Eksperimentalno proučavanje anti-sportskih mehanizama zamora Cistanche Deserticola

Kontakt : emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1.Odjel za citobiologiju, Medicinski koledž Unutrašnje Mongolije, Hohhot 010059, Kina;2.Odjel za onkologiju, Bolnica Autonomne regije Unutrašnje Mongolije, Huhhot 010017)

sažetak:Cilj Proučiti učinakcistanche deserticolao izoenzimu laktat dehidrogenaze (LDH), glikogenu i sintazi dušikovog oksida 3 (NOS3) jetre u miševima opterećuju plivanje i istražuju relevantne molekularne mehanizme anti-sportskog umora. Metode Miševi su podijeljeni u normalnu kontrolnu grupu, sportsku kontrolnu grupu i kontrolnu grupucistanche deserticolaeksperimentalna grupa. Svaki miševi iz oralne kontrolne grupe i sportske kontrolne grupe dobili su fiziološku otopinu 0.2 mL dnevno. Svakom mišu eksperimentalne grupe cistanche deserticola davan je vodeni izvarakcistanche deserticola0.2 mL (3 g/kg) dnevno. Administracije su bile 15 dana. Opterećenje plivanja u trajanju od 90 minuta provedeno je na miševima sportske kontrolne grupe i eksperimentalne grupe cistanche deserticola 1 sat nakon posljednje primjene. Jetra miševa je uklonjena nakon 10 sati plivanja. Jedan dio jetre fiksiran je u neutralnoj formalinskoj tekućini za pripremu parafinskih rezova, a ostali su korišteni za mjerenje aktivnosti LDH. Struktura jetre je posmatrana bojenjem HE, a glikogen jetre mjeren je bojenjem glikogena. NOS3 je ispitivan SP imunohistohemijskom metodom. Rezultati Struktura jetre sportske kontrolne grupe je bila ozbiljno oštećena, izoenzim LDH4 i LDH5 je bio viši, glikogen u jetri je bio loš, NOS3 je smanjen u odnosu na normalnu kontrolnu grupu (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolamože smanjiti LDH5, zaštititi jetru miševa koji opterećuju plivanje i ubrzati akumulaciju glikogena povećanjem ekspresije NOS3 radi zaštite jetre i poboljšanja oporavka fizičkog kapaciteta.

Ključne riječi:cistanche deserticola;glikogen jetre;sintaza azot oksida 3;miševi.

Cistanche picture

Cistanche,također poznat kao Dayun, je dvogodišnja parazitska biljka Ledanaceae. Ima suve mesnate stabljike sa ljuskama. Uglavnom se proizvodi na pjeskovitim zemljištima i polupješčanim travnjacima u Unutrašnjoj Mongoliji, Gansu, Xinjiang, Qinghai i drugim mjestima. Unutrašnja MongolijaCistancheima najbolji kvalitet među svim proizvodnim područjima.Cistancheje slatke, slane i tople prirode. Ulazi ububrezii meridijan debelog creva. Njegove glavne funkcije su da njeguje bubrege i jača yang, hrani esenciju i krv, te vlaži crijeva. Često se koristi za liječenje impotencije, neplodnosti, slabog struka i koljena, slabosti mišića i kostiju, suvih crijeva i zatvora. Ova studija ima za cilj posmatranje efekataCistanchena jetrenoj laktat dehidrogenazi (LDH), glikogenu i sintazi dušikovog oksida 3 (NOS3) kod miševa koji plivaju s opterećenjem, kroz test plivanja na miševima, te istražiti njegov zaštitni mehanizam na jetri. Stoga može pružiti teorijsku osnovu za dubinsko istraživanje, razvoj i korištenjeCistanche u sportskoj zdravoj hrani.

1 Eksperimentalni materijali

1.1 Životinje

30 mužjaka Kunming štakora, čista, tjelesna težina (20±0,5) g, obezbijedio Centar za životinje Univerziteta Unutrašnje Mongolije.

