Zelena sinteza i karakterizacija nanočestica željeza sintetiziranih iz vodenog ekstrakta lišća Vitex Leucoxylon i njegove biomedicinske primjene

sažetak:Za dobijanje vodenog ekstrakta korišćena je metoda hladne ekstrakcijeVitex leucoxylonlistovi u omjeru 1:10. Nanočestice gvožđa (FeNP) su sintetizovane korišćenjem vodenog ekstrakta listaV. leucoxylonkao redukciono sredstvo. Fitomedicinski pristup korišten je za pravljenje FeNP-a miješanjem 1 mL biljnog ekstrakta sa 1 mM željeznog sulfata. Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM), Fourier-transformska infracrvena spektroskopija (FTIR), ultraljubičasto-vidljiva spektroskopija (UV-Vis) i energetski disperzivna rendgenska spektroskopija korišteni su za ispitivanje sintetiziranih FeNP-ova. Reakcija redukcije je prikazana promjenom boje otopine, a formiranje crne boje potvrđuje da su nastali FeNP. Najveći apsorpcijski vrh (max) pronađen je na 395 nm u UV-Vis spektralnoj analizi. FTIR spektri odV. leucoxylonvodeni ekstrakt lista pokazao je pomake u nekim vrhovima, odnosno 923,96 cm−1 i 1709,89 cm−1, sa funkcionalnim grupama karboksilnih kiselina, nezasićenih aldehida i ketona, koji su nedostajali u FTIR spektrima FeNPs i odgovorni su za formiranje FeNPs. FeNPs prečnika između 45 i 100 nm uočeni su na SEM slikama. Stvaranje FeNP-a je potvrđeno EDX-om, koji pokazuje jak signal u području metalnog gvožđa na 6–8 Kev. XRD je otkrio kristalnu prirodu i prosječni prečnik od 136,43 nm.Antioksidans,protuupalno, citotoksični izarastanje ranain vitro testovi su pokazali značajnu aktivnost FeNP. Kumulativni nalazi ove studije pokazuju da je zelena sinteza FeNP-apojačava njegovu biološku aktivnosti može poslužiti kaomoguće sredstvo za zarastanje dermalnih ranaicitotoksični agens protiv raka. Potrebna je buduća studija o identifikaciji mehanizama uključenih u sintezu FeNP-aV. leucoxyloni njegove biomedicinske primjene.

Ključne riječi:Vitex leucoxylon; nanočestice gvožđa; SEM; zarastanje rana; citotoksični

CISTANCHE PREDNOSTI ZAANTIOKSIDANT,PROTUUPALNO, CITOTOKSIČNO, IZARASTANJE RANA

1. Uvod

Primjena nanotehnologije u nauci i tehnologiji za proizvodnju novih materijala na nanorazmjeri je polje koje brzo raste [1]. Nanotehnologija se bavi proizvodnjom materijala na atomskom nivou kako bi se dobila karakteristična svojstva, kojima se može manipulisati za željene aplikacije. Ovo polje brzo raste sa svojim primjenama u nauci i tehnologiji za proizvodnju novih materijala na nanorazini [2]. Različiti industrijski sektori su prihvatili nanotehnologiju posljednjih godina zbog njene primjene u oblastima elektronskih sistema za skladištenje [3], biotehnologije [4], magnetne separacije i predkoncentracije ciljnih analita, ciljane isporuke lekova [5] i transportnih sredstava za gene i lekove. isporuka [3,5,6]. Shodno tome, ove čestice imaju potencijal da ostvare značajan utjecaj na društvo kao rezultat širokog spektra primjena za koje se mogu koristiti. Nanočestice (NP) su mase čestica koje imaju veličinu manju od sto nanometara i smatraju se ključnim strukturnim masama u području nanotehnologije. Veća aktivnost NP-a je i njihova definitivna karakteristika i kvalitet po kojem su najistaknutiji [7]. Organski i neorganski NP su dvije primarne klasifikacije koje se mogu primijeniti na nanočestice. Neorganske nanočestice mogu uključivati ​​magnetne NP, NP plemenitih metala (kao što su zlato i srebro) i poluvodičke NP (kao što su titan dioksid i cink oksid). Organske nanočestice mogu uključivati ​​NP ugljika. Neorganske nanočestice privlače ogromnu pažnju jer nude vrhunska svojstva materijala uz funkcionalnu svestranost. Istraživani su kao mogući alati za medicinsko snimanje, kao i za liječenje bolesti zbog karakteristika veličine koje posjeduju [8]. Raznovrsna hemijska, fizička i biološka svojstva NP-a pod velikim su uticajem različitih parametara, uključujući veličinu i morfologiju nanočestica, kao i površinski premaz, koji se obično određuju tokom sinteze nanočestica. Gubitak predviđene biološke aktivnosti uzrokovan je smanjenjem koloidne stabilnosti. pH, jonska snaga i niz proteina koji stupaju u interakciju sa AgNP pod relevantnim okolnostima imaju uticaj na koloidnu stabilnost. Kao rezultat, odabir odgovarajuće tehnike sinteze je kritičan za dobivanje željenih karakteristika čestica za specifične primjene [9].

