Ekstrakt Herba Cistanche poboljšava status mitohondrijalnog glutationa i disanje u srcima pacova, sa mogućom indukcijom odvajanja proteina

Uvod

Reperfuzija prethodno ishemijskog miokarda uzrokuje niz mitohondrijalnih promjena, uključujući povećanu proizvodnju reaktivnih vrsta kisika (ROS), Ca2+preopterećenje, i pad proizvodnje adenozin trifosfata (ATP), što sve može dovesti do nekroze i/ili apoptoze posredovane ćelijske smrti (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Kako mitohondrije igraju ključnu ulogu u određivanjuU sudbini kardiomiocita nakon izazova ishemijom/reperfuzijom (I/R), zaštita od I/R ozljede miokarda stoga treba biti usmjerena na očuvanje strukturnog i funkcionalnog integriteta mitohondrija. Održavanje mitohondrijalnog energetskog metabolizma nakon I/R izazova je posebno važno jer kontraktilna funkcija srca gotovo u potpunosti ovisi o ATP-u koji stvara mitohondrije. Kardiomiociti koji su živi, ​​ali se ne kontrahiraju, vrlo su malo korisni.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA JAČANJE IMUNITETA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, cijela osušena biljkaCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) je parazitska biljka koja raste uglavnom u pustinjskim područjima sjeverne i sjeveroistočne Kine. Herba Cistanche, klasifikovana kao biljka koja osnažuje Jang u kineskoj medicini, prepisuje se za nedostatak bubrega, ženski sterilitet i zatvor koji nastaje zbog suhoće crijeva kod senilnih pacijenata (Chen, 1998). Dosadašnje studije u našoj laboratoriji su pokazale da metanolekstrakt Herba Cistanchepovećava kapacitet proizvodnje miokarda ATP (Leung & Ko, 2008) i štiti od I/R ozljede miokarda kod pacova (Leung, 2006). Dok je stimulacija kapaciteta generisanja ATP-a bila uporedna sa povećanjem mitohondrijalnog transporta elektrona (Leung & Ko, 2008), kardioprotekcija protiv I/R ozljede koju je pružio tretman Herba Cistanche bila je povezana sa smanjenjem trošenja ATP miokarda (Leung, 2006). U ovoj studiji, da bismo definisali ulogu mitohondrija u kardioprotektivnom delovanju Herba Cistanche, istraživali smo efekat tretmana Herba Cistanche na status mitohondrijalnog glutationa, sadržaj Ca2+, membranski potencijal i brzinu disanja u srcima pacova. .

materijali i metode

Biljni materijal

Herba Cistanche je kupljena od lokalnog (sa sjedištem u Hong Kongu) trgovca biljem (Lee Hoong Kee). Dobavljač je potvrdio autentičnost biljke, a uzorak vaučera (HKUST00301) deponovan je na Odsjeku za biohemiju Univerziteta nauke i tehnologije u Hong Kongu (HKUST). Ekstrakcija biljke metanolom je sprovedena na osnovu prethodnih studija koje su pokazale da je takav ekstrakt pojačao stvaranje mitohondrijalnog ATP-a i zaštitio od I/R ozljede u srcima pacova (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Ukratko, Herba Cistanche (400 g) je isječena na male komade i ekstrahirana zagrijavanjem pod refluksom u 300 mL metanola na 60 stepeni u trajanju od 2 sata, kao što je prethodno opisano (Leung & Ko, 2008). Postupak je ponovljen dva puta. Sakupljeni ekstrakt je osušen isparavanjem rastvarača pod sniženim pritiskom; prinos je bio 42% (w/w) u odnosu na količinu sirovog bilja. Ekstrakt je čuvan na 4 stepena do upotrebe. Iako se kinesko bilje tradicionalno ekstrahira vodom za oralnu konzumaciju, metanol je korišten u našoj ranijoj studiji radi praktičnosti u obradi i skladištenju uzoraka (Yim & Ko, 2002), a mi smo otkrili da je ekstrakcija metanola zadovoljavajuća u svim aspektima.

Njega životinja i liječenje lijekovima

Odrasle ženke Sprague-Dawley pacova (8-10 sedmica starosti; 200-230 g) bile su smještene u prostoriji s kontroliranom vlažnošću, s ciklusom tamno/svjetlo od 12 sati, na približno 22 stepena, i dozvoljena im je hrana i voda ad libitum. Životinje su nasumično raspoređene u različite grupe, sa pet životinja u svakoj grupi. Pacovi su primiliEkstrakt Herba Cistancheintragastrično ({{0}}.2 g/mL u vodi) na 0.5g/kg ili 1.0 g/kg 3 uzastopna dana. Kontrolne (netretirane) životinje su primale samo vodu. Dvadeset četiri sata nakon posljednje doze, tkivo srčanih komora je uzeto od anesteziranih životinja za biohemijsku analizu. Sve eksperimentalne protokole odobrio je Odbor za istraživačku praksu, HKUST.

Priprema mitohondrijalnih frakcija

Mljeveno srčano ventrikularno tkivo (~{{0}}}.6g) homogenizirano je u 10- puta (w/v) višku ledeno hladnog pufera saharoze [0,32M saharoze, 1mM etilen diamin tetraoctene kiseline (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] pomoću teflon-staklenog homogenizatora, na 4000 o/min, sa 25-30 poteza. Mitohondrijske pelete su pripremljene od homogenata tkiva centrifugiranjem na 800×g na 4 stepena u trajanju od 30 minuta, a čistoća je određena mjerenjem relativne specifične aktivnosti sukcinat dehidrogenaze i laktat dehidrogenaze u supernatantu, odnosno peletu, kao što je prethodno opisano (Evans, 1992). Mitohondrijske pelete su suspendovane u 1 mL pufera za homogenizaciju.

Mjerenje nivoa mitohondrijalnog redukovanog glutationa i oksidiranog glutationa

Nivoi mitohondrijalnog redukovanog glutationa (GSH) određeni su enzimski korištenjem 5,59-ditiobis(2- nitrobenzojeve kiseline) (DTNB) i glutation reduktaze (GR), u protokolu modificiranom od Griffith (198{{17} }). Alikvot (210 µL) mitohondrijske frakcije je pomiješan sa 90 µL 10% (v/v) 5-sulfosalicilne kiseline (SSA) i smjesa je centrifugirana na 600×g 10 min. Za mjerenje nivoa oksidiranog glutationa (GSSG), količine od 100 µL SSA supernatanta su pomiješane sa 10 µL 20% (w/v) 2-vinilpiridina i 10 µL 60% (v/v) trietanolamina u epruvetama za mikrofuge. Svaka epruveta je ostavljena da odstoji na sobnoj temperaturi najmanje 1 sat. Reakciona smeša koja sadrži 0,63 mM DTNB i 0,053 mM NADPH (redukovanog nikotinamid adenin dinukleotid fosfata) u fosfatnom puferu (0,1 M, sa 5 mM Na2 EDTA; pH 7,5) je prethodno inkubirana na 30 stepeni 2 min. Alikvot (30 µL) supernatanta uzorka SSA (ukupni glutation) ili GSSG uzorka je dodan u bunar mikrotitarske ploče 96-jažice i 180 µL prethodno zagrijane reakcione smjese, koja sadrži 0,525U/ mL GR, je sljedeći dodan. Promjene apsorpcije na 412 nm praćene su spektrofotometrijski tokom 5 minuta. Koncentracije GSH i GSSG su procijenjene iz kalibracijskih krivulja korištenjem GSH i GSSG [rastvorenog u 3% (w/v) SSA] kao standarda i izražene kao nmol/mg proteina. Nivoi GSH su procijenjeni oduzimanjem dvostruke količine GSSG od ukupnog GSH.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mjerenje mitohondrijalnog sadržaja Ca2+

Sadržaj mitohondrijalnog Ca{{0}} mjeren je pomoću Ca2+-osjetljive fluorescentne sonde, Fluo{2}}N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) korištenjem Victor2 Multi-Label Counter (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Finska), kako je opisano u Menze et al. (2005). Konstante disocijacije Ca2+ (vrijednosti Kd) određene su korištenjem kompleta za kalibraciju Ca2+ važećeg u rasponu koncentracija 1–1000 µM; procijenjene vrijednosti Kd bile su 90–100 µM, sa visokom pouzdanošću, prema podacima proizvođača kompleta. Alikvot (25 µL) mitohondrijalne frakcije (0,5 mg proteina/mL konačna koncentracija) je pomiješan sa 25 µL inkubacionog pufera {100 mM KCl i 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propansulfonske kiseline]; pH7,2} u crnoj mikrotitarskoj ploči 96-jažica. Smeša je inkubirana na 25 stepeni 15 min; Zatim je dodano 25 µL digitonina (50 µg/mL) i 25 µL Fluo-5N AM estera (1 µM u 0,005% (w/v) Pluronic F-127). Olakšavajući membransku permeaciju, digitonin je posredovao u mitohondrijskom ulasku fluorescentne boje. Otkrili smo da su nivoi Fluo-5N u mitohondrijalnim preparatima srca pacova povećani 20-putu u prisustvu digitonina. Reakcione smeše su inkubirane na 25 stepeni 30 minuta, a očitavanja fluorescencije su merena na talasnoj dužini ekscitacije od 488 nm i talasnoj dužini emisije od 532 nm. Sadržaj mitohondrijalnog Ca2+ je procijenjen korištenjem kalibracione krive i izražen kao µmol/mg proteina.

Mjerenje potencijala mitohondrijske membrane

Potencijal membrane (ΔΨm) je procijenjen metodom modificiranom u odnosu na Bonavita et al. (2003), koristeći fluorescentnu boju, lipofilnu kationsku sondu 5,596,69- tetrakloro-1,193,39-tetraetilbenzimidazolilkarbocijanin jodid, uobičajeno nazvan JC-1. Alikvoti (50 µL) mitohondrijalnih frakcija (prilagođenih 1 mg proteina/mL) su inkubirani na 37 stepeni sa 50 µL rastvora supstrata (koji sadrži 6 mM piruvata i 6 mM malata), 25 µL prethodno tretiranog rastvora adenozin difosfatenozin 0MA (3) i 25 µL 3 µM JC-1, u mraku. Vrijednosti ΔΨm su dobijene mjerenjem fluorescencije na 535 nm (FL1) naspram 580 nm (FL2), koristeći Victor2 MultiLabel Counter. JC-1 formira agregate u mitohondrijama, što rezultira visokim vrijednostima fluorescencije FL2 i ukazuje na normalan mitohondrijski potencijal. Gubitak ΔΨm dovodi do smanjenja fluorescencije FL2 (JC-1 agregati u manjoj mjeri) i istovremenog povećanja FL1 fluorescencije (od JC-1 monomera). Podaci su izraženi kao omjeri vrijednosti fluorescencije FL1/FL2. Karbonil cijanid m-klorofenilhidrazon (CCCP), ΔΨm-kolapsirajući agens, korišten je za validaciju testa.

