FOXO regulira ekspresiju antimikrobnih peptida i potiče fagocitozu hemocita u antibakterijskom imunitetu škampa
Aug 31, 2023
Abstract
Beskičmenjaci se oslanjaju na urođeni imunitet, uključujući humoralni i ćelijski imunitet, kako bi se oduprli patogenoj infekciji. Prethodne studije su pokazale da transkripcijski faktor O (FOXO) sudjeluje u mukoznim imunološkim odgovorima sisara i humoralnoj imunološkoj regulaciji crijeva beskičmenjaka. Međutim, ostaje nepoznato da li je FOXO uključen u sistemsku i ćelijsku regulaciju imuniteta kod beskičmenjaka. U ovoj studiji identificirali smo FOXO iz škampa (Marsupenaeus japonicus) i otkrili da je eksprimiran na relativno bazalnim razinama kod normalnih škampa, ali je značajno povećan kod škampa izazvanih Vibrio anguillarum. FOXO je igrao ključnu ulogu u održavanju homeostaze hemolimfe i crijevne mikrobiote promicanjem ekspresije Relisha, transkripcionog faktora puta imunodeficijencije (IMD) za ekspresiju antimikrobnih peptida (AMP) u škampima. Također smo otkrili da infekcija patogenom aktivira FOXO i inducira njegovu nuklearnu translokaciju smanjenjem aktivnosti serin/treonin kinaze AKT. U jezgri, aktivirani FOXO direktno je regulirao ekspresiju svojih ciljnih gena Amp i Relish protiv bakterijske infekcije. Nadalje, identificirano je da je FOXO uključen u ćelijsku imunost promicanjem fagocitoze hemocita kroz pojačanu regulaciju ekspresije receptora C (Src) hvatača fagocitotskog receptora i dvije male GTPaze, Rab5 i Rab7, koje su povezane s prometom fagozoma u lizosom. u citoplazmi. Uzeti zajedno, naši rezultati su pokazali da FOXO ispoljava svoje efekte na homeostazu hemolimfe i enteričku mikrobiotu tako što aktivira IMD put kod normalnih škampa i direktno ili indirektno promiče ekspresiju AMP i pojačava fagocitozu hemocita protiv patogena kod škampa zaraženih bakterijama. Ovo istraživanje otkrilo je različite funkcije FOXO-a u mukoznom (lokalnom) i sistemskom antibakterijskom imunitetu beskičmenjaka.
Prednosti suplemenata cistanche-kako ojačati imuni sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Tražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Uvod
Proteini transkripcionog faktora O familije (FOXO) uključeni su u različite kritične biološke procese organizama, uključujući regulaciju ćelijskog ciklusa, popravku oštećene DNK, imunitet protiv raka i regulaciju životnog veka [1,2]. Sisavci imaju četiri različita FOXO proteina (FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6); međutim, beskičmenjaci imaju samo jedan FOXO, koji je također poznat kao Daf{7}} u Caenorhabditis elegans [3]. Transkripciona aktivnost FOXO-a regulirana je s nekoliko vrsta post-translacijskih modifikacija, kao što su fosforilacija, acetilacija, metilacija i ubikvitinacija [4]. Ove modifikacije utječu na translokaciju ili izlazak FOXO nuklearne jezgre iz jezgre i njegovu interakciju s ko-represorima i ko-aktivatorima, koji mogu promovirati ili smanjiti aktivnost FOXO i posredovati u njegovim različitim biološkim funkcijama [5,6]. Nakon aktivacije, FOXO učestvuje u mnogim fiziološkim funkcijama regulacijom transkripcije različitih ciljnih gena [7]. FOXO se aktiviraju različitim ekstracelularnim stimulansima, uključujući faktore rasta, citokine i hormone [8]. Signali rasta, kao što je insulin ili insulinu sličan faktor rasta 1 (IGF-1), stupaju u interakciju sa receptorima insulinskog puta i aktiviraju signalizaciju fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K), što dovodi do fosforilacije FOXO od strane serin/treonin kinaza, protein kinaza B (AKT) [9]. Fosforilirani FOXO se translocira iz jezgra u citosol, ili sprečava njegovu translokaciju iz citosola u jezgro, gdje postaje ubikvitiniran, što dovodi do njegove degradacije od strane proteazoma [10]. Nasuprot tome, u odsustvu eksternih signala rasta, PI3K-AKT signalni put je neaktivan, a nefosforilirani FOXO se translocira u jezgro kako bi promovirao transkripciju ciljnog gena [11]. FOXO također učestvuje u antibakterijskim i antivirusnim urođenim imunološkim odgovorima beskičmenjaka [12,13]. Hronična aktivacija FOXO-a u crijevima drozofile koja stare, potiskuje ekspresiju proteina prepoznavanja peptidoglikana SC2 (negativni regulator puta imunodeficijencije (IMD)) i razbija imunološku homeostazu crijeva [14]. FOXO direktno reguliše antimikrobne peptidne (AMP) gene u epitelnim tkivima neinficirane drozofile kao odgovor na stres od gladovanja, što je nezavisno od puteva urođenog imuniteta koji reaguju na patogene [15]. Međutim, infekcija patogenom takođe može izazvati enterocit FOXO da uđe u jezgro iz citoplazme direktno u crevima Drosophila [12]. FOXO-ovisna regulacija AMP-a također se javlja u epitelnim tkivima sisara, što sugerira da je to evolucijski očuvano kod životinja [16]. Nekoliko studija je pokazalo da se FOXO aktiviraju patogenima ili stimulacijom citokina u mukoznim imunološkim odgovorima [17]. Njihova translokacija u jezgro i vezivanje za promotore njihovih ciljnih gena je stimulirana putem proteinske kinaze aktivirane mitogenom (MAP) i inhibirana putem PI3K/AKT puta. Ciljni geni FOXO uključuju proinflamatorne signalne molekule, molekule adhezije i hemokinske receptore [17]. Ostaje nejasno da li su FOXO uključeni u sistemske imune odgovore na patogene. Promoviranje ekspresije AMP protiv patogena važan je mehanizam humoralnog urođenog imuniteta kod beskičmenjaka [18]. U Drosophila urođenom imunitetu, Toll i IMD putevi su uključeni u regulaciju ekspresije AMP, a AMP igraju važnu ulogu u eliminaciji invazivnih patogena [19–21]. Slično imunitetu insekata, Toll, IMD i Janus kinaza (JAK)/transduktor signala i aktivator transkripcijskih (STAT) puteva su uključeni u regulaciju ekspresije AMP kod rakova [22,23]. Da li FOXO može regulirati ekspresiju AMP neovisno o Toll, IMD i JAK/STAT putevima protiv infekcije patogenima kod rakova, zahtijeva pojašnjenje. Osim humoralnog imuniteta, beskičmenjaci se također oslanjaju na ćelijski imunitet za obavljanje funkcija urođenog imuniteta protiv infekcije patogenom. Fagocitoza hemocitima je jedan od važnih mehanizama za ćelijski imunitet protiv infekcije patogenom [24]. Prethodne studije su otkrile da je FOXO1-posredovana autofagija neophodna za razvoj prirodnih ćelija ubica (NK) [25]. Štaviše, FOXO je uključen u promociju bakterijske fagocitoze neutrofilima [26]. Iako ne postoje specijalizirane imunološke stanice u rakova, kao što su NK ćelije ili neutrofili, hemociti škampa mogu ispoljiti sistemski urođeni imunitet protiv infekcije patogenim bakterijama putem fagocitoze [27]. Međutim, nejasno je da li FOXO sudjeluje u patogenoj fagocitozi hemocita kod škampa. Akvakultura škampa je jedna od najbrže rastućih svjetskih industrija za proizvodnju životinjskih proteina i dala je značajan doprinos zadovoljavanju povećane potražnje za životinjskim proteinima širom svijeta. Trenutno je globalna proizvodnja škampa oko 4,88 miliona tona u vrijednosti od oko 39 milijardi USD [28]. Međutim, zajednički uzgoj velikog broja životinja dovodi do značajnog stresa kod životinja, što olakšava patogene, uključujući bakterije i viruse, razmnožavanje i kliničku bolest, što rezultira velikim ekonomskim gubicima za industriju [29]. Studije imunoloških mehanizama škampa mogle bi pružiti nove strategije za prevenciju i kontrolu bolesti [30]. U ovoj studiji identifikovali smo FOXO u škampi kuruma (Marsupenaeus japonicus). Nakon obaranja Foxo ekspresije, nakon izazova Vibrio anguillarum, otkrili smo da su sposobnost uklanjanja bakterija i stopa preživljavanja škampa značajno smanjeni. Dalja studija je pokazala da FOXO promovira ekspresiju AMP direktno ili indirektno, i pojačava fagocitozu bakterija u škampima. Analizirani su mogući mehanizmi djelovanja FOXO-a na infekciju patogena kod škampa.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Rezultati