Trenutno postoji širok izbor NP-a koji se mogu sintetizirati korištenjem raznih fizičkih, kemijskih, bioloških i hibridnih procesa. Prema nalazima velikog broja istraživačkih studija, fizički i kemijski procesi za proizvodnju nanočestica uključuju korištenje organskih otapala, opasnih spojeva, značajnih količina energije i stabilizatora koji nisu biorazgradivi [10]. Stoga, u području zelene nanotehnologije, sinteza NP korištenjem prirodno dostupnih materijala kao što su biljni ekstrakti, različiti mikroorganizmi, njihovi metaboliti i nekoliko prirodnih humusnih supstanci [11,12] kao redukcijskih i zatvarajućih agenasa postaje sve popularnija. Metode sinteze koje su prijateljske za okoliš korištene su za proizvodnju širokog spektra metalnih nanočestica, uključujući srebro, zlato, željezo, bakar i cink. Razvoj lakih i ekološki prihvatljivih metoda za sintezu NP jedan je od ključnih fokusa nanotehnologije. Biomaterijali kao što su mikroorganizmi i biljni ekstrakti mogu se koristiti u procesu pripreme širokog spektra NP [13,14]. Međutim, budući da su neki organizmi patogeni, opasno je rukovati njima. Da bi napredovali, mikroorganizmi se moraju održavati u kulturi i podvrgnuti pažljivo kontrolisanim uslovima, uključujući temperaturu, pH i druge parametre. Budući da eliminira naporan proces održavanja mikrobne kulture, sinteza NP-ova korištenjem biljnih dijelova ponekad se može pokazati korisnijom od drugih bioloških procesa [15]. Kao rezultat toga, privukao je veliku pažnju zbog svojih inherentnih karakteristika, koje uključuju korištenje prirodnih resursa, brzinu, ekološku prihvatljivost i dobroćudnost. Ove privlačne karakteristike su apsolutno neophodne za upotrebu u medicinskim aplikacijama. Nanočestice proizvedene zelenom sintezom imaju veličinu koja je dobro definirana i pod kontrolom, ne sadrže zagađivače, a metoda je jednostavna za povećanje. Ovo su neke od dodatnih prednosti zelene sinteze [16]. Biološka aktivnost sintetiziranih nanočestica je u velikoj mjeri određena i fino podešena zelenim materijalima koji se koriste za stabilnost i redukciju metalnih jona. Jedno od idealnih svojstava NP-a trebalo bi da bude da mora imati izvanrednu sposobnost razlikovanja između potencijalnih meta (patogena) i ćelija sisara (domaćina) [17].

Zbog toga je vodeni ekstrakt listova V. leucoxylon istražen zbog njegovog potencijala da olakša formiranje nanočestica željeza (FeNP) u sadašnjem istraživanju. Gvožđe je jedan od elemenata koji se može naći u najvećoj količini na Zemlji. Nedavno je postao prepoznat kao nova klasa važnih NP-a zbog činjenice da posjeduje niz jedinstvenih svojstava, uključujući visoku koercitivnost i superparamagnetizam. Kataliza, elektronski uređaji, skladištenje informacija, senzori, tehnologija isporuke lekova, biomedicina, uređaji za magnetno snimanje i čišćenje životne sredine samo su neke od mnogih intrigantnih aplikacija koje koriste FeNP [18]. Štaviše, prema brojnim studijama, FeNP se mogu stvoriti iz različitih biljnih ekstrakata. Ovi biljni ekstrakti uključuju list Eucalyptus globulus [19], list nara [20] i pepeo od kore banane [21]. Biljka V. leucoxylon, koja je korištena u ovoj studiji, pripada porodici Verbenaceae. Poznato je i kao čedno drvo sa pet listova (kanada: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) i može se naći u regionu duž obala reka u zimzelenim i polu-zimzelenim šumama i vlažnim listopadnim šumama duž potoka. Može doseći visinu i do 20 m i klasificira se kao skromno do veliko listopadno drvo. Duž indijskih šuma Zapadnih Gata, može se naći u velikom broju. Prijavljeno je da infuzija ekstrakta lišća V. leucoxylon posjeduje širok spektar farmakoloških aktivnosti kao što su protuupalna, antioksidativna, antipsihotička, antidepresivna, antiparkinsonička i antihiperlipidemijska djelovanja [22]. Prirodni proizvodi su se kroz povijest, a posebno u narodnoj medicini, koristili za liječenje najrazličitijih tegoba i bolesti. Ova praksa datira još iz antičkih vremena. Metode kemije prirodnih proizvoda koje postoje već dugo vremena omogućile su pronalaženje velikog broja bioaktivnih sekundarnih metabolita koji dolaze iz kopnenih i morskih izvora. Značajan broj ovih prirodnih supstanci se sada razmatra za upotrebu kao potencijalni farmaceutski proizvodi [23].

Postoji veliki broj prirodnih hemikalija i nutrijenata koji tek treba da budu otkriveni, a korisni su čovečanstvu. Kao posljedica toga, postoji neposredna potražnja za istraživanjem i razvojem inovativnih terapijskih opcija koje se mogu uspješno koristiti u terapijskim intervencijama uz stvaranje minimalne količine štetnih efekata.

Trenutno predloženi proces zelene sinteze za FeNP je poseban i isplativ. U trenutnoj studiji, pokušano je da se stvore nanočestice na sobnoj temperaturi bez upotrebe ikakvih hemikalija ili fizičkih tehnika. Postrojenje Vitex leucoxylon odabrano je u nastojanju da se sintetizuju nanočestice gvožđa, a sprovedeni su sveobuhvatni sistematski in vitro modeli kako bi se procenila moć nanočestica gvožđa. O ovoj biljci objavljen je samo ograničen broj istraživačkih studija o konceptu nanočestica i njihovoj biomedicinskoj primjeni. Kao posljedica toga, odlučili smo da bi bilo korisno provesti ovo istraživanje imajući na umu sljedeće ciljeve: skrining na fitokemikalije i mjerenje broja sekundarnih metabolita u V. leucoxylon; zelena sinteza i karakterizacija FeNP iz V. leucoxylon; komparativna studija antioksidativnih i antiinflamatornih efekata V. leucoxylon i njegovih FeNP in vitro; in vitro citotoksična aktivnost vodenog ekstrakta lista V. leucoxylon i njegovih FeNP protiv raka kože, raka pluća i raka usne šupljine; in vitro aktivnost zacjeljivanja rana vodenog ekstrakta lista V. leucoxylon i njegovih sintetičkih FeNP-a pomoću scratch testa.

2. Materijali i metode

2.1. Zbirka biljnog materijala

U mjesecu martu 2022., svježi listovi V. leucoxylon su ubrani iz šumskog područja Anshi u zapadnim Ghatima u okrugu Uttar Kanada u državi Karnataka u Indiji. Listove je identificirao i potvrdio Dr. Kotresha K., taksonomista, Odsjek za botaniku, Karnataka Science College, Dharwad; Karnataka, pozivajući se na uzorak vaučera deponovan u Odsjek za botaniku, Karnataka Science College, Dharwad, Karnataka. Nakon sakupljanja, svježi biljni materijal je ispran pod tekućom vodom iz slavine, osušen na suncu, a zatim samljeven u grubi prah pomoću mehaničke mljevene. Prašak se čuvao u posudama koje su bile zatvorene na sobnoj temperaturi kako bi se kasnije mogao koristiti u procesu ekstrakcije sirovim rastvaračem.

2.2. Priprema biljnog ekstrakta

Pomoću Soxhlet uređaja ekstrahirano je 25 g listova u prahu 48 h sa 250 mL destilovane vode. Vodeni ekstrakt je dalje koncentriran pomoću roto-isparivača, a zatim je osušen u eksikatorima prije nego što je držan u zatvorenoj boci na 4 ◦C do upotrebe. Za sintezu FeNP-a, vodeni ekstrakt je korišten kao redukcijski i stabilizirajući agens.

2.3. Rastvarači i reagensi

Sve korišćene hemikalije i rastvarači su bili analitičkog kvaliteta i kupljeni su od Hi-media (Hubli, Indija).

2.4. Fitokemijska analiza

Prateći proceduru koju su opisali Deepti et al. (2012), sirovi vodeni ekstrakt lista V. leucoxylon kvalitativno je ispitan na prisustvo različitih fitokemijskih sastojaka kao što su flavonoidi, alkaloidi, fenoli, glikozidi, steroli, lignini, saponini, antrakinoni, tanini [24].

2.5. Sinteza nanočestica gvožđa

Prvo je 1 mL vodenog ekstrakta lista V. leucoxylon dodat u 10 mL 0,05 mM vodenog rastvora FeSO4 i mešavina je protresena. Na sobnoj temperaturi iu tamnom okruženju proveden je kompletan proces reakcione smjese. Reakcija oksidacije/redukcije bila je jasno vidljiva nakon što je bezbojna reakcijska smjesa inkubirana i reagirala potrebno vrijeme [25]. Kako bi se uklonili bilo kakvi tragovi vodenog ekstrakta iz svježe sintetiziranih FeNP-ova, koji su ostavljeni da se osuše u prahu nakon centrifugiranja na 10,000 o/min u trajanju od deset 10 min tokom željenog perioda reakcije, vodena smjesa koja sadrži FeNP je centrifugirana drugi put i ponovo raspršen u dvostruko destilovanoj vodi i osušen [26].

2.6. Karakterizacija FeNP-a

Nekoliko metoda, kao što su ultraljubičasto-vidljiva spektroskopija (UV-Vis), infracrvena spektroskopija sa Fourier-ovom transformacijom (FTIR), skenirajuća elektronska mikroskopija i energetska disperzijska rendgenska spektroskopija, difrakcija rendgenskih zraka (XRD), analizator veličine čestica i zeta potencijal, korišteni su za karakterizaciju FeNP-ova.

2.6.1. Analiza zasnovana na UV-vidljivoj spektroskopiji

Prvo, 1 mL alikvota koloidnog FeNPs rastvora u kvarcnim kivetama je procenjen UV-vidljivom spektroskopijom (U-3310, Hitachi, Tokio, Japan), koristeći destilovanu vodu kao referencu i 0.05 mM FeSO4 kao slijepa proba, za validaciju redukcije feri jona u koloidnoj otopini [27].

2.6.2. FTIR-bazirana analiza

Funkcionalne grupe (grupe) koje su bile vezane na površini gvožđa i koje su bile uključene u sintezu FeNP su identifikovane korišćenjem FTIR spektroskopije (S700, Nicolet, MA, SAD), [28]. Nakon 72 h inkubacije, FeNP-ovi su izolovani ponovljenim centrifugiranjem (3-4 puta) reakcionih smjesa na 10,000 rpm tokom 15 min. Supernatant je zamijenjen dejoniziranom vodom i pelet je pohranjen u prahu. Nakon sušenja, FeNP-ovi su podvrgnuti FTIR analizi koristeći proces peletiranja kalijum bromida u omjeru 1:100.

2.6.3. Analiza zasnovana na skeniranju elektronskim mikroskopom

Skenirajuća elektronska mikroskopija (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, SAD), korištena je za ispitivanje nanočestica i utvrđivanje njihovog površinskog oblika. Podloge su pripremljene na čistoj Si supstratu od 5 mm × 5 mm iscepljenom od pločice prečnika 100 mm. Supstrat je ostavljen da reaguje 2 h do 6 h i uzorak je pripremljen centrifugiranjem koloidnog rastvora na 10,000 rpm tokom 5 min. Pelet je sušen nakon višestrukog centrifugiranja, nakon čega je ponovo raspršen u dejoniziranoj vodi i postupak je ponovljen. Na kraju je dobiven suhi pelet koji je dalje podvrgnut strukturnoj karakterizaciji SEM analizom prema proceduri koju je opisao Nacionalni institut za standarde i tehnologiju, NIST-2007 [29].

2.6.4. Energetski disperzivni X-zraci

Nakon sušenja na bakrenoj mreži obloženoj ugljenikom, redukovani FeNP su analizirani pomoću EDX-a (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, SAD), što je takođe omogućilo određivanje elementarnog sastava.

2.6.5. Zeta Potencijal

Zapažanja NP-a Zeta potencijal je koristan alat za stjecanje dodatnih uvida o stabilnosti koloidnih NP-a. Amplituda zeta potencijala daje nagoveštaj o mogućoj stabilnosti koloida. Prema Meléndrezu et al. (2010), smatra se da su čestice stabilne ako su njihove vrijednosti zeta potencijala ili više pozitivne od plus 30 mV ili negativne od 30 mV [30]. Ovu činjenicu treba uzeti u obzir. Laserski zeta metar je korišten za prikupljanje očitavanja površinskih zeta potencijala (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, UK). Tečni uzorci nanočestica, ukupne zapremine 5 mililitara, razrijeđeni su sa 50 mililitara dvostruko destilovane vode, a kao otopina elektrolita za suspendiranje korišteno je 2 mm po kvadratnom metru natrijum hlorida. Nakon toga, pH je modifikovan dok nije dostigao željeni nivo. Uzorci su miješani ukupno 30 min. Nakon protresanja posude, zabilježen je pH u ravnoteži i određen je zeta potencijal metalnih čestica. Za potrebe određivanja površinskog potencijala FeNP-a korišten je zeta potencijal. U svakom slučaju, navedena vrijednost je bila prosjek rezultata tri pojedinačna mjerenja. Kada su se vrijednosti zeta potencijala kretale od više od plus 30 mV do niže od 30 mV, određivani su kriteriji stabilnosti NP-a [31].

2.6.6. Analizator veličine čestica

Kako bi se odredila veličina čestica uzorka, na njemu je izvršeno PSA testiranje nakon što je liofiliziran, a zatim raspršen ultrazvučnim aparatom (SZ-100, Horiba, Kyoto, Japan).

2.6.7. Analiza difrakcije rendgenskih zraka (XRD) Analiza

Sintetizovane nanočestice gvožđa iz vodenog ekstrakta lista V. leucoxylon podvrgnute su XRD analizi (Smart Lab SE, Rigaku, Tokio, Japan) da bi se odredila priroda kao i prosečna veličina nanočestica.

2.7. Određivanje antioksidativne aktivnosti korištenjem in vitro metoda

2.7.1. Test snage antioksidansa koji smanjuje ferik ione (FRAP)

Prema Oyaizu (1986), uz manju modifikaciju, procijenjena je redukciona moć iona željeza [32]. Tokom 30 min na 50 ◦C, 2,5 mL 20 mM fosfatnog pufera i 2,5 mL 1 posto kalijum fericijanida dodano je u 2,5 mL ekstrakta lista V. leucoxylon i pomiješano sa sintetiziranim FeNPs kombinacija. Nakon perioda inkubacije, smjesi je dodato 2,5 mL 10% w/v trihlorosirćetne kiseline i 0,5 mL 0,1% w/w željeznog hlorida prije inkubacije dodatnih 10 minuta. Konačno, UV-V spektrofotometar je korišten za detekciju apsorbancije na 700 nm. Kao standard je korištena askorbinska kiselina. Svaki uzorak je testiran tri puta.

2.7.2. Test čišćenja vodonik peroksida

Na osnovu sposobnosti vodenog ekstrakta lista V. leucoxylon i njegovih sintetičkih FeNP-a da hvataju vodonik peroksid, procijenjena je antioksidativna aktivnost ovih spojeva. Prvo je {{0}}.6 mL fosfatnog pufera (pH—7,4) koji sadrži 4 mM H2O2 dodato u 0,5 mL standardne askorbinske kiseline u poznatoj koncentraciji, kao i epruvete koje sadrže biljne ekstrakte u različitim koncentracijama u rasponu od 100 µL do 500 µL (pH—7,4). Koristeći fosfatni pufer i slijepu otopinu bez vodikovog peroksida, procijenili smo apsorbanciju otopine na 230 nm nakon 10 minuta. Za kreiranje kontrole umjesto uzorka ili standarda korišten je fosfatni pufer [33]. Svaki uzorak je testiran tri puta. Za izračunavanje procenta inhibicije korišten je pristup formule.

2.7.3. DPPH čišćenje slobodnih radikala

Test V. leucoxylon ekstrakt lista i sintetizirani FeNPs testirani su na njihovu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala korištenjem DPPH radikala kao reagensa [34]. Uzorci su kombinovani sa rastvorom DPPH radikala (60 M) u etanolu (100 µL) u različitim koncentracijama (w/v). UV-Vis spektrofotometar je korišten za mjerenje apsorbancije smjese na 517 nm nakon 30 minuta inkubacije u mraku na sobnoj temperaturi. Kao standard u eksperimentu korišćena je askorbinska kiselina. Sljedeća jednadžba je korištena za određivanje aktivnosti uklanjanja DPPH svakog uzorka:

gdje Ac predstavlja apsorbanciju kontrolne reakcije, koja se izvodi miješanjem 100 L etanola sa 100 L otopine DPPH, a At predstavlja apsorbanciju ispitnog uzorka. Eksperimenti su izvedeni na trojkama. IC50 vrijednost je izračunata za svaki uzorak. Na viši nivo aktivnosti slobodnih radikala ukazuje reakciona smeša koja ima nižu apsorpciju.

2.7.4. Analiza fosfomolibdena (PM).

Ukupna antioksidativna aktivnost određena je standardnom tehnikom Prieto et al., 1999. Svaka epruveta koja je sadržavala 3 mL destilovane vode i 1 mL rastvora molibdatnog reagensa dobila je vodeni ekstrakt lista V. leucoxylon i njegovih FeNP-ova u različitim koncentracijama u rasponu od 100 µL do 500 µL. Ove epruvete su inkubirane 90 minuta na 95 ◦C. Apsorbancija reakcione smjese je mjerena na 695 nm nakon što su ove epruvete podešene na sobnu temperaturu 20-30 minuta nakon inkubacije. Referentni standard je bila askorbinska kiselina [35].

2.8. Evaluacija in vitro antiinflamatorne aktivnosti

Protuupalni učinak vodenog ekstrakta lista V. leucoxylon i njegovih generiranih FeNP-a procijenjen je metodom denaturacije proteina koju su opisali Elias et al., 1988, uz male modifikacije [36]. Kao standardni lijek korišten je diklofenak natrijum. Reakciona smjesa koja se sastoji od 2 mL poznate koncentracije proizvedenih FeNP-a (100 g/mL) sa standardnim diklofenak natrijumom (100 g/mL) i 2,8 mL fosfatnog pufera (pH 6,4) pomiješana je sa 2 mL svježeg kokošjeg jaja. albumin (1 mM) i inkubiran na 27 ± 1 ◦C 15 min. Denaturacija je izazvana stavljanjem reakcione smeše u vodeno kupatilo na 70 ◦C tokom 10 min. Nakon hlađenja, mjerena je apsorbancija na 660 nm korištenjem dvostruko destilovane vode kao slijepog uzorka. Svaki test je obavljen tri puta. Za izračunavanje postotka inhibicije denaturacije proteina korištena je sljedeća formula:

gdje je, At=apsorbanca ispitnog uzorka; Ac=apsorbancija kontrole.

2.9. Određivanje citotoksične i antikancerogene aktivnosti nanočestica željeza korištenjem MTT testa

Procijenjen je učinak V. leucoxylona i njegovih sintetiziranih FeNP-a na održivost nekanceroznih ćelija fibroblasta L292 i njegovu antikancerogenu aktivnost na rak kože (A375), rak pluća (A549) i rak usne šupljine (KB-3-1) koristeći standardni MTT test, prema Carmichael et al., (1987) [37]. Sve ćelijske linije su dobijene iz Nacionalnog centra za nauku o ćelijama (NCCS), Pune, Indija. Vrijednosti procenta inhibicije rasta stanica (IC50) su izvedene korištenjem krivulja doza-odgovor za svaku ćelijsku liniju, a sljedeća formula je korištena za izračunavanje procenta inhibicije rasta. Konverzija MTT-a u ljubičasti formazan produkt mitohondrijalne dehidrogenaze zdravih ćelija je osnova ovog eksperimenta [38].

2.10. In vitro studija zacjeljivanja rana korištenjem testa grebanja

Sposobnosti širenja i migracije ćelija L292 ćelijske linije uzrokovane uzorcima s poznatim koncentracijama biljnog ekstrakta i nanočestica željeza ispitane su u trenutnom istraživanju [39]. Ploče za kulturu životinjskih ćelija sa DMEM medijumom dopunjenim 10 procentom FBS i 2 procenta Pen-Strep antibiotika (Darmstadt, Nemačka) korišćene su za početak procesa ćelijske kulture. Sterilni plastični vrh pipete korišćen je da se izgrebe jednoslojni konfluent ćelija nakon što su narasle na otprilike 50,000 ćelija po ml. PBS otopina je korištena za uklanjanje neželjenih ostataka stanica. Kao negativna kontrola korišćene su neobrađene ćelije, dok je standardna askorbinska kiselina korišćena kao pozitivna kontrola za uzorke polimera poznate koncentracije. Sljedeća 24 h ćelije su držane na 37 ◦C sa 5 posto CO2. Za ispitivanje relativne migracije ćelija i zatvaranja rane, izgrebani slojevi ćelija su inkubirani i snimljeni u intervalima od 0 h do 6 h do 12 h i 24 h. Kalibracija mjerenja MagVision Software-a (X64, 2016, Magnus, New Delhi, Indija) u rezoluciji 4× korištena je za kvantifikaciju udaljenosti razmaka. Da bi se odredilo zatvaranje rane i stopa migracije, korištena je formula prikazana u nastavku:

s obzirom na sljedeće: A0h=područje rane mjereno neposredno nakon grebanja; ATh=površina rane izmjerena nakon h sati; Rm=brzina migracije (µm/h); Wf=početna širina rane (µm); i T=vrijeme migracije (sat).

2.11. Statistička analiza

Podaci su prikazani kao srednja standardna devijacija i standardna greška, a svaki eksperiment je izveden tri puta. SPSS softver verzija 20 korišten je za obavljanje jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) na razlikama u srednjim rezultatima koje su postojale između grupa.

Pitajte za više:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel: plus 86 15292862950

PRODAVNICA:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop