Gomisin N inhibira melanogenezu kroz regulaciju PI3K/Akt i MAPK/ERK signalnih puteva u melanocitima

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

sažetak: Gomišin N, jedno od lignanskih jedinjenja pronađenih u Schisandra Chinensis pokazalo se da ima antioksidativno, anti-tumorogeno i protuupalno djelovanje u različitim studijama. Ovdje po prvi put izvještavamo o antimelanogenoj efikasnosti Gomisina N kod sisara ćelijama kao i u embrionima zebrice. Gomisin N je značajno smanjio sadržaj melanina bez ćelijske toksičnosti. Iako nije bio sposoban da modulira katalitičku aktivnost gljivetirozinazain vitro,Gomišin Nsmanjuje nivoe ekspresije ključnih proteina koji funkcionišumelanogeneza. Gomisin N snižava regulaciju receptora melanokortina 1 (MC1R), adenilil ciklaze 2, transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF), tirozinaze,tirozinaza-povezan protein-1(TRP-1), i protein povezan sa tirozinazom-2 (TRP-2). Pored toga, ćelije Melan-A tretirane Gomisinom N pokazale su povećane nivoe p-Akt i p-ERK, što implicira da aktivacija PI3K/Akt i MAPK/ERK puteva može funkcionisati da inhibiramelanogeneza. Također smo potvrdili da je Gomisin smanjio proizvodnju melanina potiskivanjem ekspresije MITF,tirozinaza, TRP-1 i TRP-2u mišjim i ljudskim ćelijama, kao iu razvoju embriona zebrice. Kolektivno zaključujemo daGomišin Ninhibira sintezu melanina potiskivanjem ekspresije MITF-a i melanogenicenzima, vjerovatno kroz modulaciju PI3K/Akt i MAPK/ERK puteva.

Ključne riječi:Schisandra Chinensis;Gomišin N; lignan;melanogeneza; izbjeljivanje kože

cistanche imaju funkciju izbjeljivanja kože

1. Uvod

Melanin je pigment koji se nalazi u većini životinjskih organa uključujući kožu, kosu, oči, unutrašnje uho, kosti, srce i mozak [1,2].Melanogenezaje složen proces u kojem je uključeno više signalnih puteva. Receptor melanokortina 1 (MC1R) je ključni regulatormelanogeneza, signalizirajući putem svojih liganda kao što su melanocit-stimulirajući hormon (MSH) i adrenokortikotropni hormon (ACTH) [3]. Melanin kože se biosintetizira melanocitima u epidermi, a zatim se prenosi u keratinocite, gdje igraju važnu ulogu u zaštiti kože apsorbirajući UV zračenje sunčeve svjetlosti i uklanjajući reaktivne slobodne radikale [4,5]. Sinteza i prijenos melanina u koži i folikulima kose regulirana je dostupnošću njegovih prekursora [6]. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), glavni supstrati melanogenih enzima, takođe funkcionišu kao hormonski regulatori u melanogenezi [7]. S druge strane, prekomjerna proizvodnja melanina dovodi do neželjenih problema s kožom kao što su pjege i melazma [8,9]. Melanogeneza može uticati na ponašanje normalnih i malignih melanocita modulacijom elastičnih svojstava ćelija [10]. Iako receptori za serotonin i melatonin koji se eksprimiraju u ćelijama kože igraju ključnu ulogu u održavanju ćelijske homeostaze, prekomjerna proizvodnja melanina nekontroliranim hormonskim promjenama može uzrokovati patološka stanja na koži [11].

Stoga su uloženi opsežni napori da se razjasne molekularni mehanizmi koji kontroliraju melanogenezu kao primarni korak u liječenju hiperpigmentarnih poremećaja kože. Osim toga, razne vrsteizbjeljivanje kožeagensi koji inhibiraju sintezu melanina su identificirani iz biljnih i nebiljnih ekstrakata i komercijalno korišteni u kozmetici [12,13]. Najrasprostranjeniji agensi za izbjeljivanje uključuju hidrokinon, mekinol, arbutin, kojičnu kiselinu, askorbinsku kiselinu i retinoičnu kiselinu [12,14]. Međutim, postoje različita ograničenja njihove upotrebe u liječenju akutnih ili kroničnih simptoma hiperpigmentacije kod ljudi. Na primjer, hidrokinon, iako se dugo koristi za depigmentaciju od 1960-ih, može uzrokovati iritaciju kože i kontaktni dermatitis [15,16]. Također dovodi do oštećenja DNK povećanjem proizvodnje reaktivnih vrsta kisika i razvojem egzogene ohronoze u stanicama sisara [17,18]. Drugi dobro poznatitirozinazainhibitori kao što su Kojinska kiselina i askorbinska kiselina ne samo da imaju lošu penetraciju u kožu, stabilnost i efikasnost izbjeljivanja, već mogu uzrokovati citotoksičnost, dermatitis i eritem dugotrajne upotrebe [19,20]. S tim u vezi, postoji sve veća potreba za razvojem sigurnijih i efikasnijih sredstava za izbjeljivanje za liječenje hiperpigmentacije ljudske kože. Prirodne biljke koje se koriste u tradicionalnoj medicini mogu pružiti alternativne izvore za identifikaciju novih agenasa za izbjeljivanje koji kontroliraju ključne korakemelanogenezasa manje ili bez nuspojava [21].