FOXO se ekspresira na bazalnom nivou kod neizraženih škampa i povišen je u škampima izazvanim V. anguillarum
Od sekvenciranja transkriptoma hemocita M. japonicus, dobili smo cDNK sekvencu pune dužine Foxo (GenBank pristupni broj: MW080526). Poređenje domena pokazalo je da predviđeni FOXO protein ima domen Forkhead (FH), koji je sličan Homosapiens FOXOs uključujući FOXO1, FOXO3, FOXO4 i FOXO6, i nosi sličnu AKT fosforilaciju (S1A slika). Rezultati filogenetske analize su pokazali da su FOXO podijeljeni u dva klastera uključujući FOXO kičmenjaka i beskičmenjaka, a FOXO škampa je grupiran u grani beskičmenjaka u filogenetskom stablu (S1B sl.). Slično kao kod ljudi FOXO [31], FOXO škampa ima mjesta za modifikaciju fosforilacije vanćelijske regulirane kinaze (ERK) i mjesta za modifikaciju acetilacije CREB Binding Protein (CBP), ali nema mjesta modifikacije deacetilacije sir tuin 1 (SIRT1) i c-JUN N- mesta modifikacije fosforilacije kinaze (JNK) (S2 slika). Poliklonska antitijela koja prepoznaju FOXO škampa pripremljena su korištenjem rekombinantnog FH domena FOXO eksprimirane u Escherichia coli (slika 1A). Analiza distribucije FOXO u tkivima na nivou mRNA i proteina pokazala je da je eksprimiran u svim testiranim tkivima (slika 1B). Vremenski tok ekspresije FOXO u hemocitima i crijevima škampa izazvanih V. anguillarum analiziran je korištenjem qPCR-a i Western blotting-a. Rezultati su pokazali da je FOXO pojačan u hemocitima i crijevima na nivou mRNA (slike 1C i 1D) i na nivou proteina (slike 1E i 1F). Ovi rezultati sugeriraju da je FOXO uključen u odgovor na infekciju V. anguillarum i potaknuli su nas da istražimo funkciju FOXO u imunitetu škampa.
FOXO sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i crijevne mikroflore kod zdravih škampa
Da bi se istražila funkcija FOXO-a u hemolimfi i homeostazi crijevne mikroflore kod škampa, izvršena je interferencija RNK i analizirano je opterećenje bakterijama. Rezultati su pokazali da je ekspresija Foxo-a značajno smanjena kod Foxo-RNAi škampa (slike 2A i 2B). Efekti Foxo RNAi van cilja su takođe analizirani otkrivanjem ekspresije drugih gena porodice Fox (uključujući Foxk2 i Foxn3). Rezultati su pokazali da nokdaun Foxo-a nije smanjio nivoe ekspresije Foxk2 ili Foxn3 (S3A-S3C sl.). Koristeći Western blotting i fluorescentne imunocitohemijske testove, dalje smo promatrali subcelularnu distribuciju FOXO u crijevima i hemocitima škampa izazvanih bakterijama nakon utišavanja Foxa. Rezultati su pokazali da je u poređenju sa dsGfp grupom, nivo FOXO u jezgru značajno smanjen kod Foxo-RNAi škampa, čak i ako su škampi bili zaraženi V. anguillarum (S3D-S4E' slike). Svi gore navedeni rezultati sugeriraju da bi naš Foxo RNAi test mogao specifično utišati Foxo u hemocitima i crijevima (uključujući citoplazmu i jezgro). Zatim smo analizirali opterećenje bakterijama u hemolimfi i crijevima nakon nokdauna Foxoa kod škampa u normalnim uvjetima (bez bakterijskog izazova). Rezultati su pokazali da se broj bakterija u hemolimfi i crijevima značajno povećao nakon što je Foxo ekspresija uspješno oborena (slike 2C i 2D). Dalje smo analizirali stopu preživljavanja Foxo-RNAi škampa bez bakterijskog izazova, a rezultati su pokazali da se stopa preživljavanja Foxo-knockdown škampa značajno smanjila u odnosu na kontrolu (slika 2E). Da bismo dodatno potvrdili ove rezultate, analizirali smo stopu preživljavanja Foxo-RNAi škampa tretiranih antibioticima i rezultati su pokazali da u poređenju sa dsGfp grupom, stopa preživljavanja škampa bez klica nije značajno smanjena (slika 2F). Svi rezultati sugeriraju da FOXO igra ulogu u homeostazi in vivo mikrobiote (uključujući hemolimfu i enteričku mikrobiotu) kod škampa u normalnim uvjetima.
Prednosti suplementa cistanche-povećavaju imunitet
FOXO sudjeluje u regulaciji hemolimfe i homeostaze crijevne mikroflore promovirajući Relish i Amp ekspresiju kod zdravih škampa
Prethodne studije pokazuju da zdravi škampi sadrže nizak, ali stabilan broj bakterija u cirkulirajućoj hemolimfi, i velike, ali konstantne količine bakterija u gastrointestinalnom traktu, i imunološke efektore, kao što su antimikrobni peptidi (AMP) regulirani nuklearnim faktorom kapa B (NF). -κB) put i reaktivne vrste kisika (ROS) regulirane putem dualne oksidaze (DUOX) igraju bitnu ulogu u homeostazi hemolimfe i crijevne mikrobiote [32–34]. Da bismo istražili mehanizam uključivanja FOXO-a u regulaciju homeostaze hemolimfe i crijevne mikroflore u normalnim uvjetima, prvo smo otkrili subćelijsku distribuciju FOXO-a u hemocitima i crijevima u normalnim uvjetima. Rezultati su pokazali slab signal FOXO u jezgrama hemocita škampa i crijevnih stanica u normalnim uvjetima (slike 3A i 3B), što sugerira da je malo FOXO aktivirano od strane in vivo mikrobiote kod škampa u normalnim uvjetima. Ekspresija AMP regulirana je putem IMD u crijevima Drosophila [35]. Stoga smo pretpostavili da bi transkripcijski faktor Relish mogao biti ciljni gen FOXO-a. Otkrili smo ekspresiju mRNA Relisha, faktora transkripcije IMD puta, u hemocitima i crijevima škampa nakon nokdauna Foxa. Rezultati su pokazali da se ekspresija Relisha značajno smanjila kod Foxo-nokdown škampa (slike 3C i 3D), a slični rezultati su dobijeni na nivou proteina (slike 3E i 3E'). Rezultati su pokazali da FOXO može promovirati ekspresiju Relisha i aktivirati IMD put. Da bi se potvrdilo da FOXO učestvuje u homeostazi hemo limfe i gastrointestinalnog trakta putem IMD signalizacije, dobijeni su škampi bez klica (slika 3F) i otkrivena je RELISH aktivacija i ekspresija AMP. U poređenju sa kontrolom, količina FOXO-a i RELISH-a u jezgrima crijevnih ćelija i hemocita značajno je smanjena (slike 3G i 3H). U međuvremenu, ekspresija AMP, uključujući Crustins (CrusI-2 do 5) i anti-lipopolisaharidnih faktora (Alf A1, B1, C1, D1 i E1), vjerovatno regulirana FOXO-om i/ili RELISH-om, testirana je u klici -slobodne škampe, a rezultati su pokazali da je ekspresija CrusI-3, Alf-B1 i Alf-C1 značajno smanjena u hemocitima i crijevima škampa (slike 3I i 3J). S obzirom da je ekspresija Alf-B1 i Alf C1 regulirana putem IMD [36], ovi rezultati sugeriraju da FOXO sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i gastrointestinalnog trakta u normalnim uvjetima putem IMD puta kako bi promovirao ekspresiju AMPs.
Slika 1. FOXO je povećan kod škampa izazvanih V. anguillarum. (A) Rekombinantna ekspresija FH domena FOXO u E. coli i western blotting za detekciju FOXO korištenjem poliklonskih antitijela protiv FOXO pripremljenih kod zečeva. Traka 1, ukupni proteini E. coli sa Foxo-pGEX4T-1. Traka 2, ukupni proteini bakterija nakon indukcije IPTG. Traka 3, pročišćeni rekombinantni FOXO. Traka 4, FOXO u crijevima neobrađenih škampa otkrivena je pomoću western blotinga. M, Markeri molekularne mase proteina. (B) Distribucija Foxo-a u tkivu na nivoima mRNA (gornji panel) i proteina (donja ploča) detektirana je RT-PCR-om i Western blotting-om, respektivno. ACTB je skraćenica od -actin. (C, D) Obrasci ekspresije mRNA Foxo u hemocitima (C) i crijevima (D) analizirani su qPCR koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (E, F) Obrasci ekspresije proteina FOXO u hemocitima (E) i crijevima (F) otkriveni su Western blottingom. Rezultati statističke analize tri replika prikazani su u donjim panelima. Trake na western blot-u su digitalizirane pomoću softvera ImageJ skeniranjem traka iz tri nezavisna ponavljanja. Relativni nivoi ekspresije FOXO/-aktina izraženi su kao srednja vrednost ± SD, a vrednost kontrolnog škampa je postavljena kao jedna. Trake grešaka na slici označavaju SD-ove (tri ponavljanja).
FOXO se kod škampa aktivira izazovom V. anguillarum i učestvuje u uklanjanju patogena iz hemolimfe i crijeva
Prijavljeno je da FOXO može biti aktiviran bakterijskom ili citokinskom stimulacijom i translociran u jezgro kako bi regulisao ekspresiju određenih ciljnih gena kod sisara [17]. Da bi se otkrilo da li je FOXO aktiviran u škampima izazvanim bakterijama, subcelularna distribucija FOXO u crijevima škampa je analizirana korištenjem Western blottinga. Rezultati su pokazali da se količina FOXO u citoplazmi crijevnih stanica postepeno smanjivala od 2 do 4 h nakon izazivanja V. anguillarum (slika 4A). Nasuprot tome, količina FOXO u jezgru crijevnih stanica značajno se povećala nakon infekcije V. anguillarum (slika 4B). Da bi se analizirala uloga FOXO-a u sistemskom imunitetu, fluorescentnim imunocitokemijskim testom je uočena nuklearna translokacija FOXO-a u hemocitima škampa 2 h nakon V. godišnje stimulacije larumom. Otkrili smo da se translokacija FOXO-a izazvana bakterijskim izazovom u jezgru značajno povećala, ali nije bilo očigledne promjene kod škampa izazvanih PBS-om (slike 4C i 4C'). Da bismo istražili je li translocirani nuklearni FOXO uključen u čišćenje patogena, analizirali smo bakterijsko opterećenje u hemolimfi i crijevima kod Foxo-nokdown škampa 6 sati nakon bakterijskog izazova. Otkrili smo da se nakon nokdauna Foxo-a opterećenje bakterijama u hemolimfi i crijevima značajno povećalo u usporedbi s onim u kontrolnim grupama (slika 4D). Štoviše, stopa preživljavanja Foxo-nockdown škampa zaraženih V. anguillarum značajno se smanjila u usporedbi s kontrolnom (Slika 4E). Ovi rezultati su pokazali da se FOXO aktivirao u ćelijama crijeva i hemocitima, te sugerirali da FOXO sudjeluje u lokalnim i sistemskim imunološkim odgovorima protiv bakterijske infekcije.
Slika 2. FOXO učestvuje u crevnim (lokalnim) i sistemskim antibakterijskim imunim odgovorima. (A, B) Efikasnost Foxo-RNAi u hemocitima (A) i crijevima (B) škampa, kako je utvrđeno korištenjem qPCR (A) i Western blotting-a (B). Analiza datuma qPCR koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. Trake grešaka prikazuju SD-ove. (C) Detekcija hemolimfnih bakterija Foxo-knockdown škampa čvrstom LB kulturom (tri ponavljanja); dsGfp injekcija je korištena kao kontrola. Odnos razblaženja bio je 1:10. (D). Broj bakterija u hemolimfi i crijevima kod škampa Foxo nokdown i dsGfp-injection škampa bez bakterijskog izazova. (E). Stopa preživljavanja Foxo-RNAi škampa bez bakterijskog izazova. dsGfp injekcija je korištena kao kontrola. (F). Stopa preživljavanja Foxo-RNAi škampa tretiranih antibioticima. dsGfp injekcija je korištena kao kontrola. Normalno: divlji škampi koji nisu tretirani antibioticima.
Slika 3. Bazalna količina FOXO translocira se u jezgra hemocita i crijevnih stanica promoviše ekspresiju Relisha i nakon toga aktivira IMD put za regulaciju hemolimfe i homeostaze crijevne mikrobiote u normalnim uvjetima. (A) Imunocitohemija je korištena za otkrivanje subcelularne distribucije FOXO u hemocitima normalnih škampa. Skalirana traka=20 μm. Cy: Citoplazma; Nu: Nukleus. (B) Western blotting je korišten za otkrivanje subcelularne distribucije FOXO u stanicama crijeva normalnih škampa i škampa inficiranih V. anguillarum. (C) Ekspresija Relish-a na nivou mRNA otkrivena je u hemocitima škampa nakon nokdauna Foxo-a qPCR-om koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (D) Ekspresija Relish-a na nivou mRNA u crijevima škampa nakon nokdauna Foxo-a otkrivena je qPCR-om koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (E) Nivo RELISH je detektovan korištenjem Western blottinga kod škampa nakon pada Foxo-a. (E') Tri replika panela E su digitalizovane korišćenjem softvera ImageJ. (F) Bakterijsko opterećenje hemolimfe i crijeva kod škampa 24 h nakon liječenja antibioticima. (G) FOXO u jezgru je detektovan primenom Western blotinga u hemocitima i crijevima škampa 24 h nakon tretmana antibioticima. (H) RELISH u jezgru je otkriven korištenjem Western blottinga u hemocitima škampa i crijevima 24 h nakon tretmana antibioticima. (I, J) Ekspresija Amps u hemocitima (I) i crijevima (J) škampa bez klica određena je qPCR korištenjem -aktina i Ef-1 kao internih referentnih gena. Kao kontrola korišteni su normalni škampi (injekcija H2O).
