Favonoid, i fito-oksilipin odgovori u naru (Punica Granatum L.) ostavlja 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Metil jasmonat (MeJA) proizveden u biljkama može posredovati u njihovom odgovoru na stresove okoline. Također se pokazalo da egzogena primjena MeJA aktivira signalne puteve i inducira akumulaciju fitoaleksina u mnogim biljnim vrstama. Da bi se razumjelo kako biljke nara biokemijski reagiraju na stresove okoline, provedena je analiza metabolita u listovima nara podvrgnutih MeJA primjeni i otkrila je jedinstvene promjene u hidrolizabilnim taninima, flavonoidima i fito-oksilipinima. Osim toga, transkriptom i qPCR analize u realnom vremenu lažnih i MeJA tretiranih listova nara identificirale su različito izražene metaboličke gene i transkripcione faktore koji su potencijalno uključeni u kontroluhidrolizirajućaputevi tanina, flavonoida i fitooksilipina. Molekularna, biohemijska i bioinformatička karakterizacija jedinoglipoksigenazauz kontinuiranu ekspresiju izazvanu MeJA pokazala je da je sposobna oksidirati polinezasićene masne kiseline, iako se ne nalazi u subćelijskom odjeljku gdje su proizvedeni ne-jasmonatni (ne-JA) fitooksilipini. Ovi rezultati zajedno sugeriraju da, iako je široka supresija flavonoida i antocijanina barem djelomično kontrolirana na nivou transkripcije, inducirana biosinteza ne-JAFito-oksilipinivjerovatno nije regulirano transkripcijski. Općenito, bolje razumijevanje načina na koji listovi nara reaguju na stresove iz okoliša ne samo da će promovirati zdravlje i produktivnost biljaka, već će imati i utjecaj na zdravlje ljudi jer su plodovi koje proizvode biljke nara bogat izvor nutritivnih spojeva.

Ključne riječi:Metil jasmonat.Flavonoid· Antocijanin · Masna kiselina.Fito-oksilipin·Lipoxygenase

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Uvod

Kada su ozlijeđene ili napadnute od biljojeda i patogena, biljke proizvode i emituju metil jasmonat (MeJA), koji se od strane neozlijeđenih biljnih tkiva i susjednih biljaka percipira da aktivira obrambeni odgovor (Cheong i Choi 2003). Dodatno, pokazalo se da egzogena primjena MeJA na biljku izaziva signalne puteve, kao i proizvodnju proteina povezanih s patogenezom i odbrambenih hemikalija poznatih kao fitoaleksini. Fenolni fitoaleksini, npr. flavonoidi i antocijanini, pokazali su povećanu akumulaciju kao odgovor na tretman MeJA u različitim biljkama, kao što su Arabidopsis thaliana, grožđe (Vitis vinifera), banana (Musa acuminate), jabuka (Malus Domestica) i crvena malina (Rubus idaeus )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res i Ruiz del Castillo 2014). Biosinteza flavonoida i antocijanina počinje stvaranjem naringenin halkona iz kumaroil CoA i tri molekula malonil CoA kataliziranih halkon sintazom (CHS) i naknadnom izomerizacijom naringenin halkona u naringenin isomeralse (CHS). Naringenin se zatim koristi za stvaranje skeleta jezgra flavonoida i antocijanina, koji se dalje modificiraju glikozilnim, metilnim, hidroksilnim i prenil funkcionalnim grupama kako bi se stvorile različite strukture i funkcije (Tian et al. 2008).