Schisandra chinensis, također poznata kao sjeverna bobica finog okusa, prirodno se nalazi u sjeveroistočnoj Kini, dalekom istoku Rusije, Japanu i Koreji [22]. Ova biljka se dugo koristila za liječenje noćnog sljepila, opekotina kože, aseptičkih upala i bolesti jetre u tradicionalnoj orijentalnoj medicini [23,24]. Pokazalo se da ekstrakt voća S. chinensis i njegova jedinjenja lignana posjeduju različite farmakološke učinke na ćelijske linije miša. Na primjer, Schisandra A i C imaju antioksidativno djelovanje, dok Schisandra B ima antifibrotičko, protuupalno, antioksidativno i anti-apoptotično djelovanje [25]. Još jedno jedinjenje lignanaGomišin N(Slika 1A) prijavljeno je da supresira apoptozu izazvanu oksidativnim stresom inhibiranjem oslobađanja citokroma C iz mitohondrija u citoplazmu, cijepanje kaspaze 3 i PARP, i Ca2 plus - indukovanu tranziciju mitohondrijalne permeabilnosti u H9c2 kardiom pacova [7,8]. Zanimljivo je da je nekoliko studija koje su koristile modele miša i ćelijske linije ljudske kože otkrilo terapeutski potencijal S. chinensis za liječenje kožnih poremećaja. Lee et al. objavili su da metanolni ekstrakt voća S. chinensis ublažava simptome kontaktnog dermatitisa smanjujući proizvodnju proinflamatornih citokina kao što su TNF- i IFN- kada se lokalno primjenjuju [8,24]. Kang et al. pokazalo je da vodeni ekstrakt Schisandra Fructus inhibira aktivaciju IκB, potiskujući na taj način proizvodnju TNF-, IL-6 i GM-CSF u liniji ljudskih mastocita HMC-1 [26]. Ovi nalazi su nas naveli da pretpostavimo da bi lignani S. chinensis mogli šire utjecati na funkcije stanica kože. U ovoj studiji pokušali smo istražiti navodnu uloguGomišin N, jedno od glavnih jedinjenja lignana u S. Chinensis, u regulacijimelanogeneza, procjenjujući na taj način njegovu potencijalnu upotrebu kao akosmeceutskog sredstva. Evo, javljamo toGomišin Ninhibira biosintezu melanina bez ćelijske toksičnosti u ljudskim i mišjim stanicama, kao iu embrionima zebrice.

2. Rezultati

2.1. Efekti Gomisina N na formiranje melanina i vitalnost ćelija

Za provjeru djelovanja Gomisina N namelanogeneza, tretirali smo mišje melanocite različitim koncentracijamaGomišin N72 h, a zatim procijenjene promjene u sadržaju melanina. Tretman Gomisinom N smanjio je sadržaj melanina i u normalnoj ćelijskoj liniji melanocita Melan-A i u stanicama melanoma B16F10 na način ovisan o dozi bez ćelijske toksičnosti (Slika 1B, C). Uočili smo da Gomisin N inhibira -MSH-indukovanu proizvodnju melanina u B16F10 ćelijama, što je uporedivo sa rezultatima dobijenim PTU tretmanom [27] (Slika 1C). Procijeniti da li dolazi do smanjenja melaninaGomišin Nzbog smanjene aktivnosti tirozinaze, izvršili smo test bojenja L-DOPA u normalnim ljudskim epidermalnim melanocitnim (NHEM) stanicama. Kao što je prikazano na slici 1E, NHEM ćelije tretirane Gomisinom N pokazale su smanjene nivoe L-DOPA u poređenju sa netretiranim ćelijama. Međutim, inhibitorni efekat Gomisina N na proizvodnju melanina nije bio značajan u ćelijama humanog melanoma MNT-1 (Slika 1D) .

