Genetika osteopontina kod pacijenata sa hroničnom bubrežnom bolešću: Nemačka studija o hroničnoj bubrežnoj bolesti

Abstract

Organsko bilje za zdravlje bubrega

Uvod

Osteopontin (OPN) kodiran genom SPP1 je prvi put opisan kao glikoprotein koji pripada porodici SIBLING (Small Integrin-Binding LIgand N-linked Glycoprotein) 1985. godine [1]. OPN se izražava u mnoštvu tkiva kao što su osteoblasti, osteociti, odontoblasti (koji igraju ulogu u mineralizaciji i resorpciji kostiju [2,3]), makrofagi, ćelije glatkih mišića i endotelne ćelije, ali se takođe mogu naći u unutrašnjem uhu, centralnog nervnog sistema i placente [1,2]. Iako se OPN može otkriti u mnogim tipovima ćelija, on se pretežno sintetizira i ekspresira u tkivu bubrega. Proizvodnja OPN-a je stimulirana mnogim faktorima uključujući paratiroidni hormon, kalcitriol, kalcij, fosfat i citokine. Protein može vezati integrine preko specifične peptidne sekvence, motiva arginin-glicin-asparaginske kiseline (RGD), čineći interakciju sa različitim tipovima ćelija mogućom (putem nuklearnog faktora kapa B puta, [4,5]). U bubrezima se integrini mogu naći u Bowmanovoj kapsuli, glomerularnom epitelu i vaskularnom epitelu [6,7]. OPN se sintetiše u debelom uzlaznom ekstremitetu Henleove petlje i distalnom tubulu [1,8].

U pregledu Kalete (2019) razmatrane su poznate (pato)fiziološke uloge OPN-a [1]. Na osnovu ovog pregleda, fiziološka uloga OPN-a u bubrezima još nije u potpunosti shvaćena, ali se sugerira da je esencijalna za tubulogenezu [1]. Ekspresija mRNA SPP1, kao i ekspresija proteina OPN-a, bila je povišena na uglavnom pacovskim modelima bolesti bubrega, a visoka ekspresija OPN-a bila je u korelaciji sa proteinurijom, smanjenom funkcijom bubrega i fibrozom [1]. Jedna studija je identifikovala različite polimorfizme u regionu promotora SPP1 koji utiču na njegovu transkripcionu aktivnost [9]. U prošlosti je nekoliko specifičnih varijanti gena SPP1 bilo povezano s patogenezom i progresijom različitih bolesti bubrega. Druge studije kontrole slučaja izvijestile su o tome da su specifične varijante gena SPP1 povezane s različitim pacijentima s bubrežnom bolešću u poređenju sa (zdravom) kontrolnom grupom: Na primjer, rs1126616 je više puta prijavljivan kao marker za lupus nefritis i imunoglobulinsku nefropatiju [10– 14]. U vezi sa dijabetičkom nefropatijom, prijavljena su dva SNP-a u SPP1, rs11730582 i rs17524488 [15,16]. Stoga smo zaključili da prisustvo smanjene funkcije bubrega može predstavljati dobro okruženje za proučavanje kako bismo dalje utvrdili naše razumijevanje genetskih osnova nivoa OPN-a kod bolesti bubrega, budući da bi neki biološki mehanizmi mogli biti pojačani i stoga ih je lakše otkriti, što je prikazano ranije [17–19]. U Jing et al. [19], na primjer, veličina efekata za poznate lokuse identifikovane u GWAS serum urata kod pacijenata sa CKD bila je slične ili veće od onih prijavljenih iz studija zasnovanih na populaciji. Nemačka studija o hroničnoj bubrežnoj bolesti (GCKD) obuhvata veliku grupu pacijenata sa hroničnom bubrežnom bolesti [20]. Osim demografskih i kliničkih podataka, dostupni su genetski podaci, kao i osnovna mjerenja serumskog OPN-a, pružajući idealno okruženje za istraživanje genetike OPN-a. U tu svrhu izvršili smo GWAS serumskih nivoa OPN-a u GCKD studiji

Rezultati Opis skupa GCKD analize

Tabela 1 daje pregled osnovnih karakteristika odabranog broja varijabli za kompletnu GCKD studijsku kohortu i skup analize GWAS u kojoj su sudionici sa kompletnim podacima o genetici, mjerenjima OPN-a, kao i procijenjenom brzinom glomerularne filtracije (eGFR) i albuminom u urinu -omjer kreatinina (UACR) su uključeni (S1 slika). Nije bilo velikih odstupanja između kompletne kohorte i skupa analize. Sve u svemu, skup za analizu GWAS-a karakterizira udio od 60% muškaraca prosječne starosti 6{{10}.2 godine (SD: 12.0) , sa srednjim vrijednostima od 46,0 mL/min/1,73m2 (p25: 37,0; p75: 57,0) za eGFR i od 50,2 mg/g (p25: 9,4; p75: 382,8) za UACR (Tabela 1). Među uključenim učesnicima, 35% je imalo preovlađujući dijabetes melitus, 16% su bili pušači, a 30% je prijavilo istoriju kardiovaskularnih bolesti (KVB). Medijan nivoa OPN-a u kompletnoj kohorti bio je 29,2 ng/mL (p25: 20,7; p75: 41,9; Tabela 1). Nivoi OPN-a su se u prosjeku povećali u kategorijama eGFR i UACR kategorijama sa medijana od 25,4 ng/mL za stadijum CKD G1/2 na 38,5 ng/mL za stadijum CKD G4/5, kao i sa srednjih vrednosti OPN od 25,6 ng/mL za UACR stadijum A1 na srednje vrednosti OPN od 34,2 ng/mL za UACR stadijum A3 (S2 slika).

Studija asocijacija na nivou genoma i fino mapiranje

Proveli smo GWAS za nivoe OPN-a u serumu (log{{0}}transformirani) koristeći ~7,7 miliona visokokvalitetnih autosomnih bialelnih varijanti GCKD studije sa manjom frekvencijom alela (MAF) od �0,01 (S1 Tabela). Kvantil-kvantilni grafikon koji upoređuje posmatrane i očekivane p-vrijednosti iz OPN GWAS-a nije ukazivao na inflaciju (faktor inflacije λ=1.01), što je u skladu sa odsustvom sistematskih grešaka (S3 slika). Sve u svemu, dijagram na Menhetnu je otkrio tri značajna regiona za čitav genom povezana sa nivoima OPN (p-vrednost<5.0E-08; S4 Fig). Besides the three identified regions, the conditional analysis did not reveal additional independent signals (S5 Fig). The respective association results for the three index SNPs (= SNP with the lowest p-value in the respective region) are presented in Table 2. For all three SNPs, the coded allele was present frequently (allele frequency range 0.5– 0.75). The respective coded allele in our cohort decreased OPN levels on average (S6 Fig) with effect estimates per copy of the coded allele ranging from -0.10 to -0.18 (SE: 0.01–0.02; Table 2). One of the index SNPs on chromosome 4 (rs10011284, 4:88833389) is located upstream of SPP1, which encodes the protein OPN itself (Fig 1A). The other index SNP on chromosome 4 (rs4253311, 4:187174683) maps into the KLKB1 gene (intronic variant), encoding the protein prekallikrein (PK) that is converted to kallikrein (KAL); a protease implicated in the surface-dependent activation of coagulation, bradykinin (BK) release, and potentially the renin-angiotensin-aldosterone system (Fig 2A). The index SNP on chromosome 5 (rs2731673, 5:176839898) maps closest to the F12 gene, which encodes coagulation factor XII, a serine protease that cleaves KLKB1-encoded PK to KAL, among other functions and is also related to blood coagulation, fibrinolysis, and the generation of BK (S7 Fig). A summary of annotations combined from different publicly accessible databases and related to all three SNPs is provided in S2 Table. We next tested whether these three index SNPs were associated with serum OPN levels in the Young Finns Study (YFS) cohort, a population-based study with a mean age of 38 years (SD: 5.0) and a mean eGFR of 92.6 mL/min/1.73m2 (SD: 20.7; S1 Methods). Both SNPs on chromosome 4, rs10011284 and rs4253311, were significantly associated with OPN levels showing also direction consistency (Table 2 and Figs 1B and 2B). In contrast, rs2731673 closest to the F12 gene did not replicate in the YFS cohort (S7 Fig). The two replicated SNPs on chromosome 4 explained 1% of OPN levels each within the GCKD study and did not show a non-additive effect on OPN levels (S8 Fig). Moreover, statistical fine-mapping was performed for the two replicated loci to resolve associated loci into potentially causal variants by constructing credible sets that collectively accounted for a 99% posterior probability of containing the variant or variants that cause the association signal (PPA; Material and methods, [21]). However, fine-mapping results are inconclusive as both constructed sets are large, and single variants included only exhibit low PPA estimates (S3 Table)

Kolokalizacijske analize

Da bismo saznali više o molekularnim mehanizmima i povezanim fenotipovima koji su u osnovi identificiranih signala asocijacije za OPN, uporedili smo obrasce rezultata OPN GWAS u unaprijed definiranim regijama s odgovarajućim GWAS zbirnim statistikama iz tri druga izvora koristeći ljudske podatke (pogledajte Materijal i metode za detalje). Uporedivi obrasci mogu ukazivati ​​na zajedničku biološku osnovu.

Ekspresija gena. Prvo smo izvršili kolokalizacijsku analizu zbirne statistike OPN GWAS koja se odnosi na dva replicirana lokusa sa odgovarajućom GWAS zbirnom statistikom ekspresije gena u cis-u koristeći podatke iz GTEx projekta i NEPTUNE studije

(Material and methods). Colocalization (posterior probability of H4 [p12] >0.8) of the OPN association signals were detected with the expression of MEPE in the lung (Fig 3A) and of SPP1 in the pancreas (Fig 3B and S4 Table). Furthermore, colocalization was found between the OPN association signal and expression of F11 in six other tissues (in descending order of H4): tibial artery (Fig 3C), brain cortex, terminal ileum part of the small intestine, muscular of the esophagus, transverse colon, and aortic artery (S4 Table). Except for the colocalization of the OPN signal with an expression of MEPE in the lung, the effect direction of both traits (OPN and gene expression) was concordant (alpha12>0; S4 Tabela). Proteom plazme. Pored toga, provedene su analize kolokalizacije koristeći GWAS zbirnu statistiku SNP asocijacija u cis i trans sa nivoima od ~3,000 različitih plazma proteina (pGWAS) koje su objavili Sun et al. (Materijal i metode, [22]). Iako nije bila prisutna kolokalizacija za zbirnu statistiku GWAS-a OPN-a i proteina u cis-u, pronađeno je da se rezultati pGWAS-a za 87 proteina iz različitih klasa proteina trans kolokaliziraju s OPN GWAS rezultatima za rs4253311 na KLKB1 (S5 tabela). Za većinu rezultata kolokalizacije

Slika 3. Poređenje zbirne statistike iz OPN GWAS i GTEx kolokalizacije tkiva: (A) MEPE: OPN i plućno tkivo (H4: p12=0.99), (B) SPP1: OPN i pankreas (H4: p{{ 6}}.85); (C) F11: OPN i tibijalna arterija (H4: P12=0.98). Lijevo: dijagram rasipanja koji upoređuje p-vrijednosti asocijacija iz oba izvora jedan s drugim (-log10 skala). Gore desno: OPN GWAS rezultati za regiju od interesa. Dole desno: GTEx GWAS rezultati za oblast od interesa dotičnog organa. Boje odražavaju LD korelaciju (r2) koristeći 1000G EUR populacije kao referencu.

(60/87, 69%), smjer djelovanja OPN-a i proteina bio je podudaran, što je posljedica činjenice da je aktivirani KKS uključen u širok spektar procesa, kao što su upale, rak, kardiovaskularne bolesti, kao i (pato )fiziološke uloge u bubrezima i centralnom nervnom sistemu. Za 86 mapirane proteine, sprovedena je analiza obogaćivanja genske ontologije (GO) kako bi se procijenilo da li su njihovi geni koji kodiraju obogaćeni terminima koji predstavljaju specifične ćelijske komponente i molekularne funkcije (Materijal i metode, S6 tabela). Zbog hijerarhijske strukture referentnih lista, implicirani termini su djelimično zavisni jedan od drugog, pokazujući npr. preklapanje molekularnih funkcija naviše, kao i pojačane aktivnosti hormona i receptora (S9 slika).

Bolesti UK Biobank (UKB).

To address the interplay between genetic modulation of OPN levels and phenotypes we further conducted a colocalization analysis with binary UKB disease traits that showed a genome-wide significant association in the GeneAtlas resource [23]. Based on marginal association statistics, no positive colocalization was detected between OPN and various disease traits (S7 Table). Still, for four of seven traits with an association signal different from the OPN signal in the region (H3: p1.2>0.8), otkriven je drugi nezavisni signal asocijacije za odgovarajuću osobinu bolesti u UKB. Zatim smo izvršili dodatne analize kolokalizacije na osnovu dobijene statistike uslovne asocijacije i identifikovali pozitivnu kolokalizaciju između signala asocijacije OPN na rs4253311 na KLKB1 lokusu i rs1593 za duboku vensku trombozu (DVT; H4: p12=0.96; S7 Tabela i S10 Slika). U GeneAtlas GWAS DVT-a, glavni alel rs1593 (A, frekvencija alela=0.87) je bio povezan sa većim rizikom za DVT (OR=1.2, p-vrijednost 2.4e{{ 18}}), kao što je bio glavni alel rs4253311 (glavni alel: G, frekvencija alela=0.51, OR=1.13, p-vrijednost=2.6e{{27 }}).