Cistanche može poboljšati imunitet

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 posto sličnosti) i ne sadrže signalni peptid, dok LOX tipa II posjeduju sveukupnu nisku sličnost sekvence (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Nar (Punica granatum L.) je specijalna hortikulturna kultura cijenjena zbog obilnih fenolnih spojeva u svom plodu, kao što su flavonoidi, antocijanini i hidrolizabilni tanini (HT) koji su izvedeni iz međuproizvoda šikimatskog puta (Ono et al.2016). ). Mnoga istraživanja su se do sada fokusirala na ulogu fenola nara u ublažavanju stresa i bolesti kod ljudi (Wu i Tian 2017). Nasuprot tome, malo se zna o funkciji fenola i drugih fitokemikalija u odbrani nara od abiotskih i biotičkih faktora (npr. ranjavanje, patogeni, MeJA indukcija) u listovima i plodovima. Dva nedavna izvještaja ocjenjivala su tretman MeJA prije berbe na kvalitetu plodova nara nakon berbe (Koushesh Saba i Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Ukupni antocijanini, flavonoidi i fenoli voća tretiranog MeJA, ali ne i listova, analizirani su zbirno pomoću spektrofotometra. Jedna od studija je također analizirala pojedinačne antocijane pomoću masene spektrometrije (Garcia-Pastor et al.2020). Međutim, ostaje nejasno kako biljno tkivo nara, bilo listovi ili plodovi, reagiraju na stresove okoline prije zametanja plodova.

Da bismo započeli seciranje interakcija između biljaka nara i faktora okoline, istražili smo metabolički odgovor listova nara na egzogenu primjenu MeJA koristeći tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC) i tečnu hromatografiju-elektrosprej jonizacionu tandemsku spektrometriju mase (LC-ESI-MS/MS) . Jedinstvene promjene u HT, flavonoidima i antocijaninima, kao i promjene u lipidima, masnim kiselinama i fito-oksilipini uočene su u listovima nara tretiranim MeJA. Komparativna analiza transkriptoma, potvrđena qPCR analizom u realnom vremenu, otkrila je da su strukturni i/ili regulatorni geni uključeni u metabolizam HT, flavonoida, antocijanina i fitooksilipina različito eksprimirani u lažnim i MeJA tretiranim listovima nara. Jedini LOX gen koji je pokazao trajnu pojačanu ekspresiju u listovima tretiranim MeJA podvrgnut je daljnjoj molekularnoj, biohemijskoj i filogenetskoj karakterizaciji.

materijali i metode

Standardi za -glukogalinu i pentagaloil glukozu kupljeni su od Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Šangaj, Kina). Hemikalije korištene u LOX testu nabavljene su od sljedećih dobavljača: 3-(dimetilamino)benzojeva kiselina (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Šangaj, Kina), linolna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD),3-metil-2-benzotiazolinon (MBTH) i hemoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Šangaj, Kina).

Biljni materijal Plodove i sjemenke nara (cv. Wonderful) velikodušno je obezbijedila Panzhihua akademija poljoprivrednih i šumarskih nauka, a identificirao ih je dr. Binjie Ge u Šangajskom botaničkom vrtu Chenshan. Uzorak vaučera (br. CSHO173966) deponovan je u herbarijum Šangajske botaničke bašte Chenshan, Šangaj, Kina. Sadnice nara su uzgajane u prostoriji za rast sa kontrolisanom temperaturom 6 nedelja na 25 stepeni i 16 h svetla/8 h tame. Koncentracija MeJA za prskanje na biljna tkiva se navodno kreće od 100 do 250 μM (Ku et al.2014; Hickman et al. 2017). Različite koncentracije MeJA su prvobitno primijenjene na listove nara, od kojih je 200 μM MeJA dovelo do uočljivog metaboličkog odgovora u preliminarnoj analizi i korišteno je za analize metabolita i ekspresije gena opisane u ovoj studiji. Prije tretmana MeJA, polovina biljaka nara je premještena u drugu prostoriju za uzgoj sa sličnim uslovima. Dok su biljke u jednoj prostoriji za rast prskane sa 200 μM MeJA, one u drugoj prostoriji za rast su prskane vodom (tj. lažna kontrola). U 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,i72-h nakon tretmana, odlazi od 3 do 5 lažnih ili MeJA tretiranih biljaka je spojeno, koje čine jednu biološku repliku. Sakupljene su tri biološke replike za eksperimente s lažnim i MeJA tretmanom; svaka biološka replika je podijeljena u alikvote za profiliranje metabolita i analizu ekspresije gena.

Analiza profilisanja metabolita

Listovi nara su liofilizirani, izvagani i mljeveni u fini prah koristeći zrnca od cirkonija u mješalici (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Njemačka) tokom 90-ih na 30 Hz. Za HPLC analizu, uzorak lista je ekstrahovan u 70 posto metanola tokom 60 minuta pod ultrazvučnom obradom i centrifugiran na 13,{6}} rpm tokom 10 minuta. Supernatant je prebačen u HPLC bočicu, od čega je 30 μL ubrizgano na HPLC reverzne faze (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD) i analizirano kao što je prethodno opisano (Wil-son et al.2019). Metaboliti su detektovani UV apsorpcijom na 254 nm, 280 nm, 320 nm i 360 nm. Konstruisane su standardne kalibracione krive -glukogalina i pentagaloil glukoze; korišteni su za pretvaranje područja pikova koji odgovaraju retencijskim vremenima i spektrima apsorpcije -glukogalina i pentagloil glukoze u odgovarajuće koncentracije.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 se smatralo značajno promijenjenim.

Analiza transkriptoma

Ukupna RNK je ekstrahirana iz listova nara pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i kvantificirana pomoću Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Integritet RNA uzoraka je verifikovan odvajanjem na agaroznom gelu (bez vidljive degradacije) i određivanjem odnosa OD20/28o (između 1,8 i 2,2) korišćenjem Nanodrop2000. Obogaćivanje mRNA iz ukupne RNK je izvršeno korišćenjem oligo (dT) magnetnih kuglica (Invitrogen). mRNA-Seq biblioteke su konstruisane korišćenjem kompleta za pripremu biblioteke Truseq RNA (Illumina, San Diego, Kalifornija, SAD). Analiza transkriptoma je sprovedena na Illumina HiSeq4000 i dobijeno je 55-60 miliona 150-bp uparenih čitanja (PE150) za svaku biblioteku uzoraka. Sirovi podaci o sekvenci obrađeni su uklanjanjem sekvenci adaptera kao i kratkih (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, i prilagođena vrijednost P<>

qPCR analiza u realnom vremenu

Ukupna RNK je ekstrahirana iz lažnih i MeJA tretiranih listova nara pomoću RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Kina). Reverzna transkripcija (RT) je izvedena korištenjem ukupne RNA i PrimeScriptTM RT kompleta reagensa (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). Kvantitativna PCR (qPCR) je provedena korištenjem TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) kompleta ( Takara) i StepOnePlus PCR sistem u realnom vremenu (Ther-moFisher Scientific). Provedena je analiza krivulje topljenja i pokazala je jedan proizvod amplifikacije za svaki par prajmera. Za RT-qPCR analizu, tri biološke replike i svaka sa tri tehničke replike su ispitane na lažne i MeJA-tretirane uzorke. Ekspresija gena je analizirana komparativnom C,(△AC) metodom (Livak i Schmittgen 2001), a nivoi značajnosti su određeni pomoću dvostranog Studentovog t-testa. Sekvence prajmera za qPCR analizu u realnom vremenu i efikasnost amplifikacije parova prajmera prikazani su u tabeli S1.

Ekspresija i pročišćavanje rekombinantnih proteina i enzimski testovi

Otvoreni okvir za čitanje Pgr025417 (kodira navodni LOX) sintetiziran je za optimalnu upotrebu kodona u E. coli (Genewiz, Suzhou, Kina) i kloniran u pET28a. Rekombinantni plazmid je transformiran u E. coli BL21 (DE3) ćelije. Kultura 5-mL Luria Bertani (LB) sa 50ug mL-ikanamicina je pokrenuta iz jedne kolonije i inkubirana preko noći uz mućkanje na 37C. Kultura preko noći je korištena za inokulaciju 100-mL LB medijuma sa 50 ug mL-'kanamicina i ostavljena da naraste do OD600 od 0,5. Izopropil- -D-tiogalaktozid (IPTG) je zatim dodan do konačne koncentracije od 0,1 mM za indukciju ekspresije proteina. Nakon inkubacije uz mućkanje na 16 stepeni tokom 18 sati, ćelije su sakupljene centrifugiranjem. Ćelijske pelete su resuspendirane u puferu za lizu (50 mM NaH, PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 10 mM imidazola) i homogenizirane korištenjem ćelijskog disruptora (Constant Systems Ltd, Northants, UK). Njegovo označeni proteini su pročišćeni korištenjem Ni-NTA kuglice (ThermoFisher Scientific) sa puferom za ispiranje (50 mM NaH,PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 25 mM imidazola) i puferom za eluiranje (50 mM NaH, PO, pH 7,4 300 mM NaClmM imidazol). Prečišćeni proteini su razdvojeni na 10-postotnom SDS-PAGE gelu za vizualizaciju čistoće proteina. Koncentracija pročišćenih proteina određena je Bradfordovim testom (Bradford 1976).

Za LOX test, linolna kiselina je korištena kao supstrat kolorimetrijskom metodom u dva koraka sa malim modifikacijama (Anthon i Barrett 2008). Reakciona smeša 500-μL, uključujući 50 mM Na-fosfata, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM linolne kiseline i različite količine pročišćenih rekombinantnih proteina (1,5 mg mL -), inkubiran je na 25 stepeni 10 min. Drugi rastvor (500 μL) koji sadrži 0,2 mM MBTH i 0,1 mg mL-'hemoglobina je dodat u reakcionu smešu, koja je inkubirana dodatnih 5 minuta. Reakcija je prekinuta dodavanjem 500 μL 1 posto (w/v) natrijum lauril sulfata. Određena je apsorpcija svjetlosti na 598 nm. Subcelularna lokalizacija i filogenetičke analize Pretraživanjem označenog genoma nara (Qin et al. 2017) identifikovano je 1l pretpostavljenih LOX-a pune dužine (786 aa do 970 aa), uključujući Pgr025413,Pgr020032,Pgr020032,Pgr10052,Pgr10808Pgr10808Pgr10208P -dužina sekvence u GenBank XP_031395793),Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 i PgrO13780. Subcelularna lokalizacija i mjesta cijepanja signalnih peptida za LOX nara predviđena su korištenjem TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

Analiza mjesta vezivanja TF

Da bi se predvidela mesta vezivanja TF-ova, 1000 bp uzvodno od ATG start kodona ciljnih gena je dobijeno iz GenBank-a i pretraženo u odnosu na Eucalyptus Grandis TF u PlantRegMap (verzija 5) (Tian et al.2020). Granična vrednost za vezivanje identifikacija lokacije je postavljena na P manje od ili jednako le-4. Statistička analiza za kvantifikaciju metabolita, transkriptom i qPCR podatke u realnom vremenu opisana je u odgovarajućim odjeljcima.

Rezultati

MeJA modulira staničnu signalizaciju i metaboličke puteve u listovima nara

Da bismo razumjeli transkripcijski odgovor nara na izazivanje MeJA, transkriptomi listova nara na 2-h,6-h,24-h i 72-h nakon MeJA ili simulirani tretman (svaki sa tri biološke replike) su analizirani (slika S1). Približno 55 miliona čitanja sirove sekvence (2×150 bp upareni kraj) dobijeno je za svaki transkriptom sa GC-sadržajem oko 52 posto i vrijednosti Q30 u rasponu od 91,6 do 95 posto (Tabela S2). Za sve transkriptome, više od 96 posto očišćenog niza očitavanja je mapirano na referentni genom nara (Qin et al. 2017) (Tabela S3). Većina sastavljenih transkripata bila je manja od 1000 bp (34,3 posto), 1000 bp— 2000 bp (32,9 posto), ili 2000 bp—3000 bp (18,1 posto) (Tabela S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, prilagođena P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Kako bi se utvrdilo da li promjene u količini transkripata shikimata i biosintetskih gena HT mogu uticati na nivo metabolita koji se dobijaju iz ovih puteva, fenolni metaboliti su ekstrahovani iz listova ubranih u 24-h, 30-h. 36-h,48-h, i 72-h nakon MeJA ili lažne aplikacije i analizirane pomoću HPLC (Sl.2). Treba napomenuti da su ove vremenske tačke odabrane kako bi se uračunalo vrijeme potrebno za sintezu proteina i proizvodnju i akumulaciju metabolita nakon uočenih promjena ekspresije šikimat i HT biosintetskih gena u 6- h. Vremena retencije i spektri apsorpcije dva metabolita eluirana na 4,57 min (pik 1) i 24,98 min (pik 2) poklapaju se sa onima za intermedijere HT puta -glukogalin i Penta legure-glukoza, respektivno (slike la i 2a). Oba pika su pokazala značajne promjene u integriranim površinama pikova u više vremenskih tačaka (slika 2b). Konkretno, pik 1 se povećao u listovima tretiranim MeJA u odnosu na lažne kontrole na 30-h, 36-h i 48-h (slika 2b). Zanimljivo je da se pik 2 u listovima tretiranim MeJA u početku smanjio na 24-h, ali se kasnije povećao na 30-h i 36-h prije nego se vratio na nivo sličan lažnim kontrolama u 48- h i 72-h (slika 2b). Smanjenje većine flavonoida i antocijana, kao i povećanje metiliranih flavona i flavonola, bili su očigledni u listovima nara tretiranim MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tabele S5 i S6). Za različito akumulirane metabolite, došlo je do ukupnog obogaćivanja metabolita uključenih u sekundarni/specijalizirani metabolizam biljaka (67 od 102), posebno fenolnih spojeva (63 od 102) (Tabela S6).

Među fenolima, usklađeno smanjenje širokog spektra flavonoida i antocijana (42 od 73 smanjena jedinjenja) bilo je očigledno u listovima tretiranim MeJA (Slika 3; Tabela S6). Intrigantno, tri mono- ili di-O-metilirana flavona i flavonola, uključujući di-O-metil kvercetin, krizoberil O-heksozil-O-heksozid i prodaju 5-O-heksozida, povećana su u listovima tretiranim MeJA (Sl. 3; Tabela S6). Nekoliko intermedijera puteva flavonoida i antocijanina, uključujući luteolin, krizoberil, dihidrokemferol, dihidrokvercetin, dihidromiricetin, epikatehin, delfinidin i pelargonidin, bilo je detektirano, ali nisu pokazale značajne promjene u listovima tretiranim MeJA (S5.3); Derivati ​​hidroksicin-namoila, izoflavoni i kumarini bili su među ostalim fenolima koji su pokazali smanjenu akumulaciju nakon indukcije MeJA (Tabela S6). Nasuprot tome, dvije fenolne kiseline, 2,3-dihidroksibenzojeva kiselina i protokatehična kiselina (3,4-dihidroksibenzojeva kiselina), i kumarin, 6-metil kumarin, povećani su u listovima tretiranim MeJA (Tabela S6).

U skladu sa znatno smanjenim flavonoidima i antocijanima u listovima nara tretiranim MeJA, transkripti dva ključna enzima za biosintezu flavonoida i antocijana. CHS(Pgr005566) i CHI (Pgr025966), su značajno smanjeni na 6-h i 24-h nakon MeJA primjene prema analizi transkriptoma (Sl. 4). qPCR analiza u realnom vremenu je izvršena da se ispita CHS i CHI ekspresija s dodatnim vremenskim tačkama, uključujući 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h, i 72-h (Sl.4). CHS transkripti su pali u listovima tretiranim MeJA u 3-}h i ostali su značajno niži od onih u simuliranim kontrole do 72-h, sa najvećim smanjenjem u 12-h. Nasuprot tome, smanjenje ekspresije CHI bilo je značajno samo na 24-h, 48-h i 72-h nakon tretmana MeJA (slika 4).

Ovaj članak je preuzet iz Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9