Gosipitrin, prirodni flavonoid, ublažava oštećenje neurona i mitohondrija izazvano željezom: 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.5. Detekcija Gos-Fe(I) kompleksa

Vjerojatna hipoteza koja objašnjava gornje rezultate je da Gos formira prolazni kompleks sa Fe(ll) koji olakšava njegovu oksidaciju kisikom. Ovaj prijelazni kompleks mogao bi isporučiti svoje elektrone lakše nego Fe()-citrat, stvarajući stabilniji kompleks sa Fe(Ill). Slika 6A prikazuje tipičan spektar Gos sa maksimalnom apsorpcijom na 276, 332 i 380 nm (crna linija). Dodavanje Fe() izazvalo je opadanje maksimalnih apsorpcijskih vrhova ovisno o koncentraciji i pojavu novog blizu 500 nm (slika 6A). Pojava niza spektara koji potiču iz Gos spektra potvrđena je prisustvom izosbestične tačke na λiso=405 nm (vidi crne tačke), što ukazuje na hemijsku ravnotežu (kompleksaciju) između slobodnog i kompleksiranog Gos. Umetak (Slika 6A) prikazuje formiranje kompleksa sa stehiometrijom 2:1 (Gos-gvožđe). Stehiometrija takvih kompleksa Gos-gvožđe određena je Jobovom metodom koja pokazuje tačku loma pri molarnom omjeru od 0,5.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Daljnji dokazi o korelaciji između gvožđa i Gos dobijeni su IR spektroskopijom (slika 6B). Za slobodni Gos i njegov kompleks gvožđa, širokopojasni opseg koji se nalazi u opsegu od 3000-4000 cm- smatran je rastezanjem vodonika- vezane hidroksilne grupe zbog prisustva molekula vode. Mod v(C=O) rastezanja slobodnog Gos-a javlja se na 1654 cm-I, koji je pomaknut prema 1636 cm-Iu nakon formiranja kompleksa. Ovaj rezultat sugerira da je Fe(Ⅱ) u korelaciji sa karbonil kisikom [31]. Štaviše, prisustvo v(Fe-O) vibracije istezanja na 630 cm-I potvrđuje formiranje kompleksa gvožđe-Gos, pošto slobodni Gos ne pokazuje takvu traku.

Slika 6. (A) Efekti Fe(II) na Gos UV-VIS spektar (200-600 nm). Inkubacijska smjesa koja sadrži 125 mM saharoze, 65 mM KCl, 10 mM HEPES pufera (pH 7,2), 2 mM citrata i Gos 1,6 μM. Koncentracije Fe (I) od vrha do dna su bile {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 i 1.12 μM.Inset∶ Jobov dijagram za kompleks Gos-Fe(II) pri konstantnoj ukupnoj koncentraciji 【Fe（D）】 plus 【Gos】=1.6 μM. Crna tačka označava izosbestičku tačku. Strelice prema dolje i prema gore pokazuju smanjenje i povećanje vrijednosti apsorpcije na 380 i 500 nm, respektivno. Eksperimenti su sprovedeni na 28 stepeni. Brzina skeniranja bila je 2nm/s. Osnovna linija je uspostavljena sa inkubacionom smjesom plus 1,6 μM Fe (I) (B) Infracrveni spektri Gos i Gos-Fe (I). Prikazani su tipični primjeri.

2.6. Gos je spriječio redukciju Fe(III) askorbatom

Željezno stanje željeza koje promovira Gos predstavlja vjerodostojan antioksidativni mehanizam jer ometa katalitičku aktivnost Fe(II). Ipak, Fe(III) se i dalje može ponovo reducirati u svoj željezni oblik prirodnim redukcijskim agensima kao što je askorbat. Potonji bi mogao ponovo napuniti biološke sisteme sa Fe(II), koji učestvuje u Fenton-Haber-Weiss reakcijama, stvarajući ekstremno reaktivni·OH radikal. Da bismo ispitali ove mogućnosti, koristili smo 1,10-fenantrolin za mjerenje nivoa formiranja Fe(II) iz Gos otopine (100 μM) tretirane sa 2 mM askorbata i različitim koncentracijama Fe(II) （{{6} } μM）. Slika 7 pokazuje da je odsustvo Gos omogućilo maksimalnu stopu redukcije Fe(II) do Fe(II) (crna linija sa nagibom od 5,85×10-3); međutim ovaj proces je usporen prisustvom Gos-a (1-min inkubacije, zelena linija), a nakon 5 minuta inkubacije sa Gos-om, stopa redukcije Fe(I) askorbatom se smanjila skoro 3 puta (crvena linija sa nagibom od 2,04× 10-3). Ovaj rezultat pokazuje sposobnost Gos-a da inhibira redukciju Fe() posredovanu askorbatom u Fe(I)

Slika 7. Gos inhibira Fe(ⅢI)-redukciju askorbatom u odsustvu mitohondrija jetre pacova. Eksperimentalni uslovi: 125 mM saharoza, 65 mM KCl, 10 mM HEPES pufer (pH7,2), 1 mM citrat, Gos 100 μM. Eksperimenti su sprovedeni na 28 stepeni. Askorbat (4 mM) i 5 mM 1,10-fenantrolina dodani su nakon 1 min ili 5 min Gos-Fe(I) inkubacije. Linije su reprezentativne za tri testa.

2.7. Gos štiti od 2-dezoksiribozne oksidativne degradacije

Da bi se dokumentovala sposobnost Gos-a da prvenstveno djeluje na gvožđe umjesto na slobodne radikale, sprovedene su studije konkurencije kako bi se procijenila efikasnost Gos i dva·OH čistača (DMSO i salicilat) u zaštiti 2,8 ili 28 mM 2-deoksiriboze od gvožđa -posredovano oksidativno oštećenje (Slika 8).·OH čistači na 20 mM zaštitili su 28 mM 2-deoksiriboze značajno manje od 2,8 mM2-deoksiriboze (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Slika 8. Učinak Gos i·OH hvatača dimetil sulfoksida (DMSO) i salicilata na oksidativno oštećenje 2,8 ili 28 mM 2-deoksiriboze izazvano Fe(II)-EDTA plus askorbatom. Otopine su inkubirane 30 min na 37 stepeni i sadržavale su 10 mM fosfatnog pufera (pH7,2),2-deoksiribozu (2,8 ili 28 mM), 150 μM EDTA i 50 μM Fe (ⅢI) Reakcije su započele dodavanjem askorbata do konačne koncentracije od 2 mM. Trake pokazuju srednje vrijednosti ±SD (n=3) Kontrole sadrže samo DMSO (0,001 posto), što je koncentracija rastvarača u Gos uzorcima. Jednostrani t-test je korišten za *p<0.05, n.s.,="">

3. Diskusija

Gvožđe koje se oslobađa u nekoliko neurodegenerativnih stanja, uključujući ishemijski i hemoragijski moždani udar, izaziva deregulaciju homeostaze gvožđa u mozgu, što dovodi do patofiziologije neuroloških povreda [4,32-34]. Na subćelijskom nivou, mitohondrijalno oštećenje izgleda da je uključeno u neuronsku smrt posredovanu gvožđem [10,15,35-38]. Pretklinički dokazi podržavaju prednost upotrebe kelatora željeza, uglavnom deferoksamin mezilata, protiv neurodegeneracije uključujući sve vrste moždanog udara [7,16]. Međutim, njihova visoka cijena i nedostupnost, te širok spektar štetnih efekata klasičnih kelatora željeza, doveli su do upotrebe prirodnih kelatora za upravljanje željezom u dishomeostazi [39,40].

