Fine čestice 2.5 reguliraju melanogenezu u A375 ljudskim stanicama melanoma
Jul 19, 2023
Uredniku: Epidemiološke studije su pokazale da izlaganje finim česticama 2,5 (PM2,5) povećava rizik od hiperpigmentacije kože.[1] Nedavna studija je dokazala da PM2.5 može inducirati melanogenezu regulacijom ekspresije tirozinaze (TYR) i proteina 1 (TYRP1) i 2 (TYRP2) povezanih s tirozinazom preko aril ugljovodoničnih receptora (AhR)/mitogen-aktivirane aktivacije signalne kinaze. 2] AhR je široko rasprostranjen u stanicama kože i njegova ligacija kontrolira oksidaciju/antioksidaciju, funkciju epidermalne barijere, foto-inducirani odgovor, urođeni imunitet i melanogenezu. Može se aktivirati dioksinom i policikličkim aromatičnim ugljovodonicima (sastojci PM2.5), a njegova aktivacija inducira transkripciju gena koji kodiraju enzime metabolizma ksenobiotika i faze I i faze II (citokromi P450 [CYP] 1A1, CYP1A1B1 i CYP1A2). [3,4] BaP i opasni dioksini aktiviraju AhR sa stvaranjem robusnih reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), koje je barem delimično posredovano CYP1A1. Štaviše, oksidativni stres posredovan CYP1A1- je odgovoran za proizvodnju pro-upalnih citokina, kao što su interleukin (IL)-1, IL-6 i IL-8 u okolišu ljudski keratinociti tretirani kontaminantom.[3,5] Međutim, postoji vrlo malo studija o toksičnim efektima PM2.5 na melanogenetske ćelije. Ovdje smo tretirali ljudske ćelije melanoma A375 različitim koncentracijama PM2.5 kako bismo istražili može li PM2.5 promovirati melanogenezu i njegovu vezu s AhR signalizacijom, oksidativnim stresom i upalnim odgovorom.
Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju spermatozoida. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i sposobnost uklanjanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.
Kliknite na dodatak Cistanche Tubulosa
【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2,5 je sakupljen tokom zime (od decembra do januara) u Pekingu. HY-1000 inteligentni uređaj za uzorkovanje totalnih suspendovanih čestica velikog protoka (TSP) (opcioni rezač PM2.5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Kina) je korišten za uzorkovanje kvarcnog filtera. Kvarcna membrana je uronjena u 75 posto etanola nakon čega je uslijedilo ultrazvučno protresanje. Sterilna voda je korištena za pripremu osnovne otopine visoke koncentracije. Ljudske ćelije melanoma A375 uzgajane su u 5 posto CO2 na 37 stupnjeva u redovnom Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, Kalifornija, SAD) koji sadrži fetalni goveđi serum (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, SAD). A375 ćelije su tretirane različitim koncentracijama PM2.5 (0, 100, 200 i 400 ug/mL) tokom 24 sata, a ćelije su korištene za sljedeće studije. Neupareni Studentov t-test i jednosmjerna analiza varijanse korišteni su za statističku analizu, a P < 0,05 smatra se statistički značajnim.
Da bi se istražio uticaj PM2.5 na ćelije A375, detektovana je ćelijska proliferacija korišćenjem kompleta CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), a apoptoza ćelija je detektovana korišćenjem Aneksin V fluorescein izotiocijanata/ propidijum jodid (FITC/PI) komplet za apoptozu (Multisciences, SAD), na osnovu uputstava proizvođača. Rezultati su pokazali da PM2.5 pokazuje citotoksičnost zavisnu od koncentracije za ćelije A375, ali nije utjecala na apoptozu [Dopunska slika 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
Za određivanje sadržaja melanina korištena je metoda NaOH. PM2.{1}}tretirane A375 ćelije su isprane fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera (PBS) i lizirane vodom. Lizati su centrifugirani na 12, 000 r/min 5 minuta, isprani sa 10 posto trihloroctene kiseline (500 mL) (Sigma, St. Louis). , MO, SAD) i 75 posto etanola (500 mL), a zatim ponovo bistre. Nakon toga, 50 mL 1 mol/L NaOH koji sadrži 10 posto dimetil sulfoksida je dodato u pelete 1 sat na 80 stepeni. Apsorbancija na 490 nm (OD 490) je izmjerena pomoću čitača mikroploče. Kako je TYR najvažniji melanogeni enzim, zatim smo otkrili aktivnost TYR pomoću testa levodope (L-DOPA). Ploče sa šest jažica (Corning, SAD) su zasijane A375 ćelijama u gustini od 3 105 ćelija/jažici. Ćelije su zatim isprane PBS-om i lizirane sa 0,5% natrijum deoksiholatom (Sigma). Lizat je podijeljen u tri grupe, a svakom uzorku je dodano 0,1 posto L-DOPA (Sigma). Nakon 5 minuta, izmjeren je OD 490 i 0,1 posto L-DOPA je korišteno kao standard. Takođe smo izmerili nivoe ekspresije mRNA i proteina TYR. Ukupna RNK je ekstrahirana korištenjem RNeasy mini kita (Qiagen, Valencia, CA, USA). Reverzna transkripcija je izvršena korišćenjem kompleta ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japan). Nakon toga, kvantitativna polimerazna lančana reakcija u realnom vremenu (qRT-PCR) je izvedena na Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix-u (TOYOBO, Japan). Prajmeri iz Invitrogena su predstavljeni u Dodatnoj tabeli 1, http://links. lww.com/CM9/A917, a nivo ekspresije svake mRNA je izračunat korištenjem 2*DDCT metode. Nivoi ekspresije proteina su analizirani Western blottingom. Ćelije su isprane PBS-om i lizirane u RIPA puferu (Beyotime, Kina) koji sadrži fenilmetilsulfonil fluorid (mješavina inhibitora proteaze, 20:1, Sigma-Aldrich). Koncentracije proteina su mjerene korištenjem kompleta za analizu proteina BCA (Beyotime, Kina). Ukupni protein je kuvan na 70 stepeni 10 minuta, odvojen u gelu od 4-12 procenata na 200 V tokom 40 minuta, prebačen na membranu na 4 stepena koristeći 120 mA tokom 75-100 minuta, a zatim inkubiran sa 5 procenata nemasnog mleka 1 sat. Membrane su zatim ispitane anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 i anti-CYP1B1 antitelima (Abcam) preko noći na 4 stepena. Kao sekundarno antitijelo korišteno je anti-mišje IgG antitijelo konjugirano s peroksidazom hrena (Proteintech, SAD). Rezultati su pokazali da PM2.5 povećava sadržaj melanina i aktivnost TYR na način koji ovisi o dozi. Nivoi ekspresije TYR-a i mRNA i proteina su povećani [Dopunska slika 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 može povećati aktivnost TYR aktiviranjem AhR puta. Da bismo utvrdili da li PM2.5 utječe na AhR signalizaciju, detektirali smo nivoe transkripcije AhR i njegovih klasičnih gena CYP1A1 i CYP1B1 qRT-PCR-om i western blottingom. Rezultati su pokazali da PM2.5 povećava nivoe ekspresije mRNA AhR i CYP1A1, kao i ekspresiju proteina CYP1A1 [Dopunska slika 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
AhR aktivacija uzrokuje stvaranje ROS-a, što također može povećati aktivnost TYR-a.[5] Stoga smo procijenili proizvodnju ROS-a korištenjem 20,70 -dihlorofluorescein diacetata (DCFHDA) i protočne citometrije. Nakon 24 sata tretmana sa PM2.5, A375 ćelije su inkubirane sa DCFH-DA (5 mmol/L) 30 minuta na 37 stepeni u mraku. Ćelije su dva puta isprane u PBS-u, a fluorescencija je mjerena protočnim citometrom. Srednji intenzitet fluorescencije je kvantifikovan korišćenjem softvera FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, USA). Kako se smatra da je proizvodnja ROS izazvana CYP1A1-odgovornom za upalni odgovor,[5] nivoi ekspresije mRNA proinflamatornih citokina (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} i izmjeren je faktor tumorske nekroze [TNF]-a). Utvrđeno je da PM2.5 povećava proizvodnju ROS, kao i nivoe IL-1a, IL-6 i IL-8 mRNA u A375 ćelijama [Dopunska slika 2 H i I, http ://links. lww.com/CM9/A917].
Nalazi ove studije su pokazali da PM2.5 podstiče melanogenezu i povećava aktivnost i ekspresiju TYR u A375 ćelijama. Štaviše, PM2.5 može aktivirati AhR signalizaciju i inducirati oksidativni stres i upalni odgovor, što može biti melanogena signalna kaskada odgovorna za hiperpigmentaciju.
Priznanja
Izražavamo našu iskrenu zahvalnost sljedećim: prof. dr. Masutaka Furue i prof. dr. Tsuji Gaku iz Univerzitetske bolnice Kyushu koji su poboljšali rukopis i pomogli sa informacijama u vezi sa AhR. Takođe smo zahvalni na engleskoj verziji koju je pružio prof. dr Robert Schwartz sa Rutgers New Jersey Medical School.
Finansiranje
Ova studija je podržana grantom Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (br. 2101000271).
Sukobi interesa
Nema.
Reference
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Izloženost finim česticama povezana sa senilnim lentigom kod kineskih žena: studija poprečnog presjeka. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. Čestice promovišu hiperpigmentaciju putem AhR/MAPK signalne aktivacije i povećanjem parakrinih nivoa a-MSH u keratinocitima. Environ Pollut 2021;278:116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Potencijalna uloga PM2.5 u melanogenezi. Environ Int 2019;132:105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Aril hidrokarbonski receptor (AhR) moguća meta za liječenje kožnih bolesti. Med Hypotheses 2018;116:96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Utjecaj čestica u zraku na kožu: sistematski pregled od epidemiologije do in vitro studija. Dio Fiber Toxicol 2020;17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