2.2. Efekti Gomisina N na aktivnost tirozinaze

Da ispita da liGomišin Ninhibiratirozinazaaktivnosti in vitro, koristili smo tirozinazu gljiva i lizate stanica melanoma B16. Koična kiselina, dobro poznati inhibitor tirozinaze, korištena je kao pozitivna kontrola. Kada je tretiran tirozinazom gljiva, dok je kojična kiselina značajno smanjila enzimsku aktivnost, Gomisin N nije izazvao nikakvu promjenu u konverziji L-DOPA u dopahrom (Slika 2A). Međutim, kada je tretiran B16 ćelijama melanoma, Gomisin N je rezultirao smanjenjem intirozinazaaktivnost ćelijskog lizata na način ovisan o dozi (slika 2B). Štaviše, kada se istovremeno tretira sa -MSH u B16 ćelijama,Gomišin Npreokrenuo je povećanje stvaranja dopahroma stimulisano -MSH (slika 3C). Primetno je da je Gomisin N bio efikasniji od Kojične kiseline u inhibiciji ćelijskeaktivnost tirozinazeB16 ćelija na -MSH stimulans. Ovi nalazi impliciraju da inhibitorni učinak GomisinN-a na proizvodnju melanina uočen u mišjim i ljudskim stanicama (Slika 1) nije posljedica njegove funkcije da direktno inhibira katalitičku aktivnost tirozinaze. Međutim, još uvijek je moguće da Gomisin N reguliše ekspresiju tirozinaze ili drugih proteina koji igraju ključnu ulogu umelanogeneza.

2.3. Efekti Gomisina N na inaktivaciju MC1R signalnog puta

Pokušali smo da razjasnimo osnovni mehanizam odgovoran za inhibitorni efekat GomisinN-a na proizvodnju melanina. To smo zaključiliGomišin Nmogu regulisati signalne proteine ​​koji su uključenimelanogenezai time inhibiraju sintezu melanina. Receptor melanokortina 1 (MC1R) je amelanocitni receptor povezan sa G proteinom koji funkcioniše kao ključni regulator u sintezi melanina. Aktivacija MC1R njegovim ligandom -MSH ili adrenokortikotropnim hormonom (ACTH) dovodi do povećanja adenilil ciklaze, što zauzvrat povećava intracelularni cAMP nivo [2,3]. Posljedično, nivo transkripcije MITF-a je povećan putem puta Protein kinase-C (PKA)/responsive element-bindingprotein (CREB) [2,28]. Da bismo procijenili regulatorni učinak Gomisina N na MC1R signalni put, provjerili smo nivoe ekspresije MC1R i njegovih nizvodnih signalnih molekula nakon tretmana ćelija Melan-A s Gomisinom N. Uočili smo da Gomisin N značajno smanjuje nivoe proteina i MC1R i adenilil ciklaze 2 na način ovisan o dozi (Slika 3A-C). Kao što se očekivalo,Gomišin N-tretirane ćelije su također pokazale smanjene nivoe proteina MITF-a i njegovih poznatih ciljeva tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 (Slika 3A, D–G). Ovi nalazi sugeriraju da Gomisin N inhibira enzime koji proizvode smelanin tako što inaktivira MITF putem MC1R signalnog puta.

2.4. Učinci Gomisina N na fosforilaciju Akt i ERK1/2 u Melan-A stanicama

Poznato je da su PI3K/Akt i MAPK/ERK putevi uključeni u melanogenezu putem transkripcione ili post-transkripcione regulacije MITF-a [29,30]. Da bismo procijenili da li GomisinN utječe na ove signalne puteve, procijenili smo status fosforilacije Akt i ERK1/2 Western blot analizom. Kao što je prikazano na slici 3H–J, tretman visokom dozom (30 µM) odGomišin Nznačajno poboljšala fosforilaciju i Akt i ERK. Ovi podaci ukazuju da je inhibitorni efekat Gomisina N namelanogenezavjerovatno će biti povezan sa P13K/Akt i MAPK/ERK putevima.

2.5. Gomisin N je inhibirao melanogenezu u embrionima Zebrafish

Zatim smo imali za cilj da ispitamo da li je Gomisin N efikasan u inhibicijimelanogenezain vivo. U tom cilju, tretirali smo embrione zebrice Gomisinom N tokom 72 h u koncentracijama od 1, 10, 20 i 30 µM, a zatim izmjerili nivoe ekspresije melanogenih proteina. Uočili smo da tretman Gomisinom N inhibira stvaranje melanina u razvoju embriona zebrice.Gomišin N-tretirani embrioni pokazali su smanjenje sadržaja melanina na način ovisan o koncentraciji u poređenju sa netretiranom kontrolom (Slika 4). Takođe smo otkrili da nivoi proteinatirozinaza, MITF, TRP-1 i TRP-2 su smanjeni tretmanom Gomisinom N (Slika 5). Ovi rezultati pokazuju da Gomisin N inhibira melanogenezu in vivo regulacijom transkripcionog faktora MITF i njegovih ciljevatirozinaza, TRP-1 i TRP-2.