Cistanche može poboljšati imunitet

Zaštitno djelovanje Gos-a je prikazano na HT-22 ćelijama i mitohondrijama mozga štakora inkubiranih sa mješavinom željeza i citrata, gdje smo pronašli snažnu zaštitu od oksidativnog oštećenja izazvanog gvožđem. HT-22 ćelije hipokampusa miša izložene preopterećenju gvožđem (24 h) pokazale su smanjenu vitalnost, što je usko povezano sa ranom disipacijom potencijala mitohondrijalne membrane i smanjenjem ATP-a (Slika 2A-C, respektivno). Ovo sugerira da oštećenje mitohondrija doprinosi neuronskoj smrtnosti. Zaista, u našim uslovima, očekuje se da će barem dio Fe(II) unesen u neurone doći do organela, budući da je neuronskoj smrti izazvanoj gvožđem prethodio gubitak mitohondrijske funkcije. Stoga je pokazano da preopterećenje gvožđem izaziva smrt HT-22 ćelija hipokampusa miša i fragmentaciju mitohondrija [41,42]. Isto tako, kontinuirano izlaganje gvožđu povećava nivoe mitohondrijalnih ROS u ćelijama dopaminergičkog neuroblastoma SHSY5Y [43]. Nadalje, ekstenzivni priliv gvožđa u neurone hipokampusa, kao i oštećenje mitohondrija, verifikovani su nakon izlaganja 100 uM željeznog gvožđa [36]. Ovdje smo primijetili da je Gos-indukovano očuvanje vitalnosti neurona hipokampusa na koje djeluje gvožđe usko povezano sa očuvanjem njihovog potencijala mitohondrijalne membrane i nivoa ATP-a.

Kao iu intaktnim ćelijama, direktno izlaganje mitohondrija željeznom gvožđu izazvalo je ekstenzivno oticanje organele, disipaciju membranskog potencijala i gubitak ATP-a (Slika 3A-C, respektivno). U ovom eksperimentalnom okruženju, Gos je uspeo da zaštiti gvožđem preopterećene mitohondrije, što je izraženo očuvanjem gore navedenih parametara. U tom smislu, uočeno je da su mitohondrije napunjene mikromolarnom koncentracijom gvožđa podvrgnute otvaranju pora u prelaznoj permeabilnosti mitohondrije i △Y disipaciji na način koji je osetljiv na helaciju gvožđa, ali ne zavisi od antioksidativnog dejstva katalaze |44]. Zanimljivo je da je objavljeno da antioksidans Mito-Tempo štiti od oštećenja hipokampalnih neurona preopterećenja gvožđem tako što uklanja anjonski radikal mitohondrijalnog superoksida i čuva morfološki integritet mitohondrija i membranski potencijal [36]. Nedavno smo opisali antioksidativne efekte ovog flavonoida i njegovu sposobnost da zaštiti PC12 ćelije od smrti izazvane hemijskom hipoksijom [29], pri čemu je zaključeno da je uklanjanje slobodnih radikala i antioksidativna sposobnost Gos-a dijelom uključena u zaštitu od gvožđa posredovanih HT-22 i oštećenje mitohondrija. Međutim, poboljšana efikasnost Gos-a protiv lipoperoksidacije posredovane željezom u odnosu na lipoperoksidaciju posredovanu tertbutil hidroperoksidom (Slika 4A, B, respektivno) snažno sugerira da je njegov kapacitet interakcije s željezom glavni mehanizam protiv oštećenja uzrokovanih željezom.

Da bi se dodatno okarakterisala interakcija Gos-Fe, izvedeno je nekoliko eksperimenata bez ćelija i mitohondrija. Uočili smo da kada je polifenol koinkubiran sa Fe (II), koncentracija metalnih jona opada, dok je došlo do odgovarajućeg povećanja stope potrošnje kisika (Slika 5A-C). Ovi efekti sugeriraju da Gos uklanja Fe(II) iz citratnog kompleksa i oksidira ga u željezni oblik u procesu koji zahtijeva O2 kao akceptor elektrona. Posljedično, Gos promiče pad koncentracije Fe(II) koji može ometati hidroksilne radikale kroz Fentonove reakcije. Budući da Gos-Fe(II) kompleks omogućava oksidaciju relevantnih redukcijskih agenasa kao što je askorbat, što rezultira stvaranjem/regeneracijom Fe(II), uspjeli smo pokazati da Gos inhibira redukciju Fe(II) posredovanu askorbatom. do Fe(II).

Hipoteza da Gos ima snažnu interakciju sa gvožđem je takođe ovde potvrđena spektroskopskim tehnikama i potkrepila prethodne rezultate gde su različiti nizovi

Stehiometrija kompleksa Gos-gvožđa je okarakterisana masovnom spektroskopijom elektronske spinske jonizacije [45].