Prethodne studije su pokazale da je transkripciona aktivnost FOXO regulisana modifikacijom fosforilacije i da serin/treonin kinaza AKT reguliše aktivnost transkripcionih faktora Forkhead tako što ih fosforiliše i inhibira njihovu nejasnu translokaciju [9,37]. Da bismo ispitali da li je AKT utjecao na povećanje FOXO u jezgru nakon infekcije patogenim bakterijama, prvo smo otkrili sadržaj FOXO u citoplazmi i jezgri western blottingom nakon nokdauna Akt škampa. Rezultati su pokazali da se količina FOXO-a u jezgru hemocita i crijevnih stanica značajno povećala nakon nokdauna ekspresije Akt (Slike 5A i 5B) kod škampa 2 h nakon infekcije V. anguillarum (Slike 5C i 5C'). Da bismo potvrdili eksperimentalne rezultate, koristili smo i imunocitokemijski test za promatranje subcelularne distribucije FOXO u hemocitima škampa nakon nokdauna Akt. Rezultati su pokazali da je FOXO značajno povećan u jezgru hemocita kada je Akt srušio 2 h nakon infekcije V. anguillarum (Slike 5D i 5D'). Da bismo istražili utječe li infekcija patogenom na aktivnost AKT, otkrili smo promjenu fosforilacije AKT nakon infekcije patogenom pomoću humanog p-AKT (Ser473) antitijela (mesto fosforilacije AKT škampa je Ser486) i otkrili da se nivo fosforiliranog AKT značajno smanjio u hemociti i crijeva škampa nakon 30 minuta infekcije V. anguillarum (Slike 5E i 5F). Ovi rezultati sugeriraju da infekcija patogenom može smanjiti nivo fosforiliranog AKT-a, koji inhibira aktivnost enzima i smanjuje sposobnost AKT-a da fosforilira FOXO. Nefosforilirani FOXO ulazi u nukleus i inducira ekspresiju svojih ciljnih gena. slika označava SD-ove.
ekstrakt cistanche
Infekcija patogenom smanjuje aktivnost AKT-a i inducira translokaciju FOXO jezgre
FOXO pruža imunološku obranu od invazijskih bakterija reguliranjem ekspresije antimikrobnih peptida u škampima zaraženim bakterijama
Kako bismo istražili mehanizam pomoću kojeg FOXO utječe na odgovor na bakterijsku infekciju kod škampa, prvo smo identificirali imunološke efektorske gene koje regulira FOXO. Nakon uspješnog uništavanja Foxoa u hemocitima i crijevima škampa sa ili bez izazivanja V. anguillarum, nivoi ekspresije CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 i Alf-E1 značajno su se smanjili kod tihih škampa u poređenju sa onima u kontrolnoj grupi (slike 6A i 6B). Da bismo dalje provjerili rezultate, također smo otkrili ekspresiju četiri AMP nakon nokdauna Akt. Rezultati su pokazali da se ekspresija četiri AMP značajno povećala 6 h nakon infekcije V. anguil larum u poređenju sa onom u kontrolnoj grupi (slike 6C i 6D). U poređenju sa povećanom regulacijom AMP-a (uključujući Alf-B1 i Alf-C1) u normalnom stanju (slike 3I i 3J), dodatni gen AMP-a (CrusI-3, Alf-E1) je također povećan u škampi zaraženim V. anguillarum (slike 6A i 6B). Naša prethodna studija je pokazala da je RELISH promovirao ekspresiju Alf-B1 i Alf-C1 u škampima [36]. Ovi rezultati ukazuju na to da FOXO može direktno regulisati ekspresiju AMP-a, kao što su CrusI-3 i Alf-E1, nezavisno od IMD signalnog puta. Da bi se potvrdila hipoteza, izvršen je ChIP test kako bi se otkrilo može li se FOXO vezati za promotor Alf-E1. Dobijena je promotorska sekvenca Alf-E1 (S4 slika) i predviđena su mesta vezivanja FOXO (slika 6E). ChIP rezultat je pokazao da se FOXO može vezati za promotor Alf-E1 (slika 6F). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO također učestvuje u antibakterijskom imunitetu tako što direktno regulira ekspresiju AMP-a u škampima.
Slika 4. FOXO translociran u nukleus kod škampa izazvanih V. anguillarum. (A, B) Obrasci distribucije FOXO u citoplazmi (A) i jezgru (B) crijevnih stanica škampa izazvanih bakterijama, kako je analizirano korištenjem Western blottinga (donji paneli A i B). Vestern blot trake su digitalizovane pomoću softvera ImageJ skeniranjem traka iz tri ponavljanja. Relativni nivoi ekspresije FOXO/-aktina ili FOXO/Histona 3 izraženi su kao srednja vrednost ± SD, a vrednost kontrolnog škampa je postavljena kao jedna. (C) Nuklearna translokacija FOXO u hemocitima škampa 2 h nakon V. anguillarum izazov je otkriven korištenjem fluorescentnih imunocitokemijskih testova. PBS injekcija je korištena kao kontrola. Skalirana traka=20 μm. (C') Statistička analiza panela C Kolokalizacija FOXO i DAPI obojenih jezgara u hemocitima je analizirana pomoću softvera WCIF ImageJ. (D) Broj bakterija u hemolimfi i crijevima Foxo-knockdown škampa nakon injekcije V. anguillarum; dsGfp-injekcija u škampe nakon bakterijske injekcije korištena je kao kontrola. (E) Stopa preživljavanja Foxo-RNAi škampa zaraženih V. anguillarum. dsGfp injekcija je korištena kao kontrola.
FOXO potiče fagocitozu hemocita protiv bakterija promovišući ekspresiju SRC
Prethodne studije su izvijestile da FOXO stupa u direktnu interakciju s promotorskim regijama CXCR2 i CD11b kako bi regulisao fagocitozu neutrofila kod sisara [26]. Da bismo provjerili je li FOXO povezan s fagocitozom hemocita u antibakterijskom imunitetu škampa, ispitali smo stopu fagocita nakon interferencije s Foxom koristeći različite metode. Nakon nokdauna Foxo-a, stopa fagocita i fagocitni indeks grupe Foxo-knockdown bili su značajno niži od onih u kontrolnoj grupi (dsGfp) (slike 7A i 7A'). Također smo koristili protočnu citometriju za kvantificiranje stope fagocita hemocita nakon utišavanja Foxo-a. Rezultati su pokazali da je stopa citoze faga u Foxo-RNAi grupi takođe značajno smanjena u poređenju sa dsGfp grupom (slike 7B i 7B'). Da bismo dodatno potvrdili ove rezultate, ispitali smo i brzinu fagocita nakon nokdauna Akt. Rezultati su pokazali da su u poređenju sa onima iz kontrolne grupe, stopa fagocita i fagocitni indeks značajno porasli (slike 7C i 7C'). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO potiče fagocitozu hemocita kod škampa. Da bismo istražili kako FOXO pojačava fagocitozu hemocita kod škampa, otkrili smo ekspresiju ranije prijavljenih gena uključenih u fagocitozu škampa. Prijavljeno je da su receptori čistača klase B (SRB) i klase C (SRC) uključeni u fagocitozu hemocita [38,39]. Otkrili smo da se nivo ekspresije mRNA Src, a ne Srb, značajno smanjio nakon utišavanja Foxo u hemocitima i crijevima (Slika 7D i 7E), dok se ekspresija Src značajno povećala nakon obaranje Akt u škampi (Slika 7F). Slični rezultati su dobijeni na nivou proteina (slike 7G i 7G'). Ovi rezultati sugeriraju da FOXO potiče fagocitozu hemocita patogena kod škampa promovišući ekspresiju SRC.
FOXO podstiče ekspresiju RAB5 i RAB7 tokom fagocitoze kod škampa
Prethodne studije su pokazale da su male GTPaze, RAB5 i RAB7, ključni regulatori transporta tek endocitoziranih vezikula do ranih i kasnih endozoma [40]. RAB5 je ključni regulator početnih događaja fuzije i marker je ranih endozoma [41,42]. RAB7 je neophodan za kasnu fuziju fagozoma-lizozoma i marker je kasnih endozoma [43]. Kako bismo istražili jesu li RAB5 i RAB7 uključeni u čišćenje patogena kod škampa, prvo smo analizirali obrasce ekspresije Rab5 i Rab7 i otkrili da su dvije male GTPaze pojačane kod škampa izazvanih bakterijama (S5A-S5D slika). Nadalje smo analizirali stopu preživljavanja Rab5-RNAi i Rab7-RNAi škampa nakon bakterijske infekcije, a rezultati su pokazali da je stopa preživljavanja Rab5 i Rab7 nokdown škampa značajno smanjena u odnosu na kontrolu ( S5E i S5F sl). Ovi rezultati sugeriraju da RAB5 i RAB7 igraju važne funkcije u otpornosti na bakterijske patogene. Da bismo istražili jesu li RAB5 i RAB7 uključeni u fagocitozu posredovanu FOXO, ispitali smo nivoe ekspresije mRNA Rab5 i Rab7 nakon interferencije s ekspresijom Foxo kod škampa. Rezultati su pokazali da su razine ekspresije Rab5 i Rab7 značajno smanjene u hemocitima i crijevima (slike 8A i S6A). dok se ekspresija Rab5 i Rab7 značajno povećala nakon pada Akt kod škampa (slika 8B). Da bi se dodatno potvrdili gornji rezultati, također su otkriveni nivoi proteina RAB5 i RAB7 u Foxo ili Akt škampima. U poređenju sa grupom za injekcije dsGfp, nivoi RAB5 i RAB7 takođe su se značajno smanjili u hemocitima i crevima kod Foxo-knockdown škampa, ali su se značajno povećali u Akt-knockdown škampa 2 h nakon stimulacije V. anguillarum (slike 8C–8D'; S6B i S6B'). Ovi rezultati sugeriraju da RAB5 i RAB7 učestvuju u FOXO posredovanoj fagnoj citozi hemocita kod škampa. Nadalje smo otkrili da su RAB5 i RAB7 ko-lokalizirani s V. anguillarum u hemocitima škampa (slika 9). Uzeti zajedno, rezultati sugeriraju da su RAB5 i RAB7 uključeni u FOXO posredovanu fagocitozu kod škampa.
Slika 5. Patogena infekcija je smanjila aktivnost AKT-a, što je potaknulo translokaciju FOXO jezgre u hemocitima i enteričnim stanicama škampa. (A, B) Efikasnost Akt-RNAi u hemocitima i crijevima škampa, kako je utvrđeno qPCR korištenjem geometrijske srednje ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena (A) i Western blotting (B). (C) Količina FOXO-a u citoplazmi i jezgru crijeva Akt-knockdown škampa analizirana je Western blottingom. dsGfp je korišten kao kontrola. (C') Statistička analiza panela (C). ImageJ softver je korišten za digitalizaciju traka skeniranjem slika sa tri ponavljanja. (D) Nuklearna translokacija FOXO u hemocitima Akt-knockdown škampa otkrivena je 2 h nakon izazivanja V. anguillarum upotrebom fluorescentnog imunocitokemijskog testa. dsGfp je korišten kao kontrola. Skala bar=20 μm. (D') Statistička analiza (D). WCIF ImageJ softver je korišten za analizu ko-lokalizacije odnosom intenziteta fluorescencije anti-FOXO (zeleno) i DAPI obojenog jezgra (plavo) u hemocitima nakon fiksiranja vrijednosti izloženosti. (E, F) Promjena sadržaja fosforiliranog AKT (p-AKT) u hemocitima (E) i crijevima (F) škampa izazvanih V. anguillarum. Donji paneli su digitalizovane figure (E) i (F) zasnovane na trakama western blotinga i statističke analize, respektivno.
Cistanche čaj
Diskusija
FOXO, kao veoma važan faktor transkripcije, učestvuje u mnogim fiziološkim i metaboličkim funkcijama [44,45]. U ovoj studiji identifikovali smo FOXO iz škampa (M. japonicus) i otkrili da sudjeluje u regulaciji homeostaze hemolimfe i enterične mikrobiote regulacijom ekspresije AMP u normalnim uvjetima. FOXO se može aktivirati bakterijskom infekcijom kod škampa i translocirati u jezgro, gdje reguliše direktno i indirektno (putem IMD) ekspresiju AMP. FOXO je pojačao ekspresiju gena povezanih s fagocitozom, kao što su SRC i male GTPaze, RAB5 i RAB7, kako bi promovirao fagocitozu hemocita protiv patogena. Stoga, škampi FOXO imaju različite uloge u sistemskim i lokalnim (enteričnim) imunološkim odgovorima na patogene (Slika 10). U poređenju sa ljudskim FOXO, FOXO škampa ima relativno očuvanu aminokiselinsku sekvencu i mesta fosforilacije AKT; međutim, drugo mjesto fosforilacije AKT kod škampa FOXO je treonin umjesto serina. AKT fosforilacija FOXO kontrolira nuklearni i citoplazmatski transport FOXO-a [9]. U ovoj studiji smo otkrili da je AKT povezan s kontrolom ulaska FOXO-a u nuklearnu energiju. Nakon infekcije V. anguillarum, razina fosforiliranog AKT-a je značajno smanjena, što ukazuje na smanjenje aktivnosti AKT-a kod škampa inficiranih patogenom, čime se povećava nuklearna retencija ili nuklearna translokacija FOXO-a, a potom i ekspresija ciljnih gena, kao što su Relish i Amp, da se odupru infekciji patogenom. Prethodne studije su otkrile da FOXO učestvuje u homeostazi crevne mikroflore Drosophile potiskivanjem ekspresije proteina prepoznavanja peptidoglikana SC2 (negativni regulator IMD puta) kako bi se aktivirao put za ekspresiju AMP [14]. RELISH je prijavljen kao ključni ciljni gen FOXO u kontroli tolerancije hipoksije kod Drosophila [46]. Kao i druge životinje, gastrointestinalni trakt škampa sadrži relativno visoku i konstantnu mikrobiotu. Sve veći broj dokaza također otkriva da hemolimfa nekih vodenih zdravih beskralježnjaka, uključujući škampe, također sadrži stabilne količine bakterija [47]. Naša prethodna studija otkrila je da lektin C-tipa učestvuje u regulaciji homeostaze mikrobiote hemolimfe tako što održava ekspresiju AMP [34], ali ne znamo koji su signalni putevi uključeni u regulaciju ekspresije AMP. Ovdje su naši rezultati sugerirali da je FOXO uključen u regulaciju homeostaze hemolimfe i enterične mikroflore putem IMD signalizacije u normalnim uvjetima. Kod neinficiranih škampa, nokdaun Foxo-a je rezultirao značajno smanjenom ekspresijom Relisha, a stopa preživljavanja škampa značajno se smanjila, čak i bez bakterijske infekcije. Također smo pronašli malu količinu FOXO u jezgru normalnih stanica škampa. Stoga smatramo da FOXO učestvuje u regulaciji homeostaze hemolimfe i enterične flore u normalnim uslovima promovišući ekspresiju Relish-a i nakon toga povećavajući ekspresiju AMP putem IMD puta. Ovi rezultati sugeriraju da FOXO sudjeluje u lokalnom i sistemskom imunitetu kako bi promovirao homeostazu mikrobiote hemolimfe i gastrointestinalnog trakta kod škampa. Humoralni imunitet igra kritičnu ulogu u otpornosti na infekciju patogenom u inverznim stopama kroz proizvodnju baterije AMP [21,48]. Humoralni odgovor uključuje inducibilnu sintezu i sekreciju AMP-a, koji se oslobađaju u hemolimfu kao sistemski odgovor, ili se oslobađaju na epidermalnu površinu ili šupljinu gastrointestinalnog trakta kao lokalni odgovor [19]. Ekspresija AMP je uglavnom regulisana Toll/Dif i IMD/Relish signalnim putevima kod voćnih mušica [49]. Trenutno je u škampima identificirano nekoliko porodica AMP-ova, uključujući krustine, anti-lipopolisaharidne faktore (Alfs) i penaeidine [50]. Ova studija je pokazala da FOXO može direktno ili indirektno (putem IMD/Relish signalizacije) regulisati ekspresiju AMP, uključujući CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 i Alf-E1. Smatrali smo da bi niska aktivacija FOXO-a u hemocitima i crijevima škampa u normalnim uvjetima mogla regulisati ključni ciljni gen Foxo-a, tj. Relish, za održavanje homeostaze in vivo mikrobiote. Tokom infekcije, invazivni patogeni aktiviraju FOXO, od kojih se većina translocira u jezgro, gdje reguliše više ciljnih gena, uključujući neke AMP, kao što su Alf-E1 i CrusI-3, pored Relisha. Uzeti zajedno, FOXO sudjeluje u regulaciji hemolimfe i homeostaze crijevne mikrobiote kod zdravih škampa putem aktivacije IMD signala na bazalnom nivou u hemolimfi i gastrointestinalnom traktu. Patogena infekcija aktivira FOXO smanjenjem AKT aktivnosti i promoviše ekspresiju AMP direktno i indirektno u sistemskom imunitetu i lokalnom (crevnom) imunitetu. Fagocitoza je receptor-posredovan, aktin i ATP ovisan fenomen koji se pokreće vezivanjem čestica ili patogena na specifične citomembranske receptore, i predstavlja važan imunološki proces kroz koji se domaćin može zaštititi od patogena [24]. Male GTPaze, kao što su RAB5 i RAB7, uključene su u kontinuirano remodeliranje membrane i promet vezikula u fagocitozi. Naša prethodna studija je objavila da su receptori čistača SRB i SRC uključeni u fagocitozu hemocita kao receptori kod škampa [38,39]. U ovoj studiji smo otkrili da se nakon nokdauna Foxo-a ekspresija Src značajno smanjila, a stopa fagocitoze hemocita značajno smanjena, što sugerira da je Src ciljni gen FOXO-a i da je FOXO uključen u SRC-posredovanu fagocitozu patogenih bakterija. FOXO bi također mogao promovirati ekspresiju dvije male GTPaze, RAB5 i RAB7. Ove male GTPaze su uključene u sekvencijalni transport i ključne su determinante ranih i kasnih fagosoma [51]. Fagozomi migriraju sa periferije ćelije u intracelularni region, pri čemu se RAB5 tokom transporta zamenjuje sa RAB7, a konačna roba se transportuje do lizozoma radi razgradnje [52,53]. Također smo otkrili da se RAB5 i RAB7 mogu ko-lokalizirati s patogenima u hemocitima, što ukazuje da su patogeni fagocitirani od strane hemocita u škampima prolazeći kroz rane i kasne fagozome prije nego što su konačno razgrađeni u lizosomima. Stoga je FOXO uključen u ćelijski imunološki odgovor promovišući fagocitozu hemocita. Zaključno, naši rezultati pokazuju da FOXO ne samo da sudjeluje u regulaciji homeostaze mikrobiote u normalnim uvjetima, već i u uklanjanju patogenih bakterija u inficiranim škampima promicanjem ekspresije AMP-a i fagocitoze hemocita.
Slika 6. FOXO obavlja svoju antibakterijsku ulogu u škampima regulacijom ekspresije AMP. (A, B) Ekspresija Amps u hemocitima (A) i crijevima (B) Foxo-knockdown škampa, kao što je određeno qPCR korištenjem geometrijske srednje ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena; dsGfp injekcija u škampi je korištena kao kontrola. Podaci su statistički analizirani pomoću Mann-Whiteny U testa. (C, D) Ekspresija Amps u hemocitima (C) i crijevima (D) Akt knockdown škampa je analizirana qPCR korištenjem geometrijske srednje ekspresije -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena; dsGfp injekcija u škampi je korištena kao kontrola. Značajne razlike su analizirane korištenjem jednosmjerne ANOVA. (E) Šematski dijagram predviđenih mjesta vezivanja FOXO na promotoru Alf-E1. (F) ChIP i RT-PCR su korišteni za otkrivanje vezivanja FOXO za sekvencu promotora Alf-E1 korištenjem prajmera (Alf-E1-F i Alf-E1-R, Tabela 1). RT-PCR je također korišten za amplifikaciju regije kodiranja Alf-E1 sa RT-PCR prajmerima (Alf-E1-RT-F i Alf-E1-RT-R. Tabela 1) koristeći ChIP dobio DNK kao šablon. IgG antitijelo je korišteno kao kontrola, a normalni genomski DNK amplificirani fragment je korišten da se potvrdi ciljna traka.
Slika 7. FOXO pojačava hemocitnu fagocitozu patogena kod škampa promovišući ekspresiju SRC. (A) Fagocitoza hemocita V. anguillarum opažena fluorescentnim imunocitokemijskim testom pod fluorescentnim mikroskopom. V. anguillarum je označen sa FITC (zeleno), a ćelijska jezgra su obojena DAPI (plavo). Crvena strelica označava fagocitne hemocite. Skalirana traka=20 μm. (A') Statistička analiza stope fagocita i fagocitnog indeksa kod Foxo-knockdown škampa. Grupa dsGfp injekcije je korištena kao kontrola. Pet stotina hemocita je izbrojano pod fluorescentnim mikroskopom u svakom eksperimentu. Podaci su statistički analizirani pomoću Studentovog t-testa. (B) Bakterijska fagocitoza hemocitima analizirana protočnom citometrijom. Fagocitirani hemociti koji sadrže bakterije (R2) su odvojeni od nefagocitiranih hemocita (R3) na osnovu fluorescentnog signala obilježenih bakterija u hemocitima korištenjem softvera IDEAS Application v6.0. (B') Stopa fagocita hemocita na osnovu podataka protočne citometrije. Za svaku analizu je izbrojano tri hiljade hemocita i izvršena su tri ponavljanja. dsGfp grupa je korištena kao kontrola. (C) Fagocitoza hemocita V. anguillarum u Akt oborenim škampima promatrati pod fluorescentnim mikroskopom. Skalirana traka=10 μm. (C') Statistička analiza stope fagocita i fagocitnog indeksa na osnovu podataka u panelu (C). (D) Nivo ekspresije mRNA Srb i Src u hemocitima Foxo nokdaun škampa analiziran qPCR koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. dsGfp injekcija je korištena kao kontrola. (E) Ekspresija mRNA Srb i Src u crijevima Foxo-RNAi škampa analizirana qPCR koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (F) Ekspresija mRNA Src u hemocitima Akt-RNAi škampa analizirana qPCR koristeći srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef{17}} kao endogenih kontrolnih gena. (G) Nivo proteina SRC u hemocitima Foxo-RNAi ili Akt-RNAi škampa, kao što je analizirano korištenjem Western blottinga. dsGfp injekcija se koristi kao kontrola. (G') Statistička analiza zasnovana na podacima tri replika panela (G).
materijali i metode
Etička izjava
Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa kineskim nacionalnim direktivama (GB 14922.2–2011 i GB 14925–2010). Eksperimenti na kunićima za pripremu antitijela u studiji izvedeni su u skladu s protokolima odobrenim od strane Komiteta za brigu o životinjama i dobrobit na Školi prirodnih nauka Univerziteta Shandong (SYDWLL-2021-54). Odobrenje prema propisima o korištenju škampa u našem istraživanju nije bilo potrebno jer je u našem istraživanju korišten ograničen broj običnih škampa koje je šira zajednica često konzumirala.
