Ekstracelularni vezikuli kao novi igrači u bubrežnoj bolesti

"Urin nam može pružiti iz dana u dan, iz mjeseca u mjesec i iz godine u godinu serijsku priču o glavnim događajima u bubrezima." Dr. Thomas Addis, pionir u fiziologiji bubrega, došao je do ovog zaključka 1948. Otkriće urinarnih ekstracelularnih vezikula (uEV) kao molekularnih imitacija ćelija bubrega podiglo je njegov pogled na novi nivo (Slika 1). UEV uključuju vezikule nano veličine koje pupolje van iz ćelijske plazma membrane zdravih ili umirućih ćelija (mikrovezikule ili apoptotska tijela, respektivno) ili se izlučuju putem multivezikularnih tijela u reguliranom procesu (egzozomi). U skladu sa stavom dr. Addisa, uEV-ovi sadrže markere specifične za bolest i mjesto iz stanica koje oblažu bubrežne tubule i urinarni trakt1, što ih čini neprocjenjivim dodatkom markerima disfunkcije bubrega kao što su kreatinin u serumu i proteinurija, koji su nespecifični i kasni. manifestirati. Dokazi koji se razvijaju pokazuju potencijal UEV-a da predvidi bolest ranije od konvencionalnih markera. Zaista, prvi biomarker baziran na uEV nedavno je odobren od strane Uprave za hranu i lijekove u oblasti urologije, gdje uEV RNK potpis služi kao neinvazivna metoda skrininga za rak prostate. Osim njihove uloge u dijagnozi i prognozi, uEV-ovi se sve više proučavaju kao novi glasnici u mehanizmima bubrežnih bolesti iu kontekstu regenerativne medicine. Nedavno je objavljena izjava o stavu od strane Radne grupe za urin Međunarodnog društva za ekstracelularne vezikule kako bi se unaprijedila rigoroznost i standardizacija uEV analize i ubrzala klinička primjena uEV.

Kliknite na fiziološki rastvor za bubreg

1 uEVs ZA DIJAGNOSTIKU I PROGNOZU

Upotreba uEV-a za dijagnozu i prognozu u tečnim biopsijama zavisi od činjenice da ekstracelularni vezikuli (EV) zadržavaju svojstva ćelije iz koje su formirane. UEV dijagnostičke studije mogu se široko podijeliti na dva pristupa: (1) pristupi fokusirani na analizu jednog EV (na primjer, analizom praćenja nanočestica ili protočnom citometrijom) i (2) pristupi fokusirani na masovnu analizu EV, kao što su proteomika ili profiliranje RNA . Fokus pristupa sa jednim EV je generalno nabrajanje uEV-a i ciljana fenotipizacija, kao što je otkrivanje EV ćelije porekla i specifičnog tereta iz glomerularnih i tubularnih ćelija. Rane studije su sugerirale da povišeni nivoi uEV mogu ukazivati ​​na osnovnu bolest. Na primjer, EV urinarnih podocita su povećane kod dijabetičke bolesti bubrega prije albuminurije,2 a povišenja u uEV subpopulacijama su prijavljena kod preeklampsije.3 Mnoge rane studije su značajne po heterogenosti u metodologiji i kasnijim izazovima s vanjskom validacijom. Nekoliko koristi neoptimalne instrumente, nemaju odgovarajuće kontrole ili validaciju antitijela i ne uključuju ortogonalne pristupe za potvrdu izolacije vezikula. Nedavna studija prikazuje moderan pristup procjeni uEV-a pomoću protočne citometrije, koji će biti od suštinskog značaja za prelazak sa istraživačkog alata na klinički test.4

Koristi se sveobuhvatna validacija izolacije vezikula uključujući više proteinskih markera. Autori su također uspostavili ključne kontrole: pufer, pufer plus reagensi, uEV-ovi bez reagensa i preparat liziranih vezikula za smanjenje lažnih pozitivnih rezultata, kao i "molekule ekvivalentnog rastvorljivog fluorohroma" zrnca za standardizaciju jedinica intenziteta fluorescenta. Ovi ključni koraci će omogućiti međulaboratorijsko poređenje rezultata bez obzira na instrument ili softver. Drugi pristup dijagnostici uEV je grupna procena sadržaja uEV. Osnovna studija Pisitkun et al.5 iz 2004. godine utvrdila je izvodljivost proteomske procjene uEV-a i identificirala fundamentalne izazove, kao što je interferencija Tamm-Horsfall proteina. Slični pristupi procjeni tereta EV opisani su za EV vezane nukleinske kiseline, lipide i metabolite. Ključna pretpostavka pri zaključivanju promjena na bubregu od onih koje se vide u uEV je da molekularni sastav uEV odražava onu bubrega. Čini se da nedavni rad Wua et al.6 to podržava. Koristeći proteomski pristup, autori su pokazali jake korelacije između uEV proteina i onih koji se nalaze u cijelim bubrezima. Promjene u ekspresiji proteina u cijelim bubrezima nakon fiziološke stimulacije (visok K1) odrazile su se na uEVs koji su pružali snažnu podršku za upotrebu uEV-a kao zamjenske mjere patologije bubrega.

UEV-ovi ZA FUNKCIJU I REGENERACIJU

Sve je veći interes za funkcionalnu i regenerativnu ulogu uEV. Ćelije su sposobne da komuniciraju oslobađanjem EV-a, koji moduliraju procese u ćelijama primaocima.7–9 Tri tipa takve komunikacije su opisane u bubrezima: (1) intranefron komunikacija koja može objasniti kako glomerularna (npr. oštećenje podocita sa proteinurijom) i oštećenje tubula (npr. hipoksija) uzrokuje intersticijalnu fibrozu,9 (2) intratubularnu komunikaciju (između tubularnih segmenata),7 i (3) komunikaciju cirkulacije sa bubrezima, što je pokazano kod pacijenata sa aktivnim vaskulitisom i pokazalo se da nosi B{{7} }kininske receptore.8 Razumijevanje signalnih puteva izvedenih iz uEV-a moglo bi na kraju dovesti do novih terapijskih ciljeva u bubrežnoj bolesti. Međutim, za funkcionalne studije, važno je proučavati čiste EV preparate i kontrastirati te frakcije sa izolovanim ne-EV materijalom ("EV korona" ili ne-EV eluat).1

Istraživač počinje da prevodi in vitro nalaze u in vivo modele, uključujući upotrebu obilježenih ili označenih električnih vozila, i da validira nalaze u ljudskim kohortama. Na primjer, Lv et al.10 koristili su sistem kulture u transwell kako bi pokazali da tubularne epitelne ćelije stimulirane albuminom proizvode EV koji sadrže inflamatorne citokine CC Motif Chemokine Ligand 2 (CCL2). EV iz ovih tubularnih epitelnih ćelija tretiranih albuminom ubrizgane su miševima i izazvale tubularne ozljede u in vivo modelu. Pored toga, CCL2 glasnička RNK u uEV je pronađena kod pacijenata sa proteinurskom IgA nefropatijom, podržavajući translacioni potencijal.10 Terapijska uloga EV-ova izvedenih iz matičnih ćelija dugo je proučavana kod akutne bolesti bubrega i CKD. Vrlo nedavno, regenerativna uloga uEV-a od zdravih donora je demonstrirana u modelu AKI-a izazvanog glicerolom.11 uEV-ovi su poboljšali oporavak bubrega, stimulirali proliferaciju tubularne ćelije i smanjili ekspresiju markera upale i ozljede, vraćajući endogeni gubitak Klotho-a. Autori su izvršili dodatne korake prečišćavanja kako bi dobili čiste EV, temeljnu EV karakterizaciju EV (CD81, CD63) i proteina koji nisu povezani sa EV (kalretikulin). Autori su također uključili nekoliko ključnih kontrola, uključujući ne-EV frakcije i EV iz nebubrežnih izvora.

BUDUĆI PRAVCI

UEV se proučavaju 0,17 godina od karakteristične publikacije Pisitkun et al.5 2004. Zašto se interesovanje za uEV kao nove igrače u bolesti bubrega sve više povećava? Zapravo, 2004. je pokrenula eru sve veće rigoroznosti u studijama uEV, gdje je ovo polje progresivno prevazišlo ključne prepreke na putu ka kliničkoj primjeni. Ustanovljena je biologija i utovar tereta električnih vozila; razvijene su nove metode izolacije koje su dovele do čistijih EV izolata.1 Razvijeni su markeri kvaliteta, metode normalizacije uEV-a su istražene i validirane, i postavljeni su minimalni zahtjevi za izvještavanje (pregledano u ref. 1). U međuvremenu, istraživanje uEV-a se povećalo zbog obećanja koja imaju uEV. Ono što je najvažnije, uEV-ovi su obogaćene "korpe" informacija o molekularnim procesima i putevima koji se mogu pratiti do jednog tipa ćelije. Stoga su potencijalno osjetljiviji od izlučenih proteina ili RNK u urinu, a mogu biti i specifičniji. Zaista, učinjeno je nekoliko pokušaja da se prouče EV specifični za određene segmente tubula. Međutim, ovo ostaje izazov, jer mnogi proteinski markeri prepoznaju samo intracelularne epitope, što može zahtijevati permeabilizaciju uEV-a deterdžentima.12 Lista proteina koji se mogu koristiti u tu svrhu kako je navedeno u nedavno objavljenom dokumentu o položaju uEV-a.1 Iako je izolacija UEV je još uvijek vrlo dugotrajan i radno intenzivne, visoko propusne metode karakterizacije uEV-a se razvijaju i karakteriziraju12 s potencijalom da ubrzaju proces klinički primjenjivanja biomarkera bubrega, kao što su markeri odbacivanja transplantata koji bi mogli zaobići potrebu za biopsija bubrega.13 Mnoga od ovih napretka su povećala složenost informacija koje se mogu dobiti iz uEV-a. Stoga su se trenutni izazovi pomjerili sa pronalaženja metoda izolacije i karakterizacije dovoljno osjetljivih za proučavanje ovih novih glasnika na poboljšanje specifičnosti (daljom) optimizacijom metoda normalizacije, kontrole kvaliteta i temeljnog izvještavanja. Ovdje proširujemo preporuke iz dokumenta o poziciji uEV1 sa odabranom kolekcijom resursa za istraživanje uEV (tabela 1). U konačnici, rješavanje ovih izazova će dovesti do brzih i preciznih metoda s malim varijacijama potrebnim za kliničku primjenu. Ovi sljedeći koraci mogli bi omogućiti pristupima zasnovanim na uEV-u da zamijene biopsiju bubrega u narednoj deceniji.

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com