Ovi rezultati su dokazali zaštitne efekte Gos-a protiv oštećenja neurona posredovanih gvožđem, verovatno interakcijom sa ionima gvožđa, ometajući njegovo učešće u stvaranju katalitičkih reaktivnih vrsta kiseonika. Nadalje, ovo sugerira stvaranje prolaznog kompleksa za prijenos naboja između Fe(Ⅱ) i Gos, ubrzavajući oksidaciju Fe(II) i formiranje stabilnijeg kompleksa Fe(III)-Gos koji ne može sudjelovati u fazi propagacije lipida. peroksidacija. Štaviše, biološki relevantni redukcijski agens kao što je askorbat nije bio u stanju reducirati feri željezo u prisustvu Gos-a, ograničavajući prooksidativnu karakteristiku određenih flavonoida uključenih u reciklažu željeznih jona. [30]. Gos u mikromolarnim koncentracijama bio je efikasniji od klasičnih čistača u sprječavanju oksidacije 2-deoksiriboze posredovane gvožđem. Ova visoka efikasnost može se pripisati stvaranju redoks aktivnog Gos-Fe(II)/() kao što smo prethodno primijetili za druge polifenole koji su poboljšali svoje antioksidativne performanse nakon interakcije sa željezom u različitim in vitro paradigmama oksidativnog oštećenja [ 22,46-48].

Utvrđeno je da helatni agensi koji sadrže kiseonik kao ligand (okso ligand, O2-) mogu kelirati gvožđe i pospješiti oksidaciju Fe(I), stabilizaciju Fe(II), a time i smanjiti njegov potencijal smanjenja49]. Pri fiziološkom pH, kateholi lako formiraju termodinamički stabilne bis komplekse sa feri željezom, čemu pogoduju niske koncentracije liganada. Prisustvo kateholnog dijela u Gos strukturi sugerira sličan mehanizam interakcije sa željezom, što bi moglo objasniti postignutu zaštitu od oštećenja neuronskih stanica i mitohondrija uzrokovanih željezom. S tim u vezi, prethodno smo pokazali da mangiferin i gutiferon A stimulišu oksidaciju gvožđa i ometaju redukciju feri gvožđa [23,24,26-28].

Sposobnost Gos-a da helira gvožđe može takođe da podstakne signalne puteve koji doprinose neuroprotekciji. Na primjer, enzimi domene prolil hidroksilaze (PHD), klasični enzimi koji se mogu inducirati hipoksijom-lalfa(HIF-1o) koji modificiraju hidroksilaciju pod normoksijom, identificirani su kao kritične mete kelatora željeza koji su klinički korisni u mnogim neurološki poremećaji [50,51]. To je razumljivo jer PHD zavisi od dvovalentnog gvožđa kao faktora spajanja [52]. Nekoliko gena koji su uključeni u neuroprotekciju reguliše HIF-la, kao što su eNOS, VEGF i EPO[53]. Štaviše, aktivacija HIF-a koja je rezultat inhibicije PHD-a mogla bi spriječiti oštećenje mitohondrija i apoptozu posredovano oksidativnim stresom, neovisno o njegovoj ulozi transkripcionog faktora [54].

Feroptoza, nedavno karakterizirana regulirana smrt stanica ovisno o željezu, predložena je kao mehanizam kroz koji umiru neuroni izloženi hemoragijskom oštećenju [8]. Mitohondrijska disfunkcija je nedavno bila povezana sa smrću ćelija feroptoze [55]. Stoga bi inhibicija feroptoze, koja spašava funkciju mitohondrija od oštećenja željeza, također mogla biti vjerojatan mehanizam za neuroprotekciju protiv neuroloških poremećaja posredovanih gvožđem zaštićenih od strane Gos-a, koji bi zaslužili dalju pažnju. Potrebno je izvršiti dodatna istraživanja o pretpostavljenim korisnim efektima Gos-a na in vivo životinjske modele neurodegeneracije povezane s gvožđem, kako bi se ovaj flavonoid predložio kao terapeutska intervencija protiv oštećenja moždanog tkiva izazvanog deregulacijom homeostaze gvožđa.