2.6. Gomisin N je preokrenuo melanogenezu izazvanu rapamicinom u ljudskom MNT-1

Iako je Gomisin N značajno inhibiraomelanogenezau ćelijama Melan-A i B16, kao i embrionima ribe inzebra, nismo uočili njegov efekat na ćelije ljudskog MNT{2}} melanoma. Očekivali smo da bi efekat Gomisina N mogao biti detektovan u MNT-1 ćelijama pod uslovom da je melanogeneza regulisana odgovarajućim stimulusom. Pokazalo se da rapamicin indukuje melanogenezu povećanjem aktivnosti tirozinaze i nivoa proteina MITF, tirozinaze, TRP-1 i TRP-2 [31], djelimično kroz aktivaciju autofagije [32]. Pratili smo nivoetirozinaza, MITF,TRP-1 i TRP-2 u MNT-1 ćelijama Western blot analizom, nakon zajedničkog tretmana sa Gomisin N andrapamicinom. Liječenje rapamicinom značajno je izazvalo nivoe MITF, TRP-1 i TRP-2, ali nije utjecalo natirozinazanivoa (slika 6). Međutim, tretman Gomisinom N značajno je preokrenuo efekte rapamicina na MITF, TRP-1 i TRP-2 na način ovisan o koncentraciji. Obrnuti efekat odGomišin Nprotiv rapamicina je bio obećavajući pri koncentraciji od 20 i 30 µM nego 10 µM. Ovi rezultati sugeriraju da Gomisin N inhibiramelanogenezau ljudskim MNT-1 ćelijama melanoma regulacijom transkripcionog faktora MITF i njegovih ciljeva TRP-1 i TRP-2.

3. Diskusija

Glavna funkcija melanina je zaštita stanica kože od UV zračenja [33–35]. Hiperpigmentacija, rezultat prekomjerne proizvodnje melanina u koži, uzrokuje neželjene kozmetičke probleme i povezana je s dermatitisom i rakom kože. Nekoliko izvještaja sugeriramelanogenezakao važan cilj za liječenje metastatskog melanoma [36,37]. Dakle, postoji sve veća potreba za razvojem antimelanogenih agenasa koji regulišu melanogenezu bez ćelijske toksičnosti [38]. Postoji nekoliko puteva uključenih u melanogenezu kože [39,40]. Nakon vezivanja liganda, MC1R pojačava aktivnost adenilil ciklaze, koja potom povećava intracelularne nivoe cAMP [41,42]. Za cAMP zavisnu aktivaciju PKA/CREB puta se često navodi da povećava nivoe transkripcije MITF-a, čime se povećava sinteza melanina [43]. MITF funkcioniše kao glavni regulator tri glavna melanogena enzima tirozinaze, TRP-1 i TRP-2kod kičmenjaka [3,21,44]. Ovi enzimi su transmembranski proteini koji se nalaze u melanosomalnoj membrani melanocita. Tirozinaza reguliše korak koji ograničava brzinumelanogenezapretvaranjem L-tirozinaze u L-DOPA [23]. TRP-1 i TRP-2 također igraju važnu ulogu u sintezi melanina, iako njihove funkcije nisu u potpunosti shvaćene.

U ovoj studiji, Gomisin N, jedinjenje lignana S. chinensis, pokazalo je depigmentirajuću aktivnost bez ćelijske toksičnosti. Gomisin N je inhibirao sintezu melanina u kultivisanim ćelijskim linijama sisara, kao i u embrionima zebrice. Činilo se da je Gomisin N učinkovitiji od PTU pozitivne kontrole u inhibiciji proizvodnje melanina u ćelijama Melan-A (Slika 1B). Gomisin N je smanjio sadržaj melanina na način ovisan o koncentraciji. U poređenju sa netretiranom kontrolnom grupom, 10 µM odGomišin Nsmanjio sadržaj melanina za oko 40 posto, bez ćelijske toksičnosti. Anti-melanogena aktivnost 10-µM Gomisina N bila je uporediva sa onom 100-µM PTU u ćelijama Melan-A. Slično, činilo se da je Gomisin Potentniji od PTU-a u -MSH-aktiviranim B16F10 ćelijama, gdje su efekti 5- i10-µM Gomisina N bili uporedivi sa efektima 10- i {{12 }}µM PTU, respektivno (Slika 1C). NHEM ćelije tretirane Gomisinom N pokazale su smanjene nivoe L-DOPA, što sugeriše da GomisinN inhibiratirozinazaaktivnost u kultivisanim ćelijama (slika 1E). Ovi nalazi su nas naveli da dalje istražimo osnovni mehanizam kojim Gomisin N inhibira melanogenezu.

Ispitivali smo da liGomišin Ndirektno modulira katalitičku aktivnosttirozinazain vitro. Za razliku od Kojiće kiseline, Gomisin N nije pokazao inhibitorne efekte na aktivnost tirozinaze gljiva (Slika 2A). Međutim, aktivnost ćelijske tirozinaze u lizatima ćelija melanoma B16 je značajno smanjena Gomisinom N i sa i bez tretmana -MSH (Slika 2B,C). Utvrđeno je da je inhibicija ćelijske tirozinazne aktivnosti Gomisina N na -MSH stimulus značajnija od one pozitivne kontrole kojične kiseline (Slika 2C).

Pretpostavili smo da bi se anti-melanogena funkcija Gomisina N mogla pojaviti kroz transkripcijsku ili post-transkripcijsku regulaciju tirozinaze i proteina povezanih s tirozinazom (TRP). količina i kvaliteta proizvodnje melanina u melanocitima. Očekivano, primijetili smo da Gomisin N smanjuje nivoe MC1R i adenilil ciklaze 2 u ćelijama Melan-A (Slika 3A-C). Nadalje,Gomišin Nsmanjuje ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih proteina, uključujući tirozinazu, TRP-1 i TRP-2 (Slika 3A,D-G). Ovi rezultati sugeriraju da je smanjeni nivo sadržaja melanina nakon tretmana Gomisinom N rezultat deaktivacije MC1R puta.

S druge strane, PI3K/Akt i MAPK/ERK putevi mogu fosforilirati MITF, i na taj način mogu post-transkripcijski modulirati njegovu aktivnost [45]. Međutim, ukupni efekat aktivacije PI3K/Akt i MAPK/ERK puteva umelanogenezaje kontroverzno. I PI3K/Akt i MAPK/ERK putevi su konstitutivno aktivirani u humanim melanomima zbog akumuliranih mutacija [46]. Poznato je da se depigmentacija posredovana C2-ceramidom u Mel-Ab ćelijama javlja kroz smanjenje nivoa p-Akt [47]. Postoji nekoliko prirodnih spojeva koji aktiviraju melanogenezu povećanjem nivoa p-ERK u B16 ćelijama melanoma [28]. Nasuprot tome, postoje i dokazi da povišeni nivoi p-ERK i p-Akt inhibiraju sintezu melanina [28,48]. Kompleksna inregulacija melanogeneze može se delimično objasniti činjenicom da fosforilacija pojačava transkripcionu aktivnost MITF-a, ali istovremeno indukuje degradaciju MITF-a zavisnu od ubikvicije-proteosoma [26,49–51]. Naši podaci su pokazali da su i nivoi p-Akt i p-ERK povećani u ćelijama Melan-A tretiranim Gomisinom N (Slika 3H–J). Ovo implicira da putevi PI3K/Akt i MAPK/ERK mogu doprinijeti inhibiciji proizvodnje melanina.

Dalje smo potvrdili antimelanogenu aktivnost Gomisina N u modelu zebrice in vivo. Embrioni zebrice tretirani Gomisinom N pokazali su značajno smanjenje pigmentacije melanina (Slika 4). Osim toga, Gomisin N je značajno smanjio nivoetirozinaza, MITF, TRP-1 i TRP-2 u razvoju embriona zebrice. Ovi nalazi zajedno upućuju na toGomišin Nindukuje depigmentaciju smanjenjem ekspresije MITF-a i melanogenih enzima in vivo. Anti-melanogena aktivnost Gomisina N je dalje potvrđena u ćelijama humanog melanoma MNT{1}} stimuliranih rapamicinom. Iako je Gomisin N rezultirao samo malim promjenama u sadržaju melanina u MNT-1 ćelijama (slika 1D), bio je efikasan da preokrene regulaciju MITF, TRP-1 i TRP-2 izazvanu rapamicinom u način ovisan o koncentraciji (Slika 6A,C-E). Uzeti zajedno, regulatorni efekatGomišin Nna MITF i melanogenim enzimima je reproducibilno pronađen u mišjim i ljudskim ćelijama, kao iu embrionima zebrice.

Da rezimiramo, ovaj rad sugerira da Gomisin N može imati veliki potencijal kao romanizbjeljivanje kožeagent. Čini se da Gomisin N inhibiramelanogenezapotiskivanjem ekspresije MITF-a putem MC1R puta, umjesto direktnog moduliranja katalitičke aktivnostitirozinazaandTRPs. Iako još treba razjasniti detaljne mehanizme, depigmentacija izazvana Gomisinom N vjerovatno će biti povezana s aktivacijom PI3K/Akt i MAPK/ERK puteva (Slika 7).

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

RPMI1640 je kupljen od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, SAD). Dulbecco-ov modifikovani Eagleov medijum (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS) i penicilin-streptomicin (PS) kupljeni su od Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Podloga za rast melanocita je kupljena od PromoCell-a (Heidelberg, Njemačka). Fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat (TPA), Kojična kiselina, 1-fenil-2-tiourea (PTU), tirozinaza gljiva, 3,{{ 9}}dihidroksi-l-fenilalanin(L-DOPA), -MSH, dimetil sulfoksid (DMSO) i paraformaldehid su kupljeni od SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, SAD).Gomišin Nkompleks je obezbijedio Chul Young Kim (Univerzitet Hanyang, Ansan, Koreja). Rapamicin je kupljen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).

