija mRNA koja kodira protein urinarnog kamena (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24）Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontin testira protiv nefrokalcinoze indukovane visokom fosfatom i vaskularne kalcifikacije. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25）Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontin je povišen tokom formiranja neointima u arterijama pacova i nova je komponenta ljudskih aterosklerotskih plakova. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993