Ekspresija imunoglobulina G u ljudskim proksimalnim tubularnim epitelnim ćelijama

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

Abstract. Proksimalnocevastiepitelne ćelije (PTECs) imaju urođene imunološke karakteristike i proizvode proinflamatorne faktore, hemokine i komponente komplementa koje pokreću epitelno-mezenhimsku tranziciju (EMT). Naše prethodne studije su otkrile da su ljudske mezangijalne ćelije i podociti u stanju da sintetiziraju i luče imunoglobulin (Ig)A i IgG, respektivno. Cilj ove studije je bio da se proceni ekspresija Ig u PTEC. Prvo, IgG je otkriven u citoplazmi, ćelijskoj membrani i lumenuPTECsu normalnom korteksu bubregaimunohistohemija. Drugo, transkripcija Ig gena i V(D)J rekombinacija otkriveni su u pojedinačnim PTEC-ovima ugniježđenim PCR-om i Sangerovim sekvenciranjem. Treće, Ig, Igκ i Igλ su jasno otkriveni u besmrtnoj PTEC liniji (HK-2) imunobojanjem i western blotingom, u kojem je korišten RP215 (antitijelo koje se pretežno vezuje za IgG koji nije izveden iz B ćelija). Osim toga, transkripti gena Ig, Igκ i Igλ, konzervativna V(D)J rekombinacija u varijabilnoj regiji Ig, gen koji aktivira rekombinaciju 1/2 i aktivacijom indukovana citidin deaminaza su otkriveni u HK-2 ćelijama. Ovi podaci sugeriraju da PTEC mogu eksprimirati IgG na sličan način kao B ćelije. Nadalje, ekspresija IgG je pojačana TGF-1 i može biti uključena u EMT.

Ključne riječi:proksimalnicevastiepitelne ćelije, jednoćelijske, HK‑2, IgG, epitelno-mezenhimski prelaz

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Uvod

Proksimalnocevastiepitelne ćelije (PTECs) su najzastupljenija vrsta ćelija ububregi imaju važnu ulogu u obnavljanju bubrega i/ili napredovanju hroničnih bubrežnih bolesti. PTEC-i vrše imunološke funkcije ekspresijom više receptora sličnih Toll-u (TLR), kao što su TLR 1, 2, 3, 4 i 9 (1,2), i molekula povezanih sa ćelijskom funkcijom koja predstavlja antigen, uključujući MHCII, CD74, CD80 , i CD86 (3). Ove urođene imunološke karakteristike PTEC-a omogućavaju im da djeluju kao imuni odgovor na širok spektar stimulansa, s posljedičnom proizvodnjom i oslobađanjem bioaktivnih medijatora, uključujući proinflamatorne citokine, hemokine i komponente komplementa, koji pokreću intersticijsku upalu i fibrozu (4). PTEC-ovi takođe eksprimiraju neonatalne Fc receptore i čuvaju kapacitet specifičnog pH-zavisnog vezivanja i transcitoze imunoglobulina (Ig)G (5). Međutim, prema našim saznanjima, ostaje nepoznato da li PTEC-ovi izražavaju Ig.

Prethodno je pretpostavljeno da Ig proizvode isključivo zrele B stanice i plazma stanice i da Ig djeluju kao antitijela za prepoznavanje i neutralizaciju različitih patogena. Međutim, ova teorija je dovedena u pitanje posljednjih decenija, jer je sve više dokaza izvještavalo da Ig, uključujući IgA, IgG i IgM, mogu proizvoditi i lučiti ne-B ćelije, kao što su ćelije raka epitela kod ljudi (6,7) i normalne ne-B ćelije (8,9), kao i na imuno-privilegiranim mjestima, kao što su oči (10), centralni neuroni (11,12), posteljica (13) i testis i epididimis (14)

Slično Ig-ovima iz B-ćelija (B-Igs), ne-B-Igs su također produkti transkripcije i preuređivanja Ig gena i pokazuju klasične V(D)J rekombinacijske obrasce s dodacima nukleotida na spojevima i somatskim hipermutacijama (7, 11,14). Za razliku od B-Igs, ne-B-Igs pokazuju ograničene V(D)J rekombinacijske obrasce i manju raznolikost (7). Funkcionalno, non-B-Igs ne samo da ispoljavaju prirodna aktivnost antitijela u koži i sluznici (8), već mogu djelovati i kao faktori rasta koji promoviraju proliferaciju i adheziju stanica, te mogu poboljšati inicijaciju i metastazu raka vezivanjem za integrine ( 15‑17). Na primjer, RP215 prepoznati kancer IgG izvršava svoju onkogenu funkciju interakcijom sa integrin 6 4 kompleksom i aktiviranjem FAK i Src puteva (15).

Naša prethodna studija je pokazala da mezangijalne ćelije (18) i podociti(19) mogu sintetizirati i lučiti IgA i IgG, te sudjelovati u ćelijskom rastu i adheziji ćelija in vitro. Ova studija je imala za cilj da proceni nivoe ekspresije Ig u PTEC-ima i istraži njihovu potencijalnu ulogu u epitelno-mezenhimskoj tranziciji (EMT).

Efekti cistanchea: korist za bubrege

materijali i metode

Ćelijska kultura i tretman.Ovekovečena PTEC linija HK‑2 kupljena je od American Type Culture Collection. HK-2 ćelije su uzgajane u DMEM/F12 sa dodatkom 100 U/ml penicilina, 0,1 mg/ml streptomicina (svi Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) i 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS; Australijsko porijeklo; Biological Industries USA, Inc.) na 37˚C u atmosferi koja sadrži 95 posto zraka i 5 posto CO2. Kako bi se izbjegla interferencija Ig u FBS, medij je zamijenjen medijumom bez seruma 24-48 h prije sakupljanja ćelija. HK-2 ćelije su tretirane različitim koncentracijama (2, 5 i 10 ng/ml) TGF-1 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA).

Pojedinačna PTEC izolacija i cDNK sinteza.Uzorak ljudskog bubrega makroskopski normalnog kortikalnog tkiva uzet je od pacijenta (muškarac, 31 godina) koji je podvrgnut nefrektomiji zbog karcinoma bubrega bez očite bubrežne disfunkcije. Jednoćelijska suspenzija je pripremljena digestijom korteksa bubrega sa 1 mg/ml kolagenaze I (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) na 37˚C tokom 20 min. PTEC-ovi su sortirani pomoću fikoeritrin (PE)-konjugirani anti-CD10 (kat. br. 312203) i alofikocijanin (APC)-konjugirani anti-CD13 (kat. br. 301705; oba BioLegend, Inc.) sortiranjem fluorescencijom BD FACSAria II Special Order System) kao što je prethodno opisano (20). Odgovarajuća kontrolna antitela izotipa (kat. br. 400111 i 400119; oba BioLegend, Inc.) korišćena su da se isključi nespecifično bojenje. Dvostruko pozitivno obilježene žive ćelije izolovane su kao PTEC. Jedan PTEC je ručno odabran pod invertovanim svjetlosnim mikroskopom pomoću kapilarne pipete, a zatim je prebačen u PCR epruvetu sa tankim zidom od 0,2 ml koja sadrži pufer za lizu (21). Ekstrakcija pojedinačne PTEC RNK i sinteza cDNK izvedene su prema prethodno opisanim metodama(21). Ukupno pet pojedinačnih PTEC-a korišteno je za otkrivanje transkripcije i preuređivanja Ig gena.

PCR amplifikacija.Ukupna RNK je ekstrahirana iz HK-2 ćelija, mononuklearnih ćelija periferne krvi [PBMCs, izolovane od 31-godišnje zdrave donatorke koristeći Ficoll (kat. br. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] i korteksa bubrega (od istog pacijenta koji je korišten u jednoj PTEC izolaciji) korištenjem TRIzol® reagensa (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), a koncentracija RNK je procijenjena pomoću NanoDrop spektrofotometra (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Nakon toga, 2 µg ukupne RNK je reverzno transkribirano na cDNK korištenjem kompleta RevertAid First Strand cDNA Synthesis (kat. br. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR je izveden korišćenjem prajmera koji ciljaju na konstantne regione Ig, Igκ, Igλ i citidin deaminaze (AID) izazvane aktivacijom. Ugniježđeni PCR je izveden za amplifikaciju varijabilnog regiona Ig, proteina 2 povezanog s receptorom lipoproteina niske gustine (LRP2) i gena za aktiviranje rekombinacije (RAG)1 i RAG2. PCR proizvodi su razdvojeni elektroforezom na 1,0 postotnom agaroznom gelu i vizualizirani pomoću GelRed (kat. br. 41003; Biotium, Inc.). Prajmeri AID, RAG1/2 i konstantni regioni Ig, Igκ, Igλ korišćeni u ovoj studiji odnose se na prajmere koje su koristili Jing et al (19). Prajmeri varijabilnog regiona Ig odnose se na prajmere koje koriste van Dongen i saradnici (22). Ostali prajmeri koji se koriste za PCR navedeni su u tabeli SI. Uslovi termocikliranja su navedeni u tabeli SII.