Mjerenje mitohondrijalnog disanja

Brzina respiracije mitohondrija izmjerena je na 37 stepeni pomoću Hansatech Oxygraph-Plus instrumenta opremljenog kisikom tipa Clark (Sarasota, FL, SAD). Mitohondrijalne frakcije (0.6mg proteina/mL) suspendovane su u puferu za disanje koji sadrži 125mM KCl, 20mM MOPS, 10mM Tris, 0.5mM etilen glikol tetrasirćetne kiseline (EGTA) i 2mM KH2PO4; pH 7.2. Nakon inkubacije na 37 stepeni tokom 2 min, svaki uzorak je dobio 50 µL rastvora supstrata (5 mM piruvata i 5 mM malata). Brzine disanja su mjerene u prisustvu (stanje 3) 1 mM ADP i nakon fosforilacije svih ADP u ATP (stanje 4). Odnos stope respiracije Stanje 3:Stanje 4 je indeks respiratorne kontrole, koji ukazuje na čvrstoću sprege između disanja i fosforilacije (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Prije dodavanja otopine supstrata, mjerena je brzina disanja stanja 1 do početka respiracije stanja 2, a brzina respiracije stanja 2 procijenjena je prije dodavanja ADP-a.

Statistička analiza

Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) za višestruka poređenja grupa. Vrijednosti najmanje značajne razlike (LSD) korištene su za identifikaciju značajnih razlika između dvije grupe kada su p vrijednosti bile < 0.05.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

Kao što je prikazano na slikama 1 i 2, tretman metanolomekstrakt Herba Cistanche({{0}}.5 ili 1.0g/kg/dan×3) značajno je poboljšao status mitohondrijalnog glutationa u srcima štakora, što je dokazano povećanjem nivoa GSH (11-30%) u zavisnosti od doze (11-30%) i smanjenjem u GSSG nivoi (31%).

Liječenje Herba Cistanche dozno je snizilo nivoe mitohondrijalnog Ca2+ u srcima pacova u poređenju sa kontrolama; supresija je bila 41% pri dozi od 1.0 g/kg (slika 3).

Tretman Herba Cistanche povećao je mitohondrijalni ΔΨm, što je dokazano smanjenjem (14–16%) u omjeru FL1/FL2. CCCP (100 µM) je izazvao ΔΨm kolaps, na šta ukazuje povećanje omjera FL1/FL2 (Slika 4).

Herba Cistanche tretmanpoboljšano mitohondrijalno disanje, što je dokazano značajno višom stopom disanja stanja 3 (84%) kod ispitivanih životinja u poređenju sa kontrolama (Tabela 1). Nivoi respiracije stanja 2 i stanja 4 su povećani za 47 odnosno 80%, ali je stimulacija disanja u stanju 4 u potpunosti potisnuta 1mM gvanozin-5'-difosfatom, inhibitorom razdvajanja proteina 2/3. Tretman Herba Cistanche nije utjecao na indeks respiratorne kontrole, kao što je procijenjeno omjerom stope disanja stanja 3/stanje 4.

Diskusija

Mitohondrije izolovane iz srca pacova tretiranih Herba Cistanche pokazale su poboljšan status glutationa, na šta ukazuju povećani nivoi GSH i smanjeni nivoi GSSG. Održavanje redoks statusa mitohondrijalnog glutationa je kritično za kardioprotekciju od I/R ozljede (Chiu & Ko, 2003). Sadržaj citosolnog Ca2+ se povećava tokom ishemije miokarda, putem apsorpcije Ca2+ uniportera unutrašnje membrane (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), što dovodi do mitohondrijalnog Ca{{6} } akumulacija. Naši rezultati pokazuju da je tretman sa ekstraktom Herba Cistanche poboljšao redoks status mitohondrijalnog glutationa i smanjio nivo mitohondrijalnog Ca2+, što može pružiti zaštitu od I/R ozljede miokarda (Leung, 2006). Nemogućnost liječenja Herba Cistanche, pri višoj dozi od 1,0 g/kg, da dodatno smanji nivoe GSSG i Ca2+, može biti povezana sa postojanjem samoograničavajućih regulatornih mehanizama koji utiču na redoks potencijal glutationa i status kalcija u mitohondrijama.

Mitohondrije stvaraju elektrohemijski protonski gradijent preko unutrašnje membrane, transportom elektrona. Ovaj gradijent koristi ATP sintaza za fosforilaciju ADP-a u ATP. Smanjen potencijal mitohondrijske membrane, kao kod hipoksije/reoksigenacije nakon ozljede kultiviranih kardiomiocita (Chiu et al., 2008), rezultira smanjenjem stvaranja ATP-a. Liječenje Herba Cistancheom, koje može povećati potencijal mitohondrijalne membrane miokarda, može povećati stvaranje ATP-a, posebno tokom postishemične reperfuzije. Opet, postojanje samoograničavajućih regulatornih mehanizama može objasniti zašto efekti tretmana Herba Cistanche na potencijal mitohondrijalne membrane nisu zavisni od doze.

Tretman Herba Cistancheom je uvelike povećao stopu disanja State 3 u mitohondrijama srca pacova, što je procijenjeno potrošnjom kisika. Ovaj nalaz je u skladu s rezultatima dobivenim iz in vitro i situ mjerenja mitohondrijalnog kapaciteta proizvodnje ATP-a (Leung & Ko, 2008). Intrigantno, iako je tretman Herba Cistanche smanjio stabilan nivo miokardnog ATP-a (podaci nisu prikazani), tretman je poboljšao stvaranje mitohondrijalnog ATP-a. Uključenost nepovezanog disanja može objasniti ova neskladna zapažanja. Nevezana oksidativna fosforilacija nastaje kada se protoni pomiču preko unutrašnje membrane mitohondrija natrag u mitohondrijsku matricu, čime se raspršuje membranski potencijal formiran lancem transporta elektrona. Ovo rezultira smanjenjem protonske pokretačke sile koja pokreće formiranje ATP-a (Garvey, 2003). Kao posljedica toga, koncentracija Ca2+ i proizvodnja ROS u mitohondrijima su dramatično oslabljeni (Teshima et al., 2003). Ovaj prijedlog je u skladu sa rezultatima ove studije, koja je pokazala smanjenje mitohondrijalnog Ca2+ nivoa u srcima tretiranim Herba Cistanche. Što se tiče nespregnutog disanja, sinteza odspojnih proteina (UCP) može biti izazvana tretmanom Herba Cistanche. Poznato je da UCP razdvajaju oksidativnu fosforilaciju i ekspresiju UCP1 u srcima transgenih miševa zaštićenih od oštećenja miokarda izazvanog I/R (Hoerter et al., 2004). Efekat razdvajanja UCP-a bio je inhibiran purin nukleotid difosfatima i trifosfatima (kao što su ADP, ATP, gvanozin difosfat (GDP) i GTP) (Echtay et al., 2002). U ovoj studiji, mitohondrijski parametri kao što su membranski potencijal i brzina disanja mjereni su u prisustvu ADP-a (kao supstrata); efekat razdvajanja UCP-a je stoga inhibiran. Međutim, kada je izmjerena stopa disanja mitohondrijalnog stanja 4 u odsustvu ADP-a, ova stopa je bila viša u mitohondrijama pripremljenim od srca tretiranih Herba Cistanche nego u srcima netretiranih kontrola. Stopa disanja u stanju 4 odražava potrošnju kiseonika u mitohondrijama kada protoni cure natrag u mitohondrijsku matricu preko mehanizma koji ne uključuje F1 F0 -ATPazu (Garvey, 2003). Moguća uključenost UCP-a u povećanje respiracije stanja 4 izazvano Herba Cistanche podržano je nalazom da je ovo poboljšanje potisnuto BDP-om (Bento et al., 2007).

U zaključku, tretman sa Herba Cistanche može poboljšati status mitohondrijalnog glutationa, smanjiti nivo mitohondrijalnog Ca2+ i povećati potencijal mitohondrijske membrane i brzinu disanja u srcima pacova. Poboljšanje statusa mitohondrijalnog glutationa i funkcionalne sposobnosti, te navodna indukcija UCP-a, mogu biti povezani sa kardioprotekcijom koju pružajuHerba Cistanche tretmannakon I/R povrede.

PRIRODNA BILJKA CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT CISTANCHE PHGS75% ECH 30% ACT 12%