Životinje
Zdravi škampi (Marsupenaeus japonicus), težine oko 6-10 g svaki, nabavljeni su sa tržišta vodenih proizvoda u Qingdaou, provincija Shandong, Kina. Prije eksperimenta, škampi su uzgajani najmanje 1 dan u sistemu uzgoja škampa sa gaziranom morskom vodom na 23–25˚C radi privikavanja na novu sredinu.
Slika 8. RAB5 i RAB7 su uključeni u FOXO posredovanu fagocitozu hemocita kod škampa. (A, B) qPCR je korišten za analizu nivoa ekspresije mRNA Rab5 i Rab7 u hemocitima Foxo-knockdown škampa (A) i Akt-knockdown škampa (B) sa i bez bakterijske infekcije. qPCR je koristio srednju geometrijsku ekspresiju -aktina i Ef-1 kao endogenih kontrolnih gena. (C) Nivoi proteina RAB5 i RAB7 u hemocitima Foxo-knockdown škampa 2 h nakon izazivanja V. anguillarum određen korištenjem Western blotinga. (C') Statistička analiza zasnovana na podacima tri replika panela (C). (D) Nivoi proteina RAB5 i RAB7 u hemocitima Akt-knockdown škampa 2 h nakon izazivanja V. anguillarum određen korištenjem Western blottinga. (D') Statistička analiza zasnovana na podacima tri replika panela (D).
Bioinformatička analiza
CDNK sekvenca Foxo-a pune dužine dobijena je sekvenciranjem hemocita i intestinalnog transkripta M. japonicus (BGI, Shenzhen, Kina). Otvoreni okvir čitanja (ORF) Foxa je amplificiran korištenjem para prajmera (Foxo-EX-F i Foxo-EX-R; Tabela 1) za potvrdu sekvence. Odgovarajuća cDNK je konceptualno prevedena kako bi se dobila deducirana proteinska sekvenca korištenjem ExPASy-Translation alata (http://cn.expasy.org/). Analiza sličnosti je izvršena pomoću BLAST-a (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), a predviđanje arhitekture domena je izvršeno pomoću SMART-a (http://smart.emblheidelberg.de). Filogenetsko stablo FOXO različitih vrsta konstruirano je korištenjem MEGA 6.0 programa [54].
Slika 9. RAB5 i RAB7 ko-lokalizuju sa V. anguillarum. Kolokalizacija RAB5 i RAB7 sa FITC oznakom-V. anguillarum u hemocitima škampa, kao što je analizirano fluorescentnim imunocitokemijskim testom. Bakterije su označene FITC-om (zeleno) i ubrizgane u škampe. Hemociti su sakupljeni od pet škampa 30 minuta i 1 sat nakon bakterijske injekcije i inkubirani sa anti-RAB5 ili anti RAB7 antitijelima. Sekundarno antitijelo je bio antizečji IgG Alexa-546 (crveni). Jezgra su obojena DAPI (plavo). Ko-lokalizacija u hemocitima je označena bijelim strelicama. Skala bar=10 μm.
Slika 10. Šematski prikaz uključenosti FOXO u lokalni i sistemski urođeni imunitet kod škampa. (A) U neinficiranim uvjetima, FOXO održava homeostazu hemolimfe i crijevne mikrobiote promovišući Relish i kasnije ekspresiju AMP. (B) U inficiranim stanjima, fosforilacija AKT je smanjena infekcijom patogenom, što rezultira povećanjem sadržaja FOXO u jezgru. FOXO direktno promoviše ekspresiju Relisha i AMP-a za eliminaciju invazivnih patogena; s druge strane, FOXO promovira fagocitozu patogena putem puta fagocitoze posredovanog SRC-om.
Bakterijski izazov i sakupljanje uzoraka
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) dobijen sa Marine College, Shandong University (Wei hai, Kina) i sada je sačuvan u našoj laboratoriji. V. anguillarum je kultivisan preko noći na 37˚C u LB medijumu i ponovo kultivisan 4 sata na inokulaciji 1:100 drugog dana. Bakterije u logaritamskoj fazi rasta sakupljene su centrifugiranjem na 5000 × g 5 minuta na 4˚C i isprane dva puta fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, i 1,8 PO4 ). pH 7,4). V. anguillarum resuspendiran u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom za izazivanje škampa. Približno 2 × 107 jedinica koje formiraju kolonije (CFU)/škampi su ubrizgane u abdomen svakog škampa pomoću mikrošprica. Kontrolnoj grupi je ubrizgan isti volumen PBS-a. Hemociti, srce, hepatopankreas, škrge, želudac i crijeva sakupljeni su od najmanje tri škampa za ekstrakciju RNK i proteina. Za sakupljanje hemocita, hemolimfa je ekstrahirana iz ventralnog sinusa pomoću šprica prethodno napunjenog sa 0,8 ml antikoagulansnog pufera (10% natrijum citrata), a zatim brzo centrifugirana na 700 × g 8 minuta na 4˚C za izolaciju hemocita.
Ekstrakcija RNK i proteina i sinteza cDNK
Ukupna RNK je ekstrahirana iz hemocita i različitih organa škampa pomoću TRIzola (ET101, Transgen, Peking, Kina). Proteini iz različitih organa ekstrahovani su pomoću radioimunoprecipitacionog testa (RIPA) liznog pufera (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Kina). Sinteza prvog lanca cDNK izvedena je korištenjem kompleta za sintezu cDNA (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), slijedeći uputstva proizvođača.
Tabela 1. Sekvence prajmera korišćenih u ovoj studiji.
MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Kanada), slijedeći upute proizvođača.
Rekombinantna ekspresija i priprema antitijela
cDNA sekvenca Foxo-a je amplificirana lančanom reakcijom polimeraze reverzne transkripcije (RT-PCR) korištenjem prajmera Foxo-EX-F i Foxo-EX-R (Tabela 1). Prečišćeni PCR proizvodi su zatim digestirani korištenjem restrikcijskih enzima i vezani u plazmid pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, SAD). a konstruisani plazmidi su transformisani u ćelije Escher ichia coli Rosseta (DE3). Ekspresija proteina je indukovana upotrebom 1 mM izopropil- - D-tio galaktopiranozida na 37˚C. Rekombinantni proteini su podvrgnuti afinitetnoj hromatografiji upotrebom glutation (GST) smole (C600031, BBI, Šangaj, Kina), prateći uputstva proizvođača. Zečji antiserumi protiv FOXO pripremljeni su prema prethodno opisanoj metodi [55].
Western blotting
Proteini ekstrahovani iz različitih organa ili hemocita su razdvojeni pomoću 10% natrijum dodecil sulfata poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE). Proteini u SDS-PAGE gelovima su prebačeni na celulozno nitratnu membranu koristeći transfer pufer (25 mM Tris-HCl, 20 mM glicin, 0.037% mM SDS i 20% etanol) i inkubirano u 5% obranom mlijeku ili 3% goveđem serumskom albuminu (BSA) u tris puferiranom fiziološkom rastvoru (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,0) tokom 1 h uz lagano mućkanje na sobnoj temperaturi. Membrane su zatim inkubirane sa primarnim antiserumom: Anti-FOXO u razrjeđenju 1:100, anti-RAB5 u 1:25, anti Rab7 u 1:25, anti-beta aktin (ACTB) u 1:250 (pripremljen u našoj laboratoriji ); Histon{29}} poliklonska antitela (A2348, ABclonal, Wuhan, Kina, 1:2500); anti-fosforilirana (p)-AKT poliklonska antitijela (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Kina, 1:500) i lagano mućkati preko noći na 4˚C. Nakon tri puta pranja sa TBST (0,1% Tween-20 dodato TBS), membrane su inkubirane sa sekundarnim antitijelima (ZB2308 ZSGB-Bio, Peking, Kina, 1:5,000) ili ( ZB2301 ZSGB-Bio, Peking, Kina, 1:5,000) 3 h na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje. Imunoreaktivne proteinske trake su razvijene upotrebom rastvora nitrotetrazolijum plavog hlorida (A610379, BBI) i soli P-toluidina (A610072, BBI) u tamnim uslovima ili korišćenjem poboljšane hemiluminiscencije (ECL). -aktin ili histon{57}} su korišteni kao referencas.
Raspodjela tkiva i obrasci ekspresije kod škampa izazvanih bakterijama
Distribucija Foxo/FOXO u tkivima u hemocitima, srcu, škrgama, sputumu, želucu i crijevima analizirana je pomoću RT-PCR sa prajmerima Foxo-F i Foxo-R (tabela 1) i western blotingom sa anti-FOXO antitelima, respektivno. PCR procedura se sastojala od početne inkubacije na 94˚C u trajanju od 3 min; nakon čega slijedi 35 ciklusa od 94˚C za 30 s, 50˚C za 30 s i 72˚C za 30 s; zatim 72˚C 10 min. PCR proizvodi su analizirani pomoću agaroznog gel elektroforeze (1,5% agaroze). Kao interna kontrola korišćen je -aktin gen (-aktin-F i -aktin-R; tabela 1). Obrasci ekspresije Foxo/FOXO u vremenskom toku na nivoima RNK i proteina kod škampa izazvanih V. anguillarum analizirani su pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu (qPCR) u termocikleru (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Nemačka) i west ern blotting, respektivno. qPCR procedura je uključivala: 95˚C tokom 10 min; 40 ciklusa na 95˚C za 10 s i 60˚C za 50 s; a zatim period topljenja od 65˚C do 95˚C. Profili ekspresije Foxo-a su proizvedeni korišćenjem 2-ΔΔCT metode [56] korišćenjem geometrijske sredine dva interna kontrolna gena -aktina i Ef-1 za normalizaciju. Efikasnost para prajmera u qPCR-u analizirana je primenom MIQE metode [57] sa 10- puta logaritamskim razblaženjem mešavine cDNK da bi se dobila linearna standardna kriva.
Izolacija nuklearnih i citoplazmatskih proteina
Tkivo crijeva je secirano od škampa i isprano u PBS tri puta. Ekstrakcija proteina je provedena korištenjem kompleta za ekstrakciju nuklearnih i citoplazmatskih proteina (R0050, Solarbio, Peking, Kina) prema uputama proizvođača. Najmanje tri škampa su korištene za ekstrakciju proteina kako bi se eliminisale individualne razlike.
RNA interferencijski test
Da bismo analizirali funkciju gena, izveli smo testove RNA interferencije (RNAi). Nekoliko parova prajmera koji sadrže T7 promotorsku sekvencu (Foxo-RI-F i Foxo-RI-R; Rab5-RI-F i Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F i Rab7 -RI-R; Akt-RI-F i Akt-RI-R. Tabela 1) dizajnirani su za amplifikaciju šablona za sintezu dsRNA. Koristeći T7 RNA polimerazu (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) i cDNK šablon, sintetizirali smo dsRNA fragmente. Dvolančani zeleni fluorescentni protein dsGfp RNK je služio kao kontrola, koji je amplificiran korištenjem Gfp-RI-F i Gfp -RI-R (Tabela 1) kao prajmera za sintezu dsGfp. Zatim su dsRNA fragmenti (50 ug/svaki) ubrizgani u abdominalni segment M. japonicus pomoću mikrošprice, a druga injekcija je izvršena 12 h kasnije koristeći istu dozu. Efikasnost RNA interferencije je analizirana pomoću kvantitativne PCR reverzne transkripcije u realnom vremenu (qRT-PCR, koja uključuje reverznu transkripciju RNK da bi se formirala cDNK, koja je zatim korištena kao šablon u qPCR testu) ili western blotting 24 h nakon druge injekcije. -aktin je korišten kao interna referenca.
Reference
1. Calnan DR, Brunet A. FoxO kod. Onkogen. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Put popravke DNK stimulisan transkripcionim faktorom forkhead FOXO3a preko proteina Gadd45. Nauka. 2002; 296 (5567): 530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Živio FOXO: otkrivanje uloge FOXO proteina u starenju i dugovječnosti. Aging Cell. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Troslojna kontrola-fosforilacija, acetilacija i ubikvitinacija FOXO proteina. Cell Cycle. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Regulacija transkripcionih faktora FoxO acetilacijom i interakcijama protein-protein. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. FOXO faktori transkripcije: njihov klinički značaj i regulacija. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Geni koji djeluju nizvodno od DAF-16 da utiču na životni vijek Caenorhabditis elegans. Priroda. 2003; 424(6946):277–284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Insulin/IGF-1R, SIRT1 i FOXOs putevi - intrigantna platforma interakcije za kosti i osteosarkom. Front Endocrinol (Lozana). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt promoviše preživljavanje ćelija fosforilacijom i inhibiranjem transkripcionog faktora vilice. Cell. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 inhibira FOX01 u supresiji tumora kroz degradaciju posredovanu ubikvitinom. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649–1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. Transkripcijski faktor glave vilice DAF-16 prenosi metaboličke signale slične insulinu i signale dugovječnosti kod C. elegans. Priroda. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinalna FoxO signalizacija je potrebna da bi se preživjela oralna infekcija kod Drosophile. Mucosal Immunol. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO reguliše interferenciju RNK u Drosophila i štiti od infekcije RNA virusom. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 promoviše imunološku homeostazu crijeva kako bi se ograničila uobičajena disbioza i produžio životni vijek. Cell. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. FOXO-ovisna regulacija urođene imunološke homeostaze. Priroda. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. FOXO faktori transkripcije regulišu urođene imune mehanizme u epitelnim ćelijama respiratornog trakta. J Immunol. 2013; 190(4):1603–1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Mukozni imunitet i faktori transkripcije FOXO1. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Anti-mikrobni peptidi: od beskičmenjaka do kičmenjaka. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Imunitet kod Drosophila melanogaster—od mikrobnog prepoznavanja do fiziologije cijelog organizma. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Drosophila urođeni imunitet: evolucijska perspektiva. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Imunitet drozofile: putevi i obrasci. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Nedavni napredak u istraživanjima o urođenom imunitetu škampa u Kini. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Vezivanje C-tip domene coilled-coil domene za receptor bez kupole direktno aktivira JAK/STAT put u imunološkom odgovoru škampa na bakterijsku infekciju. PLoS Patog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Fagocitoza: imunobiološki proces. Imunitet. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. FoxO1-posredovana autofagija je neophodna za razvoj NK ćelija i urođeni imunitet. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 reguliše aktivnost neutrofila izazvanu bakterijama. Front Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Lektin C-tipa se vezuje za beta-Integrin kako bi promovirao hemocitnu fagocitozu kod beskičmenjaka. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Učenje škampa u samoodbrani u borbi protiv infekcija. Trends Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Historijski nastanak, utjecaj i trenutni status patogena škampa u Aziji. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Antivirusna odbrana kod škampa: od urođenog imuniteta do virusne infekcije. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. Odnosi strukture/funkcije u osnovi regulacije FOXO transkripcionih faktora. Onkogen. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.