1.2 Lijekovi

Cistanche deserticolaYCMa, proizveden u Ejina Banner, Unutrašnja Mongolija i identifikovan je. Prema izvornom ljekovitom materijalu: voda=100 g: 400 mL, prvo potopiti 30 min, zagrijati i prokuvati, a zatim kuhati na toploj vatri 30 min. Izlijte tečni lijek i ponovo raskuhajte u omjeru 100 g: 200 mL. Dva odvarka su pomešana i filtrirana sa dva sloja gaze, a zatim koncentrisana do ekvivalenta od 1 g originalnog lekovitog materijala po mililitru vodene dekokcione matične rastvore, čuvane u frižideru na 4 stepena.

1.3 Reagensi i instrumenti

NOS3 poliklonsko antitijelo je kupljeno od Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. SP komplet je kupljen od Fujian Maixin Reagent Company. Komplet za izoenzim laktat dehidrogenaze kupljen je od kompanije Inner Mongolia Tongri Reagent Company (isključivo vlasništvo Nissana). Nanjing JD-80 analizator slika u boji. Američki UVP sistem za analizu gel slike.

2 Eksperimentalna metoda

2.1 Grupiranje i doziranje

Kunming miševi su nasumično podijeljeni u normalnu kontrolnu grupu, kontrolnu grupu za vježbanje iCistancheeksperimentalna grupa, sa 10 mišem u svakoj grupi. Normalnoj kontrolnoj grupi i kontrolnoj grupi sa vežbanjem davan je normalan fiziološki rastvor jednom dnevno, 0,2 mL/vreme; theCistanchedata eksperimentalna grupacistanchedekocija (uzmite 3 mL prvobitne vodene dekokcije i dodajte vode u 10 mL). Jednom dnevno, 0,2 mL/put, dnevna doza je 3 g/kg, i to 15 dana za redom. Jedan sat nakon posljednje doze, miševi u kontrolnoj grupi vježbanja iCistancheeksperimentalna grupa je bila napunjena olovnim utegom od 1 g na repu i stavljeni su u bazen visine 50 cm, dužine 50 cm i širine 35 cm da plivaju na temperaturi (30±0,5) stepeni , Stalno promatrajte miševe, ako se utvrdi da prestaju plivati, koristite drveni štap da stimulirate njihovo kretanje 90 minuta. Nakon vježbanja, jedite normalnu prehranu, odmorite se 10 sati, a zatim eutanazirajte miševe s normalnim miševima kontrolne grupe. Izvadite jetru, popravite dio sa 10 posto neutralnog formaldehida i napravite debljinu od 4 µm nakon dehidracije, prozirnosti, potapanja voskom i ugradnje. Koristite HE metodu bojenja da biste promatrali strukturu tkiva jetre svake grupe. Drugi dio je ispran normalnim fiziološkim rastvorom i pohranjen zamrznut na -20 stepeni, a tokom mjerenja odmrznut na sobnoj temperaturi. Osušite filter papirom i izvažite, zatim pripremite homogenat jetre sa normalnim fiziološkim rastvorom, centrifugirajte na 3 500 r/min 15 min. Uzmite supernatant i elektroforezom izmjerite aktivnost izoenzima laktat dehidrogenaze.

2.2 Određivanje aktivnosti laktat dehidrogenaze

Koristeći elektroforezu u poliakrilamidnom gelu, izoenzimi LDH se odvajaju prema njihovim razlikama u elektroforetskoj pokretljivosti. Koncentracija separacionog gela u uzorku je 7 posto, pH 8,9, a koncentracija koncentriranog gela je 4 posto, pH 6,8. 10 µL uzorka se pomeša sa 1 kapi glicerola i indikatora bromofenol plavog. Pufer za elektrode je tris-glicin (pH 8,7), počnite stabilizirati napon na 100-150 V, dodati na 200-250 V nakon 30 min, i elektroforezu 4 h. Nakon elektroforeze, obojen je kompletom za izoenzim laktat dehidrogenaze i obojen na 37 stepeni 30 minuta, pokazujući plavu traku izoenzima laktat dehidrogenaze, zatim ispran vodom, fiksiran glacijalnom sirćetnom kiselinom. Konačno, koristite UVP sistem za analizu gel slike za analizu podataka.

2.3 Bojenje glikogenom

Serijski dijelovi debljine 4 µm se rutinski deparafiniziraju u vodu. staviti u 1% rastvor periodne kiseline na 37 stepeni 15 minuta. isprati tekućom vodom. staviti u Schiffov rