Protein koji aktivira Rho-GTPazu miozin MYO9A identificiran kao novi gen kandidat za monogensku fokalnu segmentnu glomerulosklerozu

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Qi Li1, Ashima Gulati2,6, Mathieu Lemaire3,7, Timothy Nottoli4, Allen Bale3 i Alda Tufro1,5

1 Odsjek za pedijatriju, Nefrološka sekcija, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, SAD; 2 Odsjek za internu medicinu, Nefrološka sekcija, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, SAD; 3 Department of Genetics, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, SAD; 4 Yale Gene Editing Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, SAD; i 5 Odsjek za ćelijsku i molekularnu fiziologiju, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, SAD

KLJUČNE REČI: FSGS; Myo9A-aktin-kalmodulin interakcija; MYO9A varijante; RhoA aktivnost

Fokalna segmentna glomeruloskleroza(FSGS) je podocitopatija koja vodi do zatajenja bubrega, čiji molekularni uzrok često ostaje neriješen. Ovdje opisujemo rijetku besmislenu heterozigotnu mutaciju gubitka funkcije MYO9A (p.Arg701*) kao mogući doprinos bolesti kod braće i sestara para sa porodičnimFSGS/proteinurija. MYO9A varijante neizvjesnog značaja identificirane su sekvenciranjem cijelog egzoma u kohorti od 94 pacijenata sa FSGS dokazanim biopsijom. MYO9A je nekonvencionalni miozin s Rho-GAP domenom koji kontrolira spajanje epitelnih stanica, umrežavanje i snopove aktina i deaktivira mali protein GTPaze kodiran genom RHOA. Aktivnost RhoA povezana je sa regulacijom citoskeleta formiranja aktinskih stresnih vlakana i kontraktilnosti aktomiozina. Myo9A je otkriven u podocitima miševa i ljudi in vitro i in vivo. Razvijeni su miševi Knockin koji nose p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X) generiran uređivanjem gena

proteinurija, brisanje podocita iFSGS. Bubrezi i podociti mutantnih miševa Myo9AR701X/D otkrili su haploinsuficijenciju Myo9A, povećanu aktivnost RhoA, smanjenu interakciju Myo9A-aktin-kalmodulin, oštećenje vezivanja podocita i migraciju. Naši rezultati pokazuju da je Myo9A nova komponenta citoskeletnog aparata podocita koja reguliše aktivnost RhoA i funkciju podocita. Dakle, Myo9AR701X/þ knock-in miševi rekapituliraju proband FSGS fenotip, pokazuju da je p.R701X Myo9A mutacija koja uzrokuje FSGS kod miševa, i sugeriraju da heterozigotne mutacije MYO9A gubitka funkcije mogu uzrokovati novi oblik ljudske autosomno dominantne FSGS. Dakle, identifikacija MYO9A patogena

varijante kod dodatnih pojedinaca sa porodičnim ili sporadičnimFSGSpotrebno je da se utvrdi doprinos gena bolesti.

Translational Statement

Ovaj rad identifikuje mutaciju gubitka funkcije miozina 9A (MYO9A) u porodici sa proteinurijom i fokalnom segmentnom glomerularnom sklerozom (FSGS) iMYO9A varijanteneizvjesnog značaja u FSGS kohorti. Myo9A knock-in miševi koji nose p.Arg701* mutaciju razvijaju proteinuriju iFSGS, reprodukujući fenotip probanda. Ovaj novi životinjski model pruža nove mehaničke uvide u funkcije Myo9A u podocitima i omogućava testiranje eksperimentalnih terapija za FSGS. Podaci ukazuju na to da heterozigotne mutacije MYO9A gubitka funkcije mogu doprinijetiFSGSpatogeneza. Predlažemo uključivanje MYO9A u panele za genetsko testiranje FSGS.

Fokalna segmentna glomeruloskleroza(FSGS) je histološka lezija koja može dovesti do završnog stadijuma bubrežne bolesti.1 Genetske studije pokazuju da je FSGS uglavnom podocitopatija, jer podociti eksprimiraju većinu uzročnih mutantnih gena.2,3 Međutim, molekularni uzrok FSGS-a nije poznat u više od polovine slučajeva.3 Stoga je identifikacija dodatnih gena koji uzrokuju FSGS i njihova molekularna patogeneza klinički relevantna. Ovdje identificiramo miozin 9A (MYO9A) kao novi gen kandidat za ljudski FSGS sekvenciranjem cijelog egzoma (WES). Opšti cilj ove studije je utvrditi da li rijetka varijanta MYO9A identificirana kod pacijenata mijenja funkciju podocita i uzrokuje FSGS in vivo. MYO9A kodira nekonvencionalan, nemišićni miozin koji ranije nije bio povezan sa ljudskim bubrežnim oboljenjima.4 MYO9A mutacije su prijavljene kod pacijenata sa artrogripozom i kongenitalnim miastenijskim sindromom.5,6 Miozini su porodica molekularnih motora koji vežu aktin kako bi generirali silu i kretanje i služili više ćelija funkcije, uključujući regulaciju pokretljivosti i oblika, promet organela i signalizaciju.7–9 Zabilježeno je da mutacije miozina IIA (MYH9) i miozina 1E (MYO1E) uzrokuju glomerularnu bolest i autosomno recesivnu FSGS.10–12 klasa-9 miozini se sastoje od MYO9A i MYO9B koji se eksprimiraju u epitelnim i imunološkim ćelijama, respektivno.9,13 Njihove karakteristične karakteristike su procesivna pojedinačna glava koja se kreće na F-aktinu i repni domen koji aktivira protein Rho-guanozin trifosfataze (Rho-GAP) koji inaktivira RhoA. Myo9A mRNA se eksprimira u epitelu ependima mozga i u epitelu testisa, pluća i bubrega.4 Myo9A nokaut miševi razvijaju progresivni hidrocefalus, blagu hidronefrozu i tubulopatiju.14,15 In vitro Myo9A kontrolira montažu epitelnih stanica i kolekcionu ćeliju. 9 Važno je da je Myo9A dovoljan za umrežavanje i spajanje aktinskih filamenata u snopove izazivajući formiranje aktinskih mreža.16

RhoA modulira dinamiku aktina podocita i održava glomerularnu permeabilnost.17 Poremećaji aktivnosti Rho-guanozin trifosfataze (Rho-GTPase) u podocitima dovode do glomerularne bolesti (pregledano u Mouawad et al.18). Mutacije nizvodnih efektora (INF2)19 i regulatora disocijacije Rho guanozin difosfata-inhibitor alfa (ARHGDIA)3 i Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 uzrokuju proteinuriju i FSGS. Dakle, fino podešavanje odAktivnost Rho-GTPazeje ključno za održavanje normalnog fenotipa podocita in vivo. 18

Ovdje izvještavamo da je MYO9A novi protein podocita, koji kada mutira kod miševa dovodi do proteinurije, brisanja procesa stopala (FPE) i FSGS, replicirajući ljudski fenotip povezan sa varijantom p.Arg701* MYO9A. Naši nalazi otkrivaju relevantnost Myo9A u podocitima, pokazuju da Myo9A reguliše RhoA podocita i pružaju prvi dokaz da p.Arg701* Myo9A uzrokuje disfunkciju podocita tako što ne uspijeva negativno regulirati RhoA i smanjujući interakciju Myo9A-aktin-kalmodulin.

cistanchemoguliječiti bolest bubregapoboljšatibubrežna funkcija

METODE

WES

WES uzoraka DNK od 2 oboljele braće i sestara i 94 kohorta ispitanika iz kliničkog ispitivanja fokalne segmentne glomeruloskleroze (FSGS-CT; NCT00135811) obavljen je u Yale centru za analizu genoma i Yale DNK kliničkoj laboratoriji na platformama Illumina.21-26. CT skup podataka WES kohorte je ispitan da bi se identificiraoMYO9A varijantesa manjim ograničenjem frekvencije alela #{{0}},01 posto za heterozigotne varijante i #0,1 posto za homozigotne i složene heterozigotne varijante, procijenjeno korištenjem bioinformatičkih MetaSVM,27 SIFT,28 i CADD29 rezultata. MYO9A varijante su potvrđene Sangerovim sekvenciranjem. Panel gena od 64 gena koji uzrokuju FSGS baziran na OMIM-u, Online Mendelijsko nasljeđivanje kod čovjeka, bazi podataka (omim.org) i literaturi povezanoj sa "FSGS", "glomerularnom proteinurijom" ili "nefrotskim sindromom" (ili kombinacijom ovi termini) korišteni su za identifikaciju relevantnih varijanti.

Generacija knockin Myo9AR701X miševa

Generirali smo Myo9AR701X knock-in miševe uređivanjem gena posredovanom CRISPR/Cas9-30. Kompletne metode su uključene u Dopunske metode. Myo9AR701X knockin i divlji tip legla, mužjaci i ženke, korišteni su prema protokolima koje je odobrio Odbor za negu i upotrebu životinja Centra za istraživanje životinja Yalea.

Histologija/IF

Biopsija ljudskog bubrega i bubrezi miša obrađeni su za histologiju, imunofluorescenciju (IF) i transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM) kako je opisano.31,32 IF je izveden u zamrznutim presecima bubrega miša i kultivisanim podocitima. Primarna antitijela bila su mišja anti-MYO9A (klon 4C11; Abnova, Tajpej, Tajvan), zečja anti-podocin (P0372; Sigma, St. Louis, MO), zečja anti-laminin (L9393; Sigma), zečja anti-akvaporin2 (PAS -78809; Invitrogen, Carlsbad, CA) i zečji anti-megalin; 33 sekundarna antitijela su bila Alexa Fluor-488 i 594-konjugirana (Invitrogen). Slike su dobijene pomoću konfokalnog mikroskopa Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, Japan) ili Leica SP{18}}Spectral (Leica Camera, Wetzlar, Njemačka).

Imunoblot/imunoprecipitacija

Proteini su razdvojeni elektroforezom na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu i imunoblotirani kao što je prethodno opisano;31,32 sa anti-MYO9A (klon 4C11), aktinom (A2066; Sigma), kalmodulinom (EP799Y; Abcam, Cambridge, g. 9}}fosfat dehidrogenaza (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) primarna antitijela. Koimunoprecipitacija je izvedena kako je opisano,34,35 sa anti-MYO9A zečjim poliklonskim antitijelom (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), nakon čega je uslijedilo imunoblotiranje

cistanche za Fokalnu segmentalnu glomerulosklerozu

Kvantitativni PCR

Ukupna RNK je reverzno transkribovana korištenjem iScript kompleta za sintezu cDNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), amplificirana sa iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) i Myo9A prajmerima polimerazne lančane reakcije (PCR): 50 TCTGAGAAGTAG{TAGCAGGAATGCGC i 50- AGCAACCACAGCTCTCTGAAA-30 koristeći CFX96-Touch-Real-Time-PCR (Bio-Rad). Myo9a mRNA je normalizirana u GAPDH mRNA pomoću 2-DDCt metode, kako je opisano.36

TEM/imunoelektronska mikroskopija

TEM je izveden kako je opisano.32 Za imunogold EM, bubreg divljeg tipa miša je fiksiran, ultratanke kriosekcije su ugašene, blokirane i inkubirane sa primarnim antitelom miša na anti-MYO9A (klon 4C11). Sekundarno antitelo je bio zečji anti-mišji IgG, zlatni konjugat je kozji-anti-zečji 10 nm zlato. Presjeci su naknadno fiksirani, obojeni i ispitani na FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM.

Primarna izolacija podocita i funkcionalni testovi

Podociti su izolovani iz divljeg tipa i Myo9AR701X/þ bubrega kao što je opisano34 uz nekoliko modifikacija. 37,38 Testovi adhezije su izvedeni kako je opisano i kvantificirani korištenjem kristalno ljubičastog bojenja.37

Myo9A nokdaun

Myo9A knockdown (Myo9AKD) je izazvan u divljim besmrtnim mišjim podocitima koristeći Myo9A malu interferirajuću RNK (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Cambridge, UK) prema uputama proizvođača. Netransficirani podociti i podociti transficirani neciljanom siRNA (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-control, Dharmacon) služili su kao kontrole.

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>T mutacija koju dijele proband, sestra i majka (gore, označeno sa *) i sekvenca divljeg tipa (WT) od oca (dolje), zasnovana na humanoj MYO9A referentnoj sekvenci NM_006901.4. (b) Biopsija bubrega probanda pokazuje FSGS i blagi intersticijski infiltrat (periodična kiselina–Schiff mrlja, originalno povećanje X 400). (c) Porodični pedigre pokazuje segregaciju genotip-fenotip: osobe sa proteinurijom/FSGS i MYO9A p.R701X varijantom (čvrsti simboli), divlji tip (prazan simbol) ili nepoznati genotip MYO9A (označen sa #). (d) Divlji tip MYO9A (NP_008832.2) proteinski domeni: motorna domena (siva) uključuje petlju 2 (žuta) i mjesto vezivanja kalmodulina (crvena), vratnu domenu (plava), repnu domenu (ružičasta) ) uključujući domen Rho–guanozin trifosfataze koji aktivira proteine ​​(Rho-GAP) (zeleno); granice domena su označene brojem aminokiselinskih ostataka; predviđeni p.R701X MYO9A završava unutar kalmodulin-vezujućeg mjesta u petlji 2, bez domena vrata i repa, zvjezdice označavaju lokaciju missensaMYO9A varijantenepoznatog značaja identifikovan. (e) Evolucijska konzervacija aminokiselinskih ostataka izmijenjenih MYO9A missense (nastavak)

Slika 1|(nastavak) mutacije identifikovane kod pacijenata sa FSGS: MYO9A izmenjeni ostaci p.D156G (p.Asp156) i p.E765D (p.Glu765) (crvene strelice) su visoko očuvane kroz filogeniju. Pristupni brojevi: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1) i X. tropicalis (XP_002934596.2) korišćeni su za poravnanje višestrukih sekvenci MYO9A sa Clustal Omega, EMBL-EBI (Evropska molekularna biologija Laboratorija – Evropski institut za bioinformatiku, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/MSA/clustalo/). Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.kidney-international.org.

RhoA aktivnost

Aktivni RhoA je izmjeren Rho-activation pulldown testom (Millipore) prema uputama proizvođača.39 Aktivni RhoA je otkriven imunoblotingom.40

Statistička analiza

Podaci su analizirani korišćenjem softvera GraphPad Prism 8 (San Diego, CA) sa neuparenim Studentovim t-testom sa Welch-ovom korekcijom ili Welch-ovom analizom varijanse, prema potrebi. P < 0.05="" se="" smatra="" statistički="">

REZULTATI

Identifikacija MYO9A varijanti kod pacijenata sa proteinurijom i FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* MYO9A varijanta, što ukazuje na autosomno dominantno nasljeđivanje mutacije (Slika 1c). Genotip od strica majke sa hroničnom bolešću bubrega nije dostupan. Očekuje se da će MYO9A p.Arg701* (p.R701X) rezultirati gubitkom funkcije zbog raspada mRNA posredovanog besmislicom ili skraćivanja u petlji 2 domene glave MYO9A (slika 1d) koja je potrebna da Myo9A umreži aktin .16 Dodatna tabela S1 prikazuje sve varijante koje dijele braća i sestre. Ni kod jednog brata i sestara nisu otkrivene mutacije u FSGS ili genima koji uzrokuju nefrotski sindrom do danas (dodatna tabela S2). Koliko znamo, ovo je prvi izvještaj koji povezuje mutaciju MYO9A gubitka funkcije s ljudskim bubrežnim oboljenjima.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 ostale 3 missense varijante se smatraju benignim na osnovu 3 rezultata predviđanja bioinformatike. Aminokiseline zamijenjene u varijantama p.Asp156Gly i p.Glu765Asp vjerovatno će imati relevantnu funkciju jer su ovi ostaci očuvani kroz evoluciju (Slika 1e). Također smo identificirali 1 pacijenta koji nosi varijantu MYO9A (p.Arg2283His) koja nije zadovoljila naše manje kriterije frekvencije alela koji su prethodno prijavljeni kod sindroma kongenitalne mijastenije.6 Nema patogenih mutacija ili štetnih varijanti u genima koji uzrokuju FSGS/NS/proteinuriju (dodatna tabela S2 ) identifikovani su kod 5 osoba sa MYO9A varijantama.

Ekspresija MYO9A u podocitima i glomerularnoj bolesti

Ekspresija proteina Myo9A otkrivena je imunoblotingom u bubrezima miša i mišjim i ljudskim podocitima (slika 2a). Imunocitohemija je potvrdila citoplazmatsku ekspresiju MYO9A u ljudskim podocitima (slika 2b). Imunoreaktivni Myo9A detektuje se IF mikroskopijom u glomerulima miša, gdje se djelomično kolokalizira s podocinom (slika 2c). Dvostruko označavanje i konfokalna mikroskopija ocrtavaju lokalizaciju Myo9A duž vanjskog aspekta bazalne membrane glomerula (GBM) koja je čvrsto povezana ili kolokalizirana s podocinom (slika 2d) i lamininom (slika 2e). Immunogold EM pokazuje preciznu lokalizaciju Myo9A. Čestice zlata su raspoređene u citoplazmi procesa stopala i tijelu ćelije podocita (slika 2f i g, dodatna slika S1B i D). Prorezane dijafragme su jednolično neoznačene. Mesangijalne i endotelne ćelije ne pokazuju značajno obeležavanje. Čestice zlata se takođe detektuju u ćelijama proksimalnih tubula (dodatna slika S1C).

Da bismo procijenili da li je ekspresija Myo9A poremećena kod glomerularnih bolesti, ispitali smo 2 mišja modela povezana sa proteinurijom nefrotskog opsega.31,32 Miševi koji se razvijaju sa nefrotskim sindromom izazvanim prekomjernom ekspresijom Vegfa31 pokazuju smanjenu glomerularnu Myo9A (Slika 3a). Slično, glomerularni Myo9A je smanjen kod miševa sa streptozotocinom posredovanom uznapredovalom dijabetičkom glomerulosklerozom izazvanom prekomjernom ekspresijom Vegfa,32 u usporedbi s Myo9A otkrivenom kod dijabetičkih miševa koji nemaju pretjeranu ekspresiju Vegfa (Slika 3b) i nedijabetičkih miševa (Slika 2). Lokalizacija Myo9A podocitnog procesa stopala i smanjen glomerularni Myo9A u oba modela proteinurične bolesti sugeriraju da Myo9A može igrati ulogu u funkciji barijere glomerularne filtracije.

Tabela 1|Missense MYO9A varijante identifikovane u kohorti pacijenata sa FSGS-CT

p.D156G, str.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; p.P1704S, str.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. Varijante filtrirane na frekvenciji manjeg alela #0,01 posto, n=94 uzorka nakon ANNOVAR napomene.

Genski uređeni MYO9AR701X miševi za razvoj FSGS

Da bismo utvrdili da li besmislena mutacija p.Arg701* (p.R701X) MYO9A uzrokuje glomerularnu bolest kod miševa, generirali smo knock-in p.Arg701* (ovdje nazvan Myo9AR701X) miševe pomoću CRISPR/Cas9-posredovanog uređivanja gena.30 Heterozy Myo9AR701X/þ mutantni miševi (slika 4a) daju održive mutantne mladunce na Mendelov način, pokazujući da mutacija nije embrionalno smrtonosna. Homozigotni mutanti razvijaju progresivni hidrocefalus (dodatna slika S2), ataksiju i napade i skoro svi umiru prije 3 sedmice starosti, što podsjeća na Myo9A-null miševe.14 Heterozigotni Myo9AR701X/þ mutanti nemaju očigledan fenotip pri rođenju, preživljavaju do odraslog doba.

Svi mutantni miševi Myo9AR701X razvijaju FPE i proteinuriju, iako u različitim godinama. Homozigotni mutanti Myo9AR701X/R701X pokazuju dismorfne glomerule, tubularne dilatacije i proteinske odljevke na svjetlosnoj mikroskopiji u dobi od 2 sedmice (Slika 4b, Dodatna slika S3A). TEM 2-sedmično starih Myo9AR701X/R701X mutantnih bubrega otkriva ekstenzivnu FPE, debelu i nepravilnu GBM, i nedostatak dijafragme sa prorezom, zamenjenih adherensnim spojevima (slika 4d). Nasuprot tome, 2-nedeljni heterozigotni Myo9AR701X/þ mutanti pokazuju normalnu bubrežnu histologiju i ultrastrukturu barijere glomerularne filtracije (Slike 4c i e), koja se ne razlikuje od divljeg tipa legla (Slika 4f), što je potvrđeno kvantitacijom procesa stopala (FP/mm GBM) (Slika 4g). Albuminurija je otkrivena u uzorcima urina i heterozigotnih i homozigotnih mutantnih miševa Myo9AR701X elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela (slika 4h) u dobi od 2 sedmice.

U dobi od 4 mjeseca, heterozigotni Myo9AR701X/þ miševi pokazuju FSGS na svjetlosnoj mikroskopiji (Slika 5a i g) i TEM otkriva FPE (bijele strelice), abnormalne prorezane dijafragme (kratke crne strelice), nepravilan GBM i mezangijalnu ekspanziju (Slika 5b) . Kvantifikacija procesa stopala pokazuje značajan FPE u Myo9AR701X/þ u odnosu na bubrege divljeg tipa odraslih (Slika 5c). Ovaj glomerularni fenotip je izuzetno sličan onom uočenom u biopsiji bubrega probanda (slika 1b). Odrasli heterozigotni mutantni miševi Myo9AR701X/þ imaju značajno veće omjere albumin-kreatinin u urinu od miševa divljeg tipa odgovarajuće dobi (Slika 5d) i ne pokazuju dokaze poliurije ili gubitka težine (Slike 5e i f). Na periodičnom acido-Schiffovom pregledu, odrasli Myo9AR701X/þ bubrezi pokazuju FSGS različite težine (strelice, slika 5g) i odsustvo tubularne atrofije i dilatacije ili intersticijskih infiltrata. Dvostruko označavanje i konfokalna mikroskopija otkriva Myo9A u proksimalnim tubulima, periferno do megalina (vrhovi strelica, slika 5h i k), dok Myo9A nije detektovan u distalnim segmentima nefrona koji eksprimiraju akvaporin2 (slika 5h i i). Označavanje oba tubularna markera kod odraslih Myo9AR701X/þ ne razlikuje se od bubrega divljeg tipa pomoću konfokalne mikroskopije (Slika 5h i k i i i l). Nasuprot tome, Myo9A bojenje u proksimalnim tubulima i glomerulima je smanjeno u Myo9AR701X/þ (Slika 5h i i) u odnosu na bubrege divljeg tipa (Slike 5k i l). Ovi nalazi zajedno pokazuju da je p.Arg701* mutacija Myo9A koja uzrokuje FSGS kod miševa, koja rekapitulira fenotip i autozomno dominantno nasljeđivanje heterozigotne MYO9A p.Arg701* varijante identificirane u probandu.

Kako p . Arg701* Myo9A mutacija izaziva FSGS?

Koristili smo Myo9AR701X knock-in miševe da ispitamo molekularnu patogenezu FSGS uzrokovane mutacijom p.Arg701* MYO9A. Ekspresija Myo9A u bubrezima Myo9AR701X značajno se smanjuje kod heterozigota i nije otkrivena kod homozigota pomoću IF (Slika 6a) i imunoblotinga (Slike 6b i c). Izvršili smo kvantitativni PCR kako bismo procijenili da li se haploinsuficijencija posredovana besmislenim raspadom mRNA42 javlja kod Myo9AR701X/þ mutanata. Ekspresija Myo9A mRNA u Myo9AR701X/þ bubrezima je w50 posto niža nego u bubrezima divljeg tipa (48,3 ± 5,6 posto; P < 0,0001)="" (slika="" 6d),="" što="" je="" u="" skladu="" s="">

Smanjenje Myo9A smanjuje njegovu interakciju s aktinom i kalmodulinom

Ispitivali smo da li Myo9A haploinsuficijencija mijenja interakciju Myo9A-aktin-kalmodulin. Eksperimenti koimunoprecipitacije koji upoređuju bubrege i podocite divljeg tipa i Myo9AR701X/þ bubrega i podocita potvrđuju interakciju Myo9A s aktinom i kalmodulinom i pokazuju da se interakcija Myo9A s oba proteina smanjuje za 50 posto u Myo9AR701X/þ mutantnim bubrezima i podocitima (slika a 66 i redukcija). slično kao kod Myo9A pune dužine. Nasuprot tome, nivoi ekspresije aktina i kalmodulina ostaju netaknuti (ulaz, slika 6e i f). Da bismo analizirali Myo9A interakcije u okruženju smanjene ekspresije, inducirali smo w50 posto Myo9AKD u imortaliziranim podocitima divljeg tipa miša koristeći siRNA, procijenjenu kvantitativnim PCR-om i imunoblotingom (Slike 7a i b), a zatim izveli eksperimente koimunoprecipitacije. Myo9AKD smanjuje interakciju Myo9A-aktin-kalmodulin proporcionalno ekspresiji Myo9A (slika 7c). Zajedno, nalazi koimunoprecipitacije pokazuju da heterozigotna mutacija p.Arg701* Myo9A i Myo9AKD smanjuju obilje Myo9A i time njegovu interakciju sa aktinom i kalmodulinom. Budući da Myo9A unakrsno povezuje aktin u molarnom omjeru 1:1,16 naši podaci sugeriraju da smanjeni Myo9A u heterozigotnim Myo9AR701X/þ podocitima može narušiti umrežavanje i spajanje aktina posredovano Myo9A.

Slika 2|(nastavak) do podocina (zeleno) na njegovoj strani GBM (vrhovi strelica). Umetci pokazuju veće uvećanje. Šipke=25 mm. (e) Konfokalna mikroskopija pokazuje da je Myo9A bojenje blisko susjedno ili kolokalizirano lamininom (zeleno) duž vanjskog aspekta GBM (umetci i vrh strelice). Šipke=25 mm. (f,g) Imunogold elektronsko mikroskopska lokalizacija Myo9A u glomerulima bubrega divljeg tipa miša: uočene su zlatne čestice (crne strelice) u tijelu ćelije podocita (POD) i citoplazmi stopala (FP), vidljive su neke zlatne čestice na bazi FP pored bazalne membrane glomerula, ali ne i na dijafragmi sa prorezom. Šipke ¼ 500 nm. Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.kidney-international.org.

Mutacija Myo9AR701X povećava aktivnost Rho-A

Izmjerili smo RhoA aktivnost korištenjem pull-down testa kod mutantnih miševa Myo9AR701X i miševa divljeg tipa, fokusirajući se na heterozigotnog Myo9AR701X/þ kako bismo pružili mehanistički uvid u ljudski p.Arg701* MYO9A fenotip. Aktivni RhoA je značajno povećan u Myo9AR701X/þ cijelim bubrezima (Slika 8a), izolovanim glomerulima (Slika 8b) i primarnim podocitima (Slika 8c), u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim uzorcima divljeg tipa. Magnituda povećanja GTP-RhoA u uzorcima Myo9AR701X/þ kreće se od w60 procenata u izolovanim glomerulima do w2- puta u cijelim bubrezima i u podocitima (Slika 8a–c). Aktivni RhoA je nešto veći u homozigotnim nego u heterozigotnim mutantnim bubrezima, ali razlika nije značajna (Slika 8a). Zajedno, ovi eksperimenti pokazuju da Myo9AR701X uzrokuje povećanu aktivnost RhoA

Myo9AR701X/D mutacija i Myo9AKD mijenjaju ponašanje podocita

Da bismo procijenili učinak poremećene interakcije Myo9A-aktina i povećane aktivnosti RhoA otkrivene u mutantnim podocitima Myo9AR701X/þ na njihovu funkciju, mjerili smo adheziju i pokretljivost podocita pomoću testova vezanosti i migracije, upoređujući divlji tip sa mutantnim primarnim podocitima u kontrolnim uvjetima i na Inhibicija RhoA signalizacije s Rho-povezanim inhibitorom kinaze Y27632. Ovi eksperimenti jasno pokazuju da Myo9AR701X/þ narušava pokretljivost podocita (Slika 8d; Dodatna slika S4) i vezivanje podocita (Slika 8e) na način ovisan o aktivnosti RhoA. Da bismo direktno procijenili učinak Myo9A haploinsuficijencije na funkciju podocita, izveli smo testove vezivanja i migracije upoređujući podocite divljeg tipa miša sa Myo9AKD podocitima koji eksprimiraju w50 posto Myo9A mRNA i proteina (Slike 7a i b). Podociti tretirani siRNA koji nisu ciljani služili su kao dodatna kontrola. Myo9AKD značajno smanjuje vezivanje i migraciju podocita, isti defekt uočen u podocitima Myo9AR701X/þ (Slike 8f i g). Kolektivno, mehanistički podaci ukazuju na to da mutacija heterozigota p.Arg701* Myo9A rezultira haploinsuficijencijom Myo9A što dovodi do smanjene interakcije Myo9A-aktin-kalmodulin i povećanog aktivnog RhoA u bubrezima, posebno u podocitima. Mi tumačimo da zajedno, ovi mehanizmi remete funkciju podocita, na šta ukazuje smanjena vezanost i pokretljivost in vitro i prisustvo proteinurije in vivo.

DISKUSIJA

Ova studija identificira Myo9A kao novu komponentu citoskeletnog aparata podocita koja utječe na funkciju podocita tako što negativno regulira aktivnost RhoA. Opisujemo rijetku besmislicu MYO9A mutaciju (p.Arg701*) koja je povezana s

porodičnu FSGS/proteinuriju i pokazuju da ova mutacija uzrokuje lezije slične FSGS-u kod miševa, pružajući uvid u mehanizam bolesti.

Naši nalazi podržavaju ideju da je MYO9A gen kandidat za FSGS i da je p.Arg701* MYO9A varijanta uključena u ljudski FSGS, zasnovana na smjernicama Američkog koledža za medicinsku genetiku za pripisivanje uzročnosti koristeći algoritame za predviđanje gena, frekvencije alela, eksperimentalne životinjske modele i funkcionalni testovi.43,44 Braća i sestre probanda koji nose p.Arg701* MYO9A nemaju mutacije u genima koji izazivaju FSGS koji su poznati do sada i ne pokazuju dokaze koji ukazuju na sekundarne uzroke FSGS. Ova varijanta se kogregira u malom rodu slijedeći autosomno dominantni obrazac nasljeđivanja s promjenjivom ekspresivnošću. Predviđa se da je MYO9A p.Arg701* varijanta gubitka funkcije, odsutan je u kontrolnim egzomima i ima frekvenciju alela<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

WES skrining velike grupe nepovezane FSGS djece i mladih odraslih41 identificirao je 2 pacijenta sa rijetkim heterozigotnim MYO9A missense varijantama (p.Asp156Gly i p.Glu765Asp). Obje MYO9A missense varijante uključuju visoko konzervirane ostatke, imaju manje frekvencije alela<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

Slika 3|Ekspresija glomerularnog Myo9A u modelima miša glomerularne bolesti. (a) Razvojni nefrotski sindrom izazvan prekomjernom ekspresijom Vegfa31: imunofluorescencija pokazuje Myo9A (crveno) u glomerulima normalnih, neinduciranih 2-nedeljnih miševa i jasno smanjenu ekspresiju Myo9A u glomerulima nefrotičnih miševa koji prekomjerno eksprimiraju Vegfa (dok podocin) je nepromijenjen. (b) Streptozotocinom izazvan dijabetes sa ili bez prekomjerne ekspresije Vegfa32: imunofluorescencija otkriva Myo9A (zeleno) u glomerulima iz neinduciranih dijabetičkih bubrega (kontrola DM) i značajno smanjen imunoreaktivni Myo9A u glomerulima kod dijabetičkih miševa koji prekomjerno eksprimiraju Vegfalozu (dijabetičku DN), 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (plavo) prikazuje jezgra iz oba odjeljka sa istaknutim glomerulima (šrafirana bijela linija). Šipke=50 mm. Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka na www. bubrezi-međunarodni.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>T mutacija zamjenjuje CGA koji kodira Arg (R) sa TGA, stop kodonom koji predviđa završetak translacije na aminokiselini 701. (b) Reprezentativna boja periodične kiseline–Schiff iz 2-nedeljnog homozigota Myo9AR701X/R701X mutantnog bubrega pokazuje abnormalne glomerule, tubularne dilatacije i proteinske izlive. Šipka =20 mm. (c) Reprezentativna boja periodične kiseline–Schiff iz 2-nedeljnog heterozigota Myo9AR701X/þ bubrega pokazuje normalnu histologiju. Bar{11}}mm. (d) Reprezentativna transmisiona elektronska mikroskopija sa 2-nedeljnog Myo9AR701X/R701X glomerula pokazuje masivni izrez na stopalu (bele strelice), odsustvo prorezanih dijafragmi, zamenjenih adherensnim spojevima (crne strelice) i zadebljanu bazu pravilne glomerirne membrana (GBM). Šipka =1mm. (e) Reprezentativna transmisiona elektronska mikroskopija sa 2-nedeljnog heterozigota Myo9AR701X/þ glomerula pokazuje normalne procese stopala (crne tanke strelice) i normalne prorezene dijafragme (bele tanke strelice). Šipka =1mm. (f) Transmisiona elektronska mikroskopija sa 2-nedjeljnog WT legla pokazuje normalnu glomerularnu filtracijsku barijeru: tanke stope povezane dijafragmama s prorezom, fenestriranim endotelnim ćelijama (ECs) i tankim GBM. Šipka =1mm. (g) Kvantitacija brisanja stopala u dobi od 2 sedmice: homozigotni Myo9AR701X/R701X bubrezi pokazuju manje od polnožnih procesa (FPs)/mm GBM od WT ili heterozigotnog Myo9AR701X/þ legla, što ukazuje na ozbiljno brisanje stopala. P < 0,0001="" (analiza="" varijanse).="" (h)="" coomassie="" plava="" mrlja="" uzoraka="" urina="" razdvojenih="" elektroforezom="" natrijum="" dodecil="" sulfat-poliakrilamid="" gela="" pokazuje="" albuminuriju="" (alb)="" i="" u="" myo9ar701x/r701x="" (="" plus="" )="" i="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" plus="" ),="" dok="" je="" urin="" bez="" wt-a.="" goveđi="" serum="" albumin="" (10="" mg)="" služi="" kao="" kontrola="" molekularne="" težine.="" pod,="" podocit.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Slika 5|Analiza fenotipa odraslih heterozigotnih Myo9AR7{{20}}1X/D knockin miševa. (a) Reprezentativna boja periodične kiseline–Schiff (PAS) iz 4-mjesečnog Myo9AR701X/þ bubrega pokazuje glomerul sa ekstenzivnom fokalnom segmentnom glomerularnom sklerozom i mezangijalnom proliferacijom. Šipka=50 mm (b) Reprezentativna transmisiona elektronska mikroskopija sa 4-mjesečnog Myo9AR701X/þ bubrega pokazuje ekstenzivno brisanje procesa stopala (bijele strelice), djelomičnu zamjenu prorezanih dijafragmi (tanke crne strelice) adherenčnim spojevima (debele crne strelice). Bar =2 mm (c) Kvantitacija brisanja stopala kod odraslih Myo9AR701X/þ mutantnih miševa: 4 mjeseca starosti heterozigot (Het) Myo9AR701X/ þ pokazuje 2,2±0,06 FP/mm, u poređenju sa divljim tipom (WT ) 3,7±0,13 FP/mm. ****P<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001. (e) Volumen urina (24 sata) i (f) tjelesna težina se ne razlikuju kod miševa WT (n=18) i Myo9AR701X/þ (Het, n=16). (g,j) Reprezentativna PAS mrlja iz Myo9AR701X/þ (g) i WT (j) bubrega: (g) pokazuje ranu fokalnu sklerozu (strelice) i mezangijalnu proliferaciju u 2 glomerula, normalne leđne tubule i bez infiltrata; (j) prikazuje normalne glomerule i tubule u WT bubregu. Šipke=50 mm. (h,k) Konfokalna mikroskopija imunofluorescencije Myo9A/ Megalin: (h) Myo9AR701X/þ bubreg pokazuje ograničeni Myo9A (crveni) signal (vrhovi strelica) u proksimalnim tubularnim ćelijama označenim megalinom (zeleno), proksimalni tubuli nisu prošireni; (k) WT bubreg pokazuje više Myo9A (vrhove strelica) u blizini megalina u ćelijama proksimalnih tubula. Šipke=25 mm. (i,l) Konfokalna mikroskopija imunofluorescencije Myo9A/Aquaporin2 (AQP2): (i) Myo9AR701X/þ bubreg pokazuje ograničeni Myo9A (crveni) u glomerulu (vrhovi strelica), Myo9A nije detektovan u distalnim segmentima nefrona (obilježeni zelenom AQP2) , koji nisu prošireni; (l) WT bubreg pokazuje Myo9A bojenje u glomerulu i AQP2 bojenje u distalnim segmentima nefrona. Šipke=25 mm. EC, endotelna ćelija; FP, citoplazma stopala; GBM, bazalna membrana glomerula. Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.kidney-international.org.

Slika 6|Ekspresija Myo9A i interakcija Myo9A-aktin-kalmodulin u Myo9AR701X bubrezima i podocitima. (a) Imunofluorescencija otkriva glomerularni Myo9A i podocin: Myo9A glomerularno imunobojenje (crveno) je jako u bubrezima divljeg tipa (WT), značajno se smanjuje u Myo9AR701X/þ glomerulima i nije detektirano u Myo9AR701X/R; podocin (zeleno) lokalizira se na podocite kod svih miševa; podocit-Myo9A djelomična kolokalizacija je prikazana spajanjem (žuto). Šipke=50 mm. (b) Imunoblotiranje: ekspresija intaktne Myo9A (280 kDa) se smanjuje na otprilike polovinu u Myo9AR701X/þ (heterozigotnim [Het]) bubrezima i nije otkrivena u Myo9AR701X/R701X (homozigotnim [Hom]) bubrezima (*<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-putostruko smanjenje ekspresije Myo9A nizom DNK prijavljenih kod dijabetičkih Zucker pacova.49 Zajedno, podaci o ekspresiji Myo9A sugeriraju da Myo9A može igrati ulogu u barijeri glomerularne filtracije.

Da bismo razumjeli relevantnost besmislene mutacije p.Arg701* MYO9A in vivo, generirali smo Myo9AR701X knock-in miševe uređivanjem gena. Homozigotni mutanti Myo9AR701X/R701X razvijaju progresivni hidrocefalus, što dovodi do smrti u dobi od 3 sedmice slično kao kod Myo9A-null miševa.14 U dobi od 2 sedmice, homozigotni Myo9AR701X/R701X bubrezi otkrivaju teški glomerulofeno-tubularni tip, GBM exnormalen, F i nedostatak dijafragmi sa prorezom i proširenih tubula, povezanih s albuminurijom. Odrasli Myo9A-null miševi su pokazali proksimalnu tubulopatiju, poliuriju i proteinuriju niske molekularne težine.15 Nažalost, u izvještaj nisu uključeni nikakvi ultrastrukturni glomerularni podaci;15 iznenađujuće 3- do 6-mjesečni Myo9A -null miševi nisu podlegli progresivnom hidrocefalusu kao što je prethodno opisano.14 Budući da homozigotni Myo9AR701X/R701X mutanti ne prežive do odrasle dobi, možemo samo utvrditi rani glomerularni fenotip koji je ovdje opisan. Tubularna dilatacija uočena kod 2-nedjeljnih mutanata Myo9AR701X/R701X može predstavljati rani dokaz tubulopatije opisane kod odraslih Myo9A-null miševa.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2- puta u primarnim podocitima (c), Western blots reprezentativni za n=3 do 4 nezavisna eksperimenta, lizati prikupljeni od po 3 miša, kvantitacija (srednja vrijednost±SD), analiza varijanse (ANOVA) (a ) ili neupareni t-test (b,c). *P<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

Ključni nalaz ove studije je da su heterozigotni Myo9AR701X/þ knock-in miševi fenotipski normalni pri rođenju, ali razvijaju albuminuriju, FSGS i FPE podocita u dobi od 4 mjeseca, što pokazuje da je p.Arg701* Myo9A mutacija koja uzrokuje FSGS u odraslih miševa. Zanimljivo je da histološke i ultrastrukturne promjene mutantnih bubrega Myo9AR701X/þ rekapituliraju dijagnostičke karakteristike probandove renalne biopsije. Štaviše, mutantni miševi Myo9AR701X/þ razvijaju značajnu albuminuriju, a ne masivnu albuminuriju, reproducirajući nenefrotsku proteinuriju uočenu kod braće i sestara probandova i kod mnogih pacijenata sa FSGS-om u odrasloj dobi.50 Pretpostavlja se da delecija Myo9A može uzrokovati glomerularnu sklerozu sekundarnu tubulopatu poliurijsku. .15 Nekonvencionalni miozini su uključeni u reapsorpciju albumina u proksimalnim tubulima kroz njihove interakcije sa Dab2 i kubilinom, ali Myo9A uključenost u ovaj proces nije dokazana.51 Nismo otkrili nikakve dokaze tauopatija, kao što su poliurija, tubularna dilatacija, atrofija ili abnormalna distribucija proksimalnih ili distalnih tubularnih markera kod odraslih heterozigotnih Myo9AR701X/þ miševa. Ovi podaci ne podržavaju hipotezu da je FSGS uočen kod Myo9AR701X/þ miševa rezultat opstrukcije ili tubularnih defekata.

Mehanički, utvrdili smo da su Myo9A mRNA i Myo9A protein pune dužine smanjeni za w50 posto, snažno sugerirajući da mutacija dovodi do haploinsuficijencije Myo9A zbog raspada mRNA posredovanog besmislicom.42 Budući da se Myo9AR701X tačkasta mutacija lokalizira na egzon 14 od Myo94AmRNA regulacija slijedi standardna besmisleno posredovana pravila raspada mRNA za skraćivanje mutacija lociranih uzvodno od prethodnog egzona.42,52 U skladu s tim, hidrocefalus i prerana smrt uočeni su kod homozigotnih Myo9AR701X/R701X mutanata koji oponašaju Myo9A nulte miševe.14 Utvrdili smo da w50 posto smanjenje ekspresije Myo9A proteina u Myo9AR701X/þ mutantnim bubrezima i primarnim podocitima, kao i u Myo9AKD besmrtnim podocitima, proporcionalno smanjuje interakciju između Myo9A, aktina i kalmodulina. Ovi nalazi podržavaju tumačenje da je Myo9A haploinsuficijencija osnova za smanjenu interakciju Myo9A-aktin-kalmodulin uočenu kod Myo9AR701X/þ mutanata.

Kritični nalaz ovog rada je da p.Arg701* Myo9A inducira gubitak funkcije Rho-GAP što rezultira povećanjem aktivnog RhoA u cijelim bubrezima Myo9AR701X, izolovanim glomerulima i primarnim podocitima. Štaviše, Myo9AR701X/þ mutantni podociti pokazuju smanjenu vezanost i pokretljivost zavisnu od RhoA. Myo9A-GAP signalizacija smanjuje aktivni RhoA i ima mali učinak na Rac1 i Cdc42.9,53 Rho-GAP gubitak funkcije se povećavaAktivnost Rho-GTPazei dovodi do povrede podocita, proteinurije i FSGS.3,18,20 Dakle, abnormalno ponašanje Myo9AR701X/þ mutantnih podocita može doprinijeti razvoju FPE i FSGS tokom vremena kod Myo9AR701X/þ miševa. Naši podaci su u skladu s prijavljenim učinkom RhoA disregulacije na funkciju podocita in vivo i in vitro. 54–56

Budući da Myo9A unakrsno povezuje aktin i inducira formiranje aktinskih snopova in vitro u pravilnim intervalima od 36-nm interakcijom sa aktinom i kalmodulinom, smatra se da je stehiometrija njihove interakcije ključna.16 Stoga je vjerovatno haploinsuficijencija Myo9A za smanjenje unakrsnih veza i snopova aktina posredovanih Myo9A, obezbeđujući manje mesta duž aktinskih filamenata na kojima dolazi do inaktivacije RhoA, čime se menja dinamika aktina u neposrednoj blizini i ponašanje podocita na ćelijskom nivou. Rho-povezani inhibitor kinaze Y27632 djelimično je obnovio defekt vezivanja i migracije izazvan Myo9AR701X/þ, sugerirajući da su uključeni dodatni RhoA efektori, kao što je mDia1. Alternativno, smanjene poprečne veze aktina u Myo9AR701X/þ mogu direktno doprinijeti smanjenju vezivanja i migracije podocita. Haploinsuficijencija Myo9A takođe može uticati na mehanizme trgovine ljudima.7–9 Precizni molekularni mehanizmi pomoću kojih Myo9A reguliše dinamiku podocitnog aktina ostaje da se razjasni. Ukratko, identifikovali smo Myo9A kao novu komponentu citoskeletnog aparata podocita i besmislenu mutaciju MYO9A koja implicira MYO9A kao gen kandidata za humani FSGS, reprodukcijom humane proteinurije/FSGS fenotipa u Myo9AR701X/þ i auto-in-in mišem. dominantna kosegregacija fenotipa u malom rodu. Kolektivno, podaci snažno sugeriraju da je Myo9A haploinsuficijencija molekularna osnova za fenotip uočen kod odraslih Myo9AR701X/þ miševa. Pokazali smo da su vezanje i migracija poremećeni kod mutantnih Myo9AR701X/þ podocita, što uključuje povećanu aktivnost RhoA i smanjenu interakciju Myo9A-aktin-kalmodulin. S obzirom na to da Myo9A inducira unakrsno povezivanje i spajanje aktina u molarnom omjeru 1:116 i naše zapažanje da Myo9AR701X/þ dovodi do haploinsuficijencije, brisanja podocita i FSGS prekovremenog rada, nagađamo da Myo9A može biti kritičan za normalne druge dinamičke aktin podocita. proteini koji vežu aktin (ACTN4, INF2) za koje je poznato da uzrokuju autosomno dominantni FSGS kod odraslih kada su mutirani. Dodatna istraživanja su opravdana kako bi se razjasnilo kako Myo9A stupa u interakciju sa RhoA podocita, proteinima citoskeleta i prorezane dijafragme, i da li defekti posredovani Myo9A u aktinskim poprečnim vezama i formiranju snopova direktno mijenjaju strukturu citoskeleta podocita. Ograničenja ove studije za utvrđivanje uzročnosti uključuju nemogućnost proširenja pedigrea genotipa probanda i nedostatak dodatnih srodnika sa istom mutacijom. Potrebne su daljnje studije kako bi se potvrdili naši WES nalazi kod dodatnih pacijenata s porodičnim ili sporadičnim FSGS prije p.Arg701*MYO9A varijantamože se smatrati izazivačem bolesti i ove informacije se mogu koristiti za kliničko donošenje odluka.

OTKRIVANJE

Svi autori su se izjasnili da nema suprotstavljenih interesa.

ZAHVALNICA

Ovaj rad su podržali grantovi Nacionalnog instituta za zdravlje AT (NIH-RO1DK109434) i Yale centar za Mendelovu genomiku (NIH-U54-HG006504).

Zahvaljujemo M. Saleemu (Univerzitet Bristol, UK) na obezbjeđenju ovjekovječenih ljudskih podocita, G. Moeckel (Medicinski fakultet Yalea, Odsjek za patologiju) za pružanje slika biopsije, S. Ishibe Lab (Yale School of Medicine, Department of Medicine/ Nefrologija) za savjete o izolaciji podocita i testu adhezije, T. Ardito (Yale School of Medicine, Department of Pathology) i V. Kakade (Yale School of Medicine, Department of Medicine/Nefrologija) za doprinose IF

i konfokalno snimanje, SueAnn Mentone (Yale School of Medicine, Odsjek za ćelijsku i molekularnu fiziologiju) za doprinos EM studijama,fokalna segmentna glomerulosklerozapacijentima i porodicama, te spremište Nacionalnog instituta za dijabetes i bolesti probave i bubrega (FSGS-CT, NCT00135811) za obezbjeđivanje uzoraka DNK.

DODATNI MATERIJAL

Dodatni fajl (PDF)

Dopunske metode. WES i bioinformatička analiza podataka, generiranje knockin Myo9AR701X miševa i druge detaljne metode.

Slika S1. Imuno-EM lokalizira ekspresiju Myo9A na mišjim glomerularnim podocitima i tubularni epitel.

Slika S2. Myo9AR701X/R701X uzrokuje neonatalni progresivni hidrocefalus.

Slika S3. Postnatalna bubrežna histologija kod mutantnih miševa Myo9AR701X.

Slika S4. Test migracije podocita (test rana).

Tabela S1. Lista svih varijanti koje dijele proband braća i sestre.

Tabela S2. Lista 64 FSGS-proteinurija-NS gena ispitanih u FSGS-CT kohorti. Supplementary References.

REFERENCE

1. Wiggins RC. Spektar podocitopatija: jedinstven pogled na glomerularne bolesti. Kidney Int. 2007;71:1205–1214.

2. Sadowski CE, Lovrić S, Ashraf S, et al. Uzrok jednog gena u 29,5 posto slučajeva nefrotskog sindroma otpornog na steroide. J Am Soc Nephrol. 2015;26: 1279–1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S, et al. ARHGDIA mutacije uzrokuju nefrotski sindrom putem defektne signalizacije RHO GTPaze. J Clin Invest. 2013;123: 3243–3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U, et al. Kloniranje i razvojna ekspresija nekonvencionalnog miozina IXA (MYO9A) gena u regiji Bardet-Biedl sindroma (BBS4) na hromozomu 15q22- q23. Genomika. 1999;59:150–160.

5. Bayram Y, Karaca E, Čoban Akdemir Z, et al. Molekularna etiologija artrogripoze u više porodica pretežno turskog porijekla. J Clin Invest. 2016;126:762–778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS, et al. Identifikacija mutacija u genu MYO9A kod pacijenata s kongenitalnim miastenijskim sindromom. Mozak. 2016;139:2143–2153.

7. Masters TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Miozini: organizacija domena, motorička svojstva, fiziološke uloge i ćelijske funkcije. Handb Exp Pharmacol. 2017;235:77–122.

8. Liu KC, Cheney RE. Miozini u ćelijskim spojevima. Bioarchitecture. 2012;2:158–170.

9. Omelchenko T, Hall A. Myosin-IXA reguliše kolektivnu migraciju epitelnih ćelija ciljajući aktivnost RhoGAP na spojeve ćelija-ćelija. Curr Biol. 2012;22:278–288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S, et al. Pacijenti sa Epstein-Fechtnerovim sindromom zbog MYH9 R702 mutacija razvijaju progresivnu proteinursku bubrežnu bolest. Kidney Int. 2010;78:207–214.

11. Mele C, Iatropoulos P, Donatelli R, et al. MYO1E mutacije i porodična fokalna segmentna glomeruloskleroza u djetinjstvu. N Engl J Med. 2011;365:295–306.

12. Krendel M, Kim SV, Willinger T, et al. Poremećaj miozina 1e potiče povredu podocita. J Am Soc Nephrol. 2009;20:86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ, et al. Ćelijske funkcije miozina klase IX u epitelu i imunološkim stanicama. Biochem Soc Trans. 2011;39:1166–1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV, et al. Miozin IXa reguliše diferencijaciju epitela, a njegov nedostatak dovodi do hidrocefalusa. Mol Biol Cell. 2009;20:5074–5085.

15. Thelen S, Abouhamed M, Ciarimboli G, et al. RhoGAPmyosin IXa je regulator funkcije bubrežnih tubula. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;309:F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, et al. Samoorganizacija aktinskih mreža pomoću monomernog miozina. Proc Natl Acad Med US A. 2016;113: E8387–E8395.

17. Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Faul C, et al. Sinaptopodin orkestrira aktinsku organizaciju i pokretljivost ćelija putem regulacije RhoA signalizacije. Nat Cell Biol. 2006;8:485–491.

18. Mouawad F, Tsui H, Takano T. Uloga Rho-GTPaza i njihovih regulatornih proteina u funkciji glomerularnih podocita. Can J Physiol Pharmacol. 2013;91:773–782.

19. Brown EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ, et al. Mutacije u formin genu INF2 uzrokuju fokalnu segmentnu glomerulosklerozu. Nat Genet. 2010;42:72–76.

20. Akilesh S, Suleiman H, Yu H, et al. Arhgap24 inaktivira Rac1 u podocitima miša, a mutantni oblik je povezan s porodičnom fokalnom segmentnom glomerulosklerozom. J Clin Invest. 2011;121:4127–4137.

21. Choi M, Scholl I, Ji W, et al. Genetska dijagnoza hvatanjem cijelog egzoma i masovno paralelnim sekvenciranjem DNK. Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106:19096–19101.

22. Choi M, Scholl UI, Yue P, et al. Mutacije Kþ kanala u adenomima koji proizvode aldosteron nadbubrežne žlijezde i nasljednoj hipertenziji. Nauka. 2011;331:768–772.

23. Bamshad MJ, Shendure JA, Valle D, et al. Centri za Mendelovu genomiku: nova inicijativa velikih razmjera za identifikaciju gena koji leže u osnovi rijetkih mendelskih stanja. Am J Med Gen. 2012;158A:1523–1525.

24. Li H, Durbin R. Brzo i precizno poravnavanje kratkog čitanja sa Burrows-Wheeler transformacijom. Bioinformatika. 2009;25:1754–1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. Komplet alata za analizu genoma: MapReduce okvir za analizu podataka o sekvenciranju DNK sljedeće generacije. Genome Res. 2010;20:1297–1303.

26. Yang H, Wang K. Obilježavanje genomske varijante i određivanje prioriteta s ANNOVAR i wANNOVAR. Nat Protoc. 2015;10:1556–1566.

27. Dong C, Wei P, Jian X, et al. Poređenje integracije metoda predviđanja štetnosti za nesinonimne SNV u studijama sekvenciranja cijelog egzoma. Hum Mol Genet. 2015;24:2125–2137.

28. Sim NL, Kumar P, Hu J, et al. SIFT web server: predviđanje efekata supstitucija aminokiselina na proteine. Nukleinske kiseline Res. 2012;40:W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, et al. CADD: predviđanje štetnosti varijanti u ljudskom genomu. Nukleinske kiseline Res. 2019;47:D886–D894.

30. Yang H, Wang H, Jaenisch R. Generisanje genetski modifikovanih miševa korišćenjem CRISPR/Cas-posredovanog inženjeringa genoma. Nat Protoc. 2014;9:1956–1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A, et al. Prekomjerna ekspresija vaskularnog endotelnog faktora rasta podocita (Vegf₁₆₄) uzrokuje tešku nodularnu glomerulosklerozu u mišjem modelu dijabetesa tipa 1. Diabetologia. 2011;54:1227–1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A, et al. Indukcija prekomjerne ekspresije podocita VEGF164 u različitim fazama razvoja uzrokuje kongenitalnu nefrozu ili nefrotski sindrom otporan na steroide. Am J Pathol. 2010;177:2225–2233.

33. Zou Z, Chung B, Nguyen T, et al. Povezivanje endocitoze posredovane receptorima i ćelijske signalizacije: dokaz o reguliranoj intramembranskoj proteolizi megalina u proksimalnom tubulu. J Biol Chem. 2004;279:34302–34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK, et al. Direktna interakcija receptora 2 faktora rasta vaskularnog endotela sa nefrinom povezuje VEGF-A signale sa aktinom u podocitima bubrega. J Biol Chem. 2011;286:39933–39944.

35. Veron D, Aggarwal PK, Velazquez H, et al. Podocit-specifičan VEGF-a pojačanje funkcije inducira nodularnu glomerulosklerozu kod eNOS null miševa. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1814–1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ, et al. Višak podocitnog semaforina-3A dovodi do glomerularne bolesti koja uključuje interakciju plexinA1-nefrina. Am J Pathol. 2013;183:1156–1168.

37. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1 povezan s podocitima je kritičan za održavanje barijere glomerularne filtracije. J Clin Invest. 2014;124:1098–1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. Kultura podocita: zanatski trikovi. Nefrologija (Carlton). 2012;17:525–531.

39. Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA. Regulacija malog GTP-vezujućeg proteina Rho putem ćelijske adhezije i citoskeleta. EMBO J. 1999; 18:578–585.

40. Duvall L, Rashmi P, Lopez-Rivera E, et al. Proteasomalna degradacija Nck1 ali ne i Nck2 reguliše aktivaciju RhoA i dinamiku aktina. Nat Commun. 2013;4:2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X, et al. Kliničke karakteristike i histologija nefropatije povezane s apolipoproteinom l1- u FSGS kliničkom ispitivanju. J Am Soc Nephrol. 2015;26:1443–1448.

42. Kurosaki T, Maquat LE. Propadanje mRNA posredovano besmislicom kod ljudi na prvi pogled. J Cell Sci. 2016;129:461–467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP, et al. Smjernice za istraživanje uzročnosti varijanti sekvence kod ljudskih bolesti. Priroda. 2014;508:469–476.

44. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standardi i smjernice za tumačenje varijanti sekvence: zajednička konsenzus preporuka Američkog koledža za medicinsku genetiku i genomiku i Udruženja za molekularnu patologiju. Genet Med. 2015;17:405–424.

45. Wang M, Chun J, Genovese G, et al. Doprinos rijetkih varijanti gena porodičnom i sporadičnom FSGS-u. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1625–1640.

46. ​​Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, et al. Spektar mutacijskih ograničenja kvantificiran je iz varijacije kod 141.456 ljudi. Priroda. 2020;581:434–443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. Autozigoma i visoka propusnost potvrda kandidature gena bolesti. Genet Med. 2019;21:736–742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I, et al. Nedostatak MYO9A u motoričkim neuronima povezan je sa smanjenom sekrecijom neuromuskularnog agrina. Hum Mol Genet. 2018;27:1434–1446.

49. Sárközy M, Zvara A, Gyémánt N, et al. Metabolički sindrom utiče na obrazac ekspresije srčanih gena na nivou transkripta kod mužjaka ZDF pacova. Cardiovasc Diabetol. 2013;12:16.

50. Lepori N, Zand L, Sethi S, et al. Klinički i patološki fenotip genetskih uzroka fokalne segmentne glomeruloskleroze u odraslih. Clin Kidney J. 2018; 11:179–190.

51. Eshbach ML, Weisz OA. Endocitoza posredovana receptorima u proksimalnom tubulu. Annu Rev Physiol. 2017;79:425–448.

52. Bouligand J, Delmer B, Heart AC, et al. Haploinsuficijencija porodičnog glukokortikoidnog receptora raspadom mRNK posredovanim besmislenim putem, hiperplazijom nadbubrežne žlijezde i očiglednim viškom mineralokortikoida. PLoS One. 2010;5. e13563.

53. Yi F, Kong R, Ren J, et al. Nekanonski Myo9b-RhoGAP ubrzava hidrolizu RhoA GTP pomoću mehanizma dvostrukog arginina i prsta. J Mol Biol. 2016;428: 3043–3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Billing D, et al. Antagonistička regulacija dinamike aktina i pokretljivosti ćelija putem TRPC5 i TRPC6 kanala. Sci Signal. 2010;26:3. ra77.

55. Wang L, Ellis MJ, Gomez JA, et al. Mehanizmi proteinurije izazvane Rho GTPazama. Kidney Int. 2012;81:1075–1085.

56. Kistler AD, Altintas MM, Reiser J. Podocitne GTPaze regulišu dinamiku bubrežnog filtera. Kidney Int. 2012;81:1053–1055.

57. Cory G. Analiza ogrebotina. Metode Mol Biol. 2011;769:25–30.

Kidney International (2021) 99, 1102–1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

Autorska prava ª 2021, Međunarodno društvo za nefrologiju. Objavio Elsevier Inc. Ovo je članak otvorenog pristupa pod licencom CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Dopisivanje: Alda Tufro, Odsjek za pedijatriju/nefrologiju, Medicinski fakultet Univerziteta Yale, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520, SAD. E-mail: alda.tufro@yale.edu 6 Trenutna pripadnost: Nefrologija, Dječija nacionalna bolnica, Washington, DC, SAD. 7 Trenutna pripadnost: Nefrologija, Bolnica za bolesnu djecu, Univerzitet u Torontu, Toronto, Ontario, Kanada. Primljeno 21. maja 2020.; revidirano 4. decembra 2020.; prihvaćeno 10. decembra 2020.; objavljeno na mreži 4. januara 2021