4.2. Cell Culture

Ćelijska linija mišjeg melanoma B16F10 nabavljena je iz Korean Cell Line Bank (Seul, Koreja). Ćelije Melan-A mišjih melanocita [52] bile su velikodušan poklon dr. Byeong Gon Lee-a (Institut za istraživanje kože, Amore Pacific Co., Yongin -si, Koreja). Ljudske MNT-1 ćelije melanoma velikodušno je obezbijedio Aeyeong Lee (Kolaž medicine na Univerzitetu Dongguk, Goyang-si, Koreja). Primarni normalni humani epidermalni melanociti (NHEM) kupljeni su od PromoCell-a (Heidelberg, Njemačka). Melan-A ćelije su uzgajane u medijumu RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, Kalifornija, SAD) sa dodatkom 10 procenata FBS, 1 procenat PS i 200 nM TPA. DMEM sa dodatkom 10 posto FBS i 1 posto PS korišten je za održavanje ćelija Melan-A i NHEM stanica. Sve ćelije su inkubirane na 37 ◦C u inkubatoru sa 5% CO2.

4.3. Mjerenje sadržaja melanina

Melan-A ćelije su posađene u ploču sa 24-jažicom (1 × 105 ćelija/jažici), tretirane saGomišin N, a zatim inkubirano 72 h. Nakon 72 h mjeren je sadržaj melanina kako je prethodno opisano [53]. Ukratko, nakon uklanjanja podloge za kulturu, ćelije su tri puta isprane PBS-om. Nakon toga, rastvor natrijum hidroksida (1 mL, 1 N) je dodan u svaku jažicu da se rastvori melanin. Apsorbancija na 405 nm je izmjerena pomoću čitača mikroploče. Ovaj test je ponovljen sa B16F10 ćelijama (2 × 104 ćelije/jažicu) i MNT-1 ćelijama slijedeći istu metodu.

4.4. Western blot analiza

Melan-A ćelije su posađene u posude od 100 mm (1 × 106 ćelija/posuda) i tretirane sa 1, 5 ili 10 µMGomišin Ntri dana na 37 ◦C. Ćelije su isprane sa PBS, a zatim sakupljene pomoću strugača. Odvojene ćelije su stavljene u 1 ml PBS i centrifugirane na 7500 rpm tokom 5 min. Nakon uklanjanja gornje otopine, ćelijske pelete su lizirane puferom za lizu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 posto SDS, 150 mM NaCl, 1 posto NP-40, 0,02 posto natrijum azida, 0,5 posto natrijum deoksiholata, 100 µg/ml PMSF, 1 g/ml aprotinina) tokom 24 h na 4 ◦C. Ukupni proteini su ekstrahovani ultracentrifugom na 12,000 o/min tokom 30 minuta na 4◦C. Sadržaj proteina mjeren je Bradfordovim testom. Proteini (30 µg) su odvojeni pomoću 10% gela za elektroforezu natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE) i prebačeni na anitroceluloznu membranu. Membrana je blokirana 1 h sa 5% obranog mlijeka u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini sa Tween-20 (TBST), a zatim je inkubirana 12 h na 4 ◦C sa primarnim antitijelima usmjerenim na -tubulin (Santa Cruz, CA, SAD ), MITF (ćelijska signalizacija, Danvers, MA, SAD), tirozinaza (ćelijska signalizacija), ERK (ćelijska signalizacija), fosfo-ERK (ćelijska signalizacija), AKT (ćelijska signalizacija), fosfo-AKT (ćelijska signalizacija), MC1R ( Santa Cruz), adenilil ciklaze 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) i TRP-2 (Santa Cruz). Nakon uklanjanja primarnih antitela, membrane su isprane tri puta sa TBST i inkubirane sa sekundarnim antitela (zečji anti-kozji IgG-HRP; mišji anti-zečji HRP, Santa Cruz) tokom 1 h. Membrane su tretirane reagensom poboljšane hemiluminiscencije korišćenjem sistema za snimanje ChemiDoc XRS plus (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Denzitometrijska analiza traka obavljena je korišćenjem softvera Image MasterTM 2D Elite (verzija 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Test aktivnosti tirozinaze

Procijeniti inhibitorni učinak Gomisina N na gljivetirozinazaaktivnost, tirozinaza je inkubirana sa 1, 5 ili 10 µMGomišin Nili pozitivna kontrola Kojića kiselina. Svaki uzorak je otopljen u metanolu. L-DOPA (8,3 mM) i tirozinaza gljiva (125 U) razrijeđene su u 80 mM fosfatnog pufera (pH 6,8). 40 µL svakog uzorka i 120 µL L-DOPA pomiješano je u 96-ploči s bunarčićima, nakon čega je dodato 40 µL razrijeđene tirozinaze pečuraka. Ploče su zatim inkubirane 15 minuta, a apsorbanca je izmjerena na 490 nm pomoću čitača mikroploče.

tirozinazaaktivnost u lizatima ćelija melanoma B16 mjerena je sa ili bez tretmana -MSH, kao što su prethodno opisali Ohguchi et al. [54], uz neznatne izmjene. Ćelijski lizat je pripremljen kako je gore opisano u dijelu Western blot analize. Ukupni proteini u supernatantu mjereni su Bradfordovim testom koristeći goveđi serum albumin kao standard [55]. Jednaka količina proteina je razrijeđena i korištena za ispitivanje aktivnosti tirozinaze.

inhibiraju aktivnost tirozinaze

4.6. L-DOPA bojenje u NHEM ćelijama

NHEM ćelije su posađene u {{0}}ploču i inkubirane 72 h sa Gomisinom N. Ćelije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida 40 min, nakon čega je uslijedio tretman sa 0,1 posto Triton X{ {6}} u trajanju od 2 min. L-DOPA (0,1 posto) je dodat u svaku jažicu, nakon čega je uslijedila inkubacija od 2 h. Nakon uklanjanja rastvora, ćelije su dva puta isprane sa PBS. Slike su fotografisane mikroskopom.

4.7. Zebrafish Experiments

Zebrafish embrioni su dobijeni iz Zebrafish Resource Bank (Daegu, Koreja). Embrioni su tretirani Gomisinom N 72 h. Depigmentirajući efekatGomišin Nna embrionima zebrice posmatrano je pod stereomikroskopom. Za Western blot analizu, embriji tretirani Gomisinom N su lizirani korištenjem pufera za lizu, iz kojeg su pripremljeni ukupni proteini kako je gore spomenuto.

5. Zaključci

Naš rezultat podržava stav da Gomisin N ima visok potencijal za upotrebu kao funkcionalna hrana iizbjeljivanje kožeagent.Gomišin Nje jedno od glavnih jedinjenja lignana u S. Chinensis. U stvari, S. Chinensis je biljni lijek koji se koristi za liječenje mnogih ljudskih bolesti. Međutim, neophodna su daljnja epidemiološka ispitivanja kako bi se dokazala sigurnost Gomisina N na koži. Shodno tome, in vivo studije i klinička ispitivanja moći će jasnije pokazati efikasnost GomisinN-a. U zaključku, ova studija to sugeriraGomišin Nmože biti potencijalni hipopigmentarni agens i prirodanizbjeljivanje kožekandidat za kozmetičku industriju.

cistanche poboljšati izbjeljivanje

Reference

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Uticaj epidermalnog melanina na objektivna mjerenja boje ljudske kože. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119–126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signalizacija puteva u melanogenezi. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentacija melanina u koži sisara i njena hormonska regulacija. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Uloga melanina kao zaštitnika od slobodnih radikala u koži i njegova uloga kao indikatora slobodnih radikala u kosi. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429–1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Sadržaj melanina u melanomametastazama utiče na ishod radioterapije. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentacija folikula dlake.J. Investig. Dermatol. 2005, 124, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; mr Zmijewski; Pawelek, J. L-tirozin i L-dihidroksifenilalanin kao hormonski regulatori funkcija melanocita. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Nedavni napredak u patogenezi melazme. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648–660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Biologija hiperpigmentacionih sindroma. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512–524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; mr Zmijewski; Slominski, AT Uloga pigmenta melanina u melanomu. Exp. Dermatol.2015, 24, 258–259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Kožni serotoninergički/melatoninergički sistem: Osiguravanje mjesta pod suncem. FASEB J. 2005, 19, 176–194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals za hiperpigmentaciju: šta je dostupno? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4–11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; et al. Regulacija pigmentacije ljudske kože i reakcije na ultraljubičasto zračenje.Pigment Cell Res. 2007, 20, 2–13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Postinflamatorna hiperpigmentacija: pregled epidemiologije, kliničkih karakteristika i mogućnosti liječenja u boji kože. J. Clin. Aestet. Dermatol. 2010, 3, 20–31. [PubMed]

15. Sales-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR Pregled modulatornih efekata oleinske kiseline na zdravlje i bolest. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201–210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Pregled i mehanizam djelovanja sredstava za depigmentiranje i posvjetljivanje kože. Phytother. Res. 2006, 20, 921–934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Genotoksičnost izazvana hidrohinonom i oksidativno oštećenje DNK u HepG2 ćelijama. Chem. Biol. Interakcija. 2008, 173, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hidrokinon: Zagađenje životne sredine, toksičnost i mikrobiološki odgovori. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Preparati za posvjetljivanje kože i kontroverza hidrokinona. Dermatol. Ther. 2007, 20,308–313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BiH; Park, JW Saponificirano ulje noćurka smanjuje melanogenezu u stanicama melanoma B16 i smanjuje pigmentaciju kože izazvanu UV zračenjem kod ljudi. Lipidi 2010, 45, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Prirodni proizvodi i tradicionalna medicina: Uključivanje paradigme. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Pharmacology of Schisandra Chinensis Bail: Pregled ruskih istraživanja i upotrebe u medicini. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183–212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Povoljni učinci Schisandrina B na srčanu funkciju u mišjem modelu infarkta miokarda. PLOS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Efekti SchisandraChinensis Turcz. voće na kontaktni dermatitis izazvan dinitrofluorobenzenom kod miševa. Mol. Med. Izvještaj 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Dakle, I.; Jeon, JH Zaštitni efekti ekstrakta ploda Schisandra Chinensis i njegovih lignana protiv kardiovaskularnih bolesti: Pregled molekularnih mehanizama. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Dakle, HY; Choo, YK; Kweon, OH; et al. Efekti vodenog ekstrakta Schisandra Fructus na oslobađanje citokina iz linije humanih mast stanica. J. Med. Food 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Inhibicija proizvodnje mikronukleusa izazvane L-tirozinom od strane feniltiouree u ljudskim ćelijama melanoma. Mutat. Res. 1999, 446, 143–148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Efekat cirsimaritina koji indukuje melanogenezu kroz povećanje transkripcionog faktora povezanog sa mikroftalmijom i ekspresije tirozinaze. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772–8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmedijira cAMP zavisnu aktivaciju kinaza regulisanih ekstracelularnim signalom (ERKs) u melanocitima.EMBO J. 2000, 19, 2900–2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Cyclic AMP ključni glasnik u regulaciji pigmentacije kože. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Indukcija melanogeneze rapamicinom u ljudskim MNT{1}} ćelijama melanoma. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151–157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Lanac 3 proteina povezan s mikrotubulama uključen je u melanogenezu putem regulacije ekspresije MITF u melanocitima. Sci. Report.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Sluh, VJ, Jr. Genetski poremećaji pigmentacije. Adv. Hum. Genet. 1994, 22, 1–45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -melanocit-stimulirajući hormon potiskuje oksidativni stres putem ap53-posredovanog signalnog puta u ljudskim melanocitima. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778–786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanozomi na prvi pogled. J. Cell Sci. 2008, 121,3995–3999. [CrossRef] [PubMed]

37. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogeneza utječe na cjelokupno preživljavanje bez bolesti kod pacijenata sa melanomom III i IV stadijuma. Hum. Pathol. 2013, 44, 2071–2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetović, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN Uloga melanogeneze u regulaciji ponašanja melanoma: Melanogeneza dovodi do stimulacije ekspresije HIF-1 i pratećih puteva zavisnih od HIF-a. Arch. Biochem. Biophys. 2014, 563,79–93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Inhibicijski efekat melanogeneze ekstrakta Gastrodia elata u ćelijama melanoma HM3KO. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89–98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Price, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kinaza povezuje faktor transkripcije Microphthalmia sa c-Kit signalizacijom u melanocitima. Nature 1998, 391, 298–301. [PubMed]

40. Price, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DELineage-specifična signalizacija u melanocitima. C-kit stimulacija regrutuje p300/CBP za mikroftalmiju.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983–17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene product as a signal transducer in cAMP-induced diferenciation of melanocites. J. Cell Biol. 1998, 142,827–835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Ograničena dimerizacija leucinskog zatvarača i specifičnost DNK prepoznavanja glavnog regulatora melanocita MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647–2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Od gena do lijekova: Ciljane strategije za melanom. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349–361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Inhibicijski efekti resveratrola na sintezu melanina u pigmentaciji izazvanoj ultraljubičastim B u koži zamorca. Biomol. Ther. 2014, 22, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibicija melanogeneze galnom kiselinom: Moguća uključenost PI3K/Akt, MEK/ERK i Wnt/ -catenin signalnih puteva u B16F10 ćelijama. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443–20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK i PI3K/PTEN/AKT signalizacija u progresiji i terapiji malignog melanoma. Dermatol. Res. Prakt. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Moon, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC ceramid inhibira proliferaciju ćelija kroz inaktivaciju AKT/PKB i smanjuje sintezu melanina u Mel-Ab ćelijama.Pigment Cell Res. 2001, 14, 110–115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CH Smanjenje regulacije sinteze melanina korištenjem A i njegova primjena na in vivo model munje. J.Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227–1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF u melanomu: Mehanizmi iza njegove ekspresije i aktivnosti. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249–1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Sfingozin{1}}fosfat smanjuje sintezu melanina kroz kontinuiranu aktivaciju ERK i naknadnu degradaciju MITF-a. J. Cell Sci. 2003, 116,1699–1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Yeh, ET; Medrano, EE Regulacija nivoa MITF proteina transkripcionog faktora povezanog sa mikroftalmijom asocijacijom sa enzimom koji konjugira ubikvitin hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135–143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR Linija netumogenih mišjih melanocita, singenih sa B16 melanomom i koja zahtijeva promotor tumora za rast. Int. J. Cancer 1987, 39, 414–418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogeneza inhibira disanje u B16-F10 melanomskim ćelijama dok povećava sadržaj mitohondrijalnih ćelija. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62–72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol kao moćni inhibitor tirozinaze iz roda Gnetum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 663–665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Inhibicija aktivnosti tirozinaze i pigmentacije melanina 2-hidroksitirozolom. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141–145. [CrossRef] [PubMed]