Sanger sekvenciranje i analiza podataka sekvenciranja.PCR proizvodi varijabilnog regiona Ig dobijeni iz pojedinačnih PTEC, HK-2 ćelija i PBMC su klonirani u pGEM-T Easy Vector System I (kat. br. A1360; Promega Corporation), koji je transformisan u TOP10 kompetentnih ćelija (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Ukratko, 5 µl proizvoda za ligiranje je dodano u 30 µl TOP10 kompetentnih ćelija, inkubirano na ledu 30 minuta, toplotno šokirano na 42°C 90 sekundi i inkubirano na ledu 5 minuta. Zatim je dodano 500 µl LB i ostavljeno da stoji na 37°C 40 minuta prije inokulacije dijela bakterijske tekućine na Petrijeve posude obložene sa 0,1 mmol/l IPTG i 20 µg/ml X‑Gal. Posude su preokrenute na 37˚C preko noći. Sve u svemu, 5-16 bijelih kolonija po uzorku odabrano je nasumično i sekvencirano korištenjem ABI 3730XL genetskog analizatora (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Preuređene V(D)J sekvence su upoređene s onima u osnovnom alatu za pretraživanje lokalnog poravnanja (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) kako bi se identificirali najbolji odgovarajući genski segmenti i spojevi zametne linije nakon obrezivanja prajmera .

Western blot analiza.HK-2 ćelije su lizirane u TSD puferu za lizu [1 posto SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM DTT] koji sadrži koktel inhibitora proteaze (Applygen Technologies Inc.), sonicirano u ledenoj vodi 1 min ( radi se 5 sekundi i odmara 15 sekundi; 3 puta) i lizira se 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon centrifugiranja na 12,000 xg tokom 10 minuta na 4˚C, koncentracija proteina u ćelijskom lizatu je određena korištenjem BCA kita (Applygen Technologies Inc.). Nakon toga, lizatu je dodan pufer za punjenje 5X, koji je kuhan na 100˚C 10 minuta, a uzorci su odmah korišteni za Western blot analizu. Serum, korišćen kao pozitivna kontrola za Ig, izolovan je od zdravog donora (istog donora koji se koristi u PBMC) centrifugiranjem na 2,103 xg tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi.

Efekti cistanchea: korist za bubrege

Western blot je izveden prema standardnim procedurama. Ukratko, 3{{40}} µg proteina je razdvojeno pomoću SDS-PAGE na 10-postotnim gelovima i prebačeno je na nitroceluloznu membranu. Nakon toga, membrana je blokirana u 5% obranog mlijeka na sobnoj temperaturi 1 h i inkubirana je sa primarnim antitelima na 4˚C preko noći, uključujući zečji anti-humani Ig (kat. br. ab109489; 1:1,{{8} }), zečji anti-humani Ig 4 (kat. br. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (kat. br. ab124727; 1:10,000), anti- Igλ (kat. br. ab124719; 1:20,000), zečji anti-humani ‑aktin (kat. br. ab8227; 1:2,000) (svi od Abcam) i RP215 monoklonsko antitijelo (mAb) (donirao profesor Xiaoyan Qiu, Univerzitet u Pekingu, Peking, Kina; 1:1,000), koje je specifično identificiralo epitop povezan s ugljikohidratima na ne-B-Ig. Membrana je zatim inkubirana sa kozjim anti-zečjim (kat. br. 926‑32211) ili anti-mišjim (kat. br. 926‑32210) IgG‑IRDyeTM680CW sekundarnim antitelima (oba 1:10,{37) LI‑COR Biosciences) na sobnoj temperaturi 1 h. Signal je detektovan korišćenjem Odyssey Imaging sistema i softvera Odyssey V3.0 (oba LI‑COR Biosciences). ImageJ softver (verzija 1.8.0; Nacionalni instituti za zdravlje) korišten je za polukvantificiranje.

Pročišćavanje IgG i masena spektrometrija.Nakon što su HK‑2 ćelije kultivisane u DMEM/F12 bez FBS tokom 48 sati, supernatant kulture je sakupljen nakon centrifugiranja na 2,103 xg tokom 10 minuta na 4˚C. Supernatant ćelije je pročišćen afinitetnom hromatografijom korišćenjem proteina G sefaroze, prema uputstvima proizvođača (kat. br. 17‑0618‑02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eluent je ultrafiltriran da bi se pufer za eluiranje (0,1 M glicin; pH 2,4) zamijenio PBS-om. Pročišćeni proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE na 10-postotnim gelovima, detektovani western blotingom i dalje analizirani masenom spektrometrijom, koju je izvela Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Imunofluorescencija.HK-2 ćelije su kultivisane na pokrovnim stakalcima, koji su fiksirani u hladnom nerazređenom acetonu 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, stakalca su dva puta isprana u PBS i blokirana sa 5% FBS/PBS na sobnoj temperaturi 20 minuta, nakon čega su inkubirana sa primarnim antitelima na 4˚C preko noći. Antitela su bila ista kao ona korišćena u western blotingu: zečji anti-humani Ig (1:150), anti-humani Igκ (1:250), anti-humani Igλ (1:250) i RP215 mAb (1:200 ); PBS je korišten kao negativna kontrola. Nakon ispiranja u PBS, stakalca su inkubirana sa kozjim anti-zečjim (kat. br. A11008) ili kozjim anti-mišjim (kat. br. A11001) IgG antitelima (1:1,000) označenim fluorescein izotiocijanatom; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) na sobnoj temperaturi 1 h. Jezgra su obojena DAPI. Slike su snimljene pod Leica DFC300 FX fluorescentnim mikroskopom (Leica Microsystems GmbH).

Imunohistohemijsko bojenje.Parakancerozni bubrežni korteks prikupljen je od četiri muška pacijenta (38-49 godina) sa karcinomom bubrega. Normalni parakancerozni bubrežni korteksi nakon nefrektomije su fiksirani sa 10 posto formalina tokom 48 h na sobnoj temperaturi, a zatim stavljeni u parafin. Uzorci ljudskog bubrega ugrađeni u parafin izrezani su na dijelove od 3 µm i deparafinizirani i rehidrirani kroz niz stupnjevanih koncentracija etanola. Uzimanje antigena je izvršeno kuhanjem u 0.05 M Tris-EDTA (pH 9,0) u ekspres loncu 3 min. Sekcije su zatim inkubirane sa 3 procentnim rastvorom H2O2 10 minuta na sobnoj temperaturi da bi se eliminisala endogena peroksidaza i inkubirane sa normalnim kozjim serumom (kat. br. ZLI‑9022, ZSGB‑BIO, Kina) 30 minuta na sobnoj temperaturi da bi se blokirale nespecifične mesta vezivanja antitela na sobnoj temperaturi. Potom je izvršeno indirektno imunohistohemijsko bojenje primarnim antitelima na 4˚C preko noći, uključujući RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), zečji anti-humani Ig (1:2,000), anti-humani Igκ (1:1,000), anti-humani Igλ (1:1,000) (ista antitela koja se koriste u western blot-u). Sekcije bez primarnih antitijela korištene su kao negativne kontrole. Stakalca su zatim inkubirana sa nerazblaženim sekundarnim antitelima obeleženim peroksidazom rena (kat. br. PV‑6001 i PV‑6002; oba OriGene Technologies, Inc.) na sobnoj temperaturi 30 minuta. Vezana antitijela su otkrivena korištenjem diaminobenzidina. Konačno, stakalca su obojena hematoksilinom. Slike su snimljene svetlosnim mikroskopom (x200 uvećanje). Statistička analiza. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija i analizirani su korištenjem SPSS 20.0 za Windows (IBM Corp.). Svi eksperimenti su ponovljeni 3 puta. Razlike između više grupa analizirane su korištenjem jednosmjerne ANOVA i Tukeyjevog posthoc testa. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Efekti cistanchea: korist za bubrege

Rezultati

Ekspresija IgG u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama korteksa bubrega.Normalni bubrežni korteksi, koji su sakupljeni od donatora koji su bili podvrgnuti nefrektomiji kao rezultat karcinoma bubrežnih ćelija, korišteni su za određivanje ekspresije IgG u epitelnim stanicama bubrežnih tubula imunohistokemijom korištenjem antitijela protiv humanog Ig , Igκ, Igλ i RP215 koje je predomantno antitijelo vezuje se za ne-B-IgG). Pozitivno bojenje IgG teških i lakih lanaca nije otkriveno samo u PTEC-ima već iu epitelnim ćelijama distalnih uvijenih tubula, bilo u citoplazmi, ćelijskoj membrani ili tubularnom lumenu (slika 1).

Transkripcija i V(D)J rekombinacija IgG u pojedinačnim PTEC. Da bi se izbjegla interferencija rezidualne krvi, vezivanja i transcitoze IgG od strane PTEC-a u korteksu bubrega, i da bi se dobio direktan dokaz ekspresije IgG u PTEC-ima, pojedinačni PTEC-ovi su razvrstani iz korteksa ljudskog bubrega korištenjem CD10 i CD13 ko-obilježavanja protokom citometrija (20). Kao što je prikazano na slici 2A, CD10/CD13 dvostruko pozitivni PTEC činili su 4,1 posto živih ćelija u uzorku. Izolovani PTEC su dalje potvrđeni korišćenjem specifičnog markerskog gena LRP2, a kontaminacija B-ćelija je eliminisana CD19. Transkripti varijabilnog regiona Ig su amplificirani u pet pojedinačnih PTEC-a pomoću ugniježđenog PCR-a (slike 2B i C). Rezultati Sengerovog sekvenciranja otkrili su da PTEC pokazuju funkcionalnu i konzervativnu VDJ rekombinaciju teškog lanca IgG (Tabela I), što ukazuje da se ekspresija IgG može pojaviti u PTEC-ima.

Ekspresija teškog i lakog lanca IgG u HK-2 ćelijama. Budući da je bilo teško otkriti ekspresiju IgG proteina u jednom PTEC-u i dobiti dovoljno PTEC-a za western blotting, HK-2 ćelijska linija, koja se sastoji od besmrtnih PTEC-a, odabrana je da dodatno potvrdi ekspresiju IgG proteina. Imunofluorescentna analiza je pokazala pozitivno bojenje Ig, Igκ i Igλ u citoplazmi, i jače pozitivno bojenje RP215 pretežno u citoplazmi i ćelijskoj membrani (slika 3A).

Nakon toga, ekspresija teških i lakih lanaca IgG u HK-2 ćelijama otkrivena je western blotingom u redukcijskim uslovima. Da bi se eliminisala FBS interferencija u medijumu kulture, medijum koji je sadržao FBS je blotiran odgovarajućim antitelima i obojen negativno. Komercijalno IgG antitijelo moglo je otkriti IgG iz seruma, ali ne i IgG iz HK-2. Nasuprot tome, RP215 može otkriti IgG izveden iz HK-2, ali ne i serumski IgG. I komercijalna IgG antitijela i RP215 su bili u stanju da otkriju Ig na 55 kDa. Ig 4 (36 kDa) traka je otkrivena u HK-2 ćelijama, u skladu sa predviđenom molekulskom težinom. Nadalje, ekspresije Igκ (25 kDa) i Igλ (50 kDa, dimer) uočene su u ćelijskim lizatima (slika 3B). Nakon toga, IgG u ćelijskom supernatantu je pročišćen proteinom G, potvrđen Western blottingom i sekvencioniran masovnom spektrometrijom, koja je pokazala da traka od 55-kDa sadrži fragmente Igκ lanca i Ig teškog lanca varijabilnog regiona, prema Nacionalnom centru za Baza podataka o biotehnološkim informacijama (NCBI) (slika 3C‑E). Ovi podaci sugeriraju da HK-2 stanice proizvode i luče IgG protein.

Transkripcija i V(D)J rekombinacija IgG teških i lakih lanaca u HK-2 ćelijama. Transkripcija Ig gena i funkcionalna V(D)J rekombinacija je preduslov za ekspresiju Ig. Da bi se potvrdila ekspresija IgG u HK-2 ćelijama, Ig, Igκ i Igλ transkripti su procenjeni amplifikacijom konstantnih i varijabilnih regiona u HK-2 ćelijama (sl. 4A i B). Sekvenciranje konstantnih PCR proizvoda pokazalo je visoku homologiju sa objavljenom sekvencom u bazi podataka NCBI. T-A kloniranje i Sangerovo sekvenciranje su pokazali da Ig u HK-2 ćelijama pokazuje konzervativnu V(D)J rekombinaciju sa VH4-4/D2-8/JH5. Nasuprot tome, različitost V(D)J rekombinacije je uočena u PBMC, što je eliminisalo pristranost prajmera (Tabela II). Slično B ćelijama, HK-2-izveden IgG pokazao je tipičnu produktivnu V(D)J rekombinaciju sa V-D i D-J spojevima (slika 4C). Štaviše, somatske hipermutacije su otkrivene u HK-2-izvedenom Ig (raspon, 6,8-8,4 posto) sa 7 od 15 motiva žarišnih tačaka (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) sa mutacijama.

Osim toga, AID transkripti (bitni element za somatsku hipermutaciju i rekombinaciju klasnih promjena u B ćelijama) i RAG1 i RAG2 [neophodni za V(D)J rekombinaciju] otkriveni su u HK-2 ćelijama (slika 4B), što ukazuje da mehanizam koji leži u osnovi sinteze Ig u HK‑2 ćelijama može biti sličan onom u B ćelijama.

TGF-1 povećava ekspresiju IgG u HK-2 ćelijama. HK-2 ćelije su stimulisane različitim koncentracijama TGF-1 tokom 48 sati. Imunofluorescentno bojenje je pokazalo da citoplazmatski IgG pokazuje pojačano pozitivno bojenje u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 5A). Western blotting je potvrdio da je IgG značajno povećan TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Efekti cistanchea: korist za bubrege

Diskusija

Ova studija je pokazala da PTEC eksprimiraju IgG sa transkripcijom gena i funkcionalnom konzervativnom V(D)J rekombinacijom, što je bilo slično ne-B-IgG. TGF-1 je pojačao ekspresiju IgG u HK2 ćelijama.

Da bi se istražilo da li PTEC eksprimiraju IgG, IgG je prvo detektovan u citoplazmi, ćelijskoj membrani i lumenu PTEC-a u normalnom ljudskom bubrežnom korteksu imunohistohemijom; rezultati su pokazali da PTEC proizvode i luče IgG. Ovo je u suprotnosti s našim rutinskim patološkim pregledom, gdje nije otkriven očigledan IgG u PTEC-ima. To bi moglo biti zbog vrlo slabog PTEC bojenja, koje je bilo prenisko da bi se otkrilo, posebno kod imunološki povezanih glomerularnih bolesti u kojima su Ig jako pozitivni u glomerulima i PTEC bojenje može biti nenamjerno, ali umjetno izgubljeno. IgG transcitoza iz cirkulacije putem PTEC-a preko Fc receptora je djelimično isključena, jer je uočeno jasno bojenje IgG pomoću RP215 u ćelijskoj membrani i citoplazmi. Ovi nalazi sugeriraju da je IgG izveden iz PTEC sličan drugim ne-B-IgG i da može imati jedinstvene glikozilovane epitope, koje može specifično prepoznati RP215 umjesto komercijalnog anti-IgG antitijela (15). Otkriće da samo dio tubularnih epitelnih ćelija eksprimira IgG može se objasniti dinamičkom ekspresijom u različitim ćelijskim ciklusima, što je bilo slično obrascu ekspresije IgA iz mezangijalnih ćelija (18). Zajedničko bojenje IgG tubularnim markerima (kao što su akvaporin 1 i akvaporin 3) bilo bi korisno za dalje studije kako bi se poboljšali nalazi ove studije.

Jednoćelijsko RNA sekvenciranje može jasno prikazati transkripciju specifičnog gena u datoj ćeliji. Transkripti Ig lanca i V(D)J rekombinacije su detektovani u pojedinačnim PTEC. Iako je korišteno samo pet pojedinačnih PTEC-a, proces je bio rigorozan jer je korteks bubrega sakupljen daleko od tumora, a svaka pojedinačna stanica je sortirana protočnom citometrijom s dva PTEC-specifična markerska gena, ponovno potvrđena korištenjem trećeg specifičnog markerskog gena (LRP2) i eliminisana je kontaminacija B-ćelija. Rezultati su otkrili da PTEC ne predstavljaju samo transkripte IgG gena, već i klasičnu V(D)J rekombinaciju u varijabilnoj regiji kao B ćelije, kao što je produktivna V(D)J rekombinacija sa V-D i D-J spojevi (slika 4), što ukazuje da PTEC-i imaju potencijal da proizvode IgG. Osim toga, konzervativnija V(D)J rekombinacija je ilustrovala da su PTEC prisutni sa transkriptima IgG gena i V(D)J rekombinacijom koji su slični drugim ne-B ćelijama.

HK‑2, ovekovečena PTEC linija, lako se uzgaja u velikim količinama. Ova studija je potvrdila ekspresiju IgG proteina u kultivisanim HK-2 ćelijama; IgG je otkriven u HK-2 ćelijama i imunofluorescencijom i Western blottingom. Ig 4, podklasa Ig, takođe je detektovan u veličini trake koja je u skladu sa predviđenom molekulskom težinom. Masena spektrometrija je otkrila da protein pročišćen iz ćelijskog supernatanta korištenjem proteina G sadrži fragmente varijabilnog regiona teškog lanca Ig i lanca Igκ, pružajući dokaze za izlučivanje IgG od strane PTEC. Transkripcija IgG u HK-2 ćelijama dodatno je podržala ekspresiju IgG u PTEC-ima, a konzervativna V(D)J rekombinacija sa IGHV4-4/IGHD2-8/IGHJ5 u HK-2 ćelijama dodatno je podržala prisustvo IgG u HK-2 ćelijama sličnim na druge ne-B ćelije.

Ova studija je takođe istraživala osnovni mehanizam proizvodnje IgG u PTEC-ima ispitivanjem transkripcije RAG1, RAG2 i AID u HK-2 ćelijama. Otkriveno je da su RAG1, RAG2 i AID transkribovani u HK-2 ćelijama. Osim toga, RAG1, RAG2 ili AID transkripti su prethodno otkriveni u brojnim drugim ne-B ćelijama, kao što su podociti (19) i nekoliko ćelijskih linija raka (23). Ovi rezultati sugeriraju da ne-B ćelije, uključujući PTEC, mogu imati slične mehanizme sinteze Ig kao i B ćelije. Međutim, da li su AID i/ili RAG1/2 neophodni geni za IgG izveden iz PTEC-a, zahtijeva dalje istraživanje. Osim toga, folikularne pomoćne CD4 T ćelije su važne za regulaciju diferencijacije B-ćelija germinalnog centra u plazma ćelije i podržavaju proizvodnju Ig (24). Naši neobjavljeni podaci su otkrili da su ne-B-Ig još uvijek otkriveni kod NOD-SCID miševa s nedostatkom T i B ćelija, što ukazuje da ne-B-Igs nisu u potpunosti ovisni o T pomoćnim ćelijama. Da li su T pomoćne ćelije potrebne da bi PTEC eksprimirali IgG, potrebno je dalje istraživanje.

TGF‑ 1 ima ključnu imunomodulatornu ulogu u proizvodnji Ig. Na primjer, TGF-1 je inducirao promjenu klase IgA i izlučivanje u stimuliranim B stanicama u slezeni miša (25) i B stanicama ljudskih krajnika (26). McIntyre i saradnici (27) su pokazali da TGF-1 selektivno stimulira lučenje IgG2b od strane B ćelija aktiviranih lipopolisaharidom najvjerovatnije indukujući promjenu klase IgM na IgG2b. Duan i saradnici (28) su pokazali da TGF-1 povećava ekspresiju IgA regulacijom transkripcionog faktora Ets-1 u ćelijama raka epitela. Ova studija je pokazala da TGF-1 povećava ekspresiju IgG u HK-2 ćelijama. S obzirom da je samo IgG detektovan u HK-2 ćelijama, pretpostavljeno je da TGF-1 indukuje ekspresiju IgG nezavisno od promene klase Ig. Regulatorni mehanizam proizvodnje IgG TGF-1 zahtijeva dalje istraživanje.

PTEC imaju važnu ulogu u tubularnoj intersticijskoj fibrozi kroz EMT, a TGF-1 djeluje kao glavni profibrotski medijator. U ovoj studiji, dodavanje TGF-1 kultivisanim ćelijama HK-2 povećalo je ekspresiju IgG, što ukazuje da IgG dobijen od HK-2 može biti pozitivno povezan sa EMT. Prethodne studije su izvijestile da je kancer-IgG bio povezan s metastazama i promovirao EMT smanjenjem E-kadherina kod adenoidnog cističnog karcinoma pljuvačke (29) i raka pluća (30). Vrijedi istražiti može li IgG izveden iz PTEC-a imati ulogu u bubrežnom tubularnom EMT-u i intersticijskoj fibrozi u bolesnim stanjima, kao što su ishemija/reperfuzijska ozljeda ilihronična bolest bubrega.

U zaključku, koliko nam je poznato, ova studija je bila prva koja je pokazala da PTEC mogu eksprimirati i lučiti IgG, a TGF-1 može povećati ekspresiju IgG u HK-2 stanicama. Međutim, potencijalna uloga IgG iz PTEC-a u tubulointersticijskoj fibrozi zahtijeva dalje istraživanje.

Efekti cistanchea: korist za bubrege

Finansiranje

Ova studija je podržana grantovima Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (br. grantova 82070736, 91642109 i 81870488), Fondacije za prirodne nauke Hainan (grant br. 819QN355), Medicinskog univerziteta Hainan, Fondacije za naučno-istraživačko istraživanje (Fond za kultivaciju granta br. HYPY201926), i ključni projekti podrške Programa velikih istraživanja Nacionalne fondacije za prirodne nauke (grant br. 91642206).

Dostupnost podataka i materijala

Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tokom tekuće studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

Doprinosi autora

Kao odgovarajući autori, YW i XQ su osmislili i dizajnirali studiju. ZD je učestvovao u dizajnu istraživanja, izvodio histološke i jednoćelijske eksperimente, pripremao uzorke za masenu spektrometriju, analizirao podatke i napisao rukopis. ZJ je sudjelovao u dizajnu istraživanja, većini eksperimenata u vezi sa ekspresijom IgG u HK‑2 ćelijama i analizi relevantnih podataka. YG, JM, HD i YL izveli su parcijalne eksperimente na ćelijskoj liniji. ZC i YP su odabrali odgovarajuće slučajeve za jednoćelijske eksperimente prema kliničkim karakteristikama. HY i ZS su učestvovali u eksperimentima sa jednom ćelijom. SW je učestvovao u imunohistohemijskom bojenju, analizirao podatke o bojenju tkiva i izradio i revidirao rukopis. YW, ZD i ZJ potvrdili su autentičnost svih sirovih podataka. Svi autori su pregledali rukopis i revidirali podatke. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Etičko odobrenje i saglasnost za učešće

Ova studija je u skladu sa principima Helsinške deklaracije, a odobrena je od strane Komiteta za medicinsku etiku Treće bolnice Univerziteta u Pekingu (br. odobrenja S2020121) i sprovedena u skladu sa protokolom. Svi donatori su dobrovoljno donirali korteks bubrega i dali pismeni informirani pristanak prije doniranja korteksa bubrega studiji. Sve metode su provedene u skladu sa relevantnim smjernicama i propisima. Ovi uzorci su bili strogo anonimni. Ljudski serum i PBMC, korišteni kao pozitivna kontrola u western blottingu ili reverznoj transkripciji-PCR u ovoj studiji, dobijeni su iz krvi zdravog dobrovoljca, koji je dao pismeni informirani pristanak za uzorkovanje.

Efekti cistanchea: korist za bubrege

Reference

1. Schlondorff DO: Pregled faktora koji doprinose patofiziologiji progresivne bubrežne bolesti. Kidney Int 74: 860‑866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Toll-like receptori, imunoproteasomi i regulatorne T ćelije u djece sa Henoch-Schonlein purpurom i primarnom IgA nefropatijom. Pediatr Nephrol 29: 1545‑1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G i Neumann K: Proksimalne tubularne epitelne ćelije bubrega vrše imunomodulatornu funkciju potičući inflamatorne CD4 plus T ćelijske odgovore. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77‑F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL i Lan HY: Povreda bubrežnih tubula: pokretačka snaga ka hroničnoj bolesti bubrega. Kidney Int 93: 568‑579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C i Tomino Y: FcRn-posredovana transcitoza imunoglobulina G u ljudskim bubrežnim proksimalnim tubularnim epitelnim ćelijama. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358‑F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Ljudski epitelni karcinomi luče imunoglobulin g sa neidentifikovanom specifičnošću za promicanje rasta i preživljavanja tumorskih ćelija. Cancer Res 63: 6488‑6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Transkripti gena imunoglobulina imaju različite karakteristike rekombinacije VHDJH u ćelijama raka epitela ljudi. J Biol Chem 284: 13610‑13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG i IgA sa potencijalnom aktivnošću vezanja za mikrobe eksprimiraju normalne epidermalne ćelije ljudske kože. Int J Mol Sci 16: 2574‑2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X i Wang B: Imunoglobulin M, novi molekul ćelija miokarda miševa. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W i Gu J: Ekspresija i distribucija imunoglobulina G i njegovih receptora u imuno-privilegiranom mjestu: oko. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J i Qiu XY: Ekspresija imunoglobulinskog gena sa klasičnim V‑(D)‑J preuređivanjem u neuronima mozga miša. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C i Gu J: Ekspresija i distribucija imunoglobulina G i njegovih receptora u ljudskom nervnom sistemu. Int J Biochem Cell Biol 43: 556‑563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W i Gu J: Dva ultrastrukturna obrasca distribucije imunoglobulina G u ljudskoj posteljici i funkcionalne implikacije. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P i Qiu X: Ekspresija imunoglobulinskog gena sa klasičnim V‑(D)‑J preuređivanjem u testisima i epididimisu miša. J Histochem Cytochem 57: 339‑349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Ćelije skvamoznog karcinoma pluća eksprimiraju nekanonski glikozilirani IgG koji aktivira integrin-FAK signalizaciju. Cancer Lett 430: 148‑159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q i Zhao Y: Visoka ekspresija glikoziliranog imunoglobulina G koji potiče od raka predviđa lošu prognozu kod duktalnog adenokarcinoma pankreasa. J Cancer 11: 2213‑2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q i Zhao YP: Imunoglobulin G koji potiče od raka: Novi marker za diferencijalnu dijagnozu i predviđanje relapsa kod karcinoma paratiroidne žlezde. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461‑467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X i Wang Y: Ekspresija imunoglobulina A u ljudskim mezangijalnim ćelijama i njegovi efekti na ćelijsku apoptozu i adheziju. Mol Med Rep 17: 5272‑5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X i Wang Y: Ekspresija imunoglobulina G u ljudskim podocitima i njegova uloga u vitalnosti ćelije i adheziji. Int J Mol Med 41: 3296‑3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Izolacija i karakterizacija modela primarnih proksimalnih tubularnih epitelnih stanica iz ljudskog bubrega pomoću CD10/CD13 dvostrukog obilježavanja. PLoS One 8: e66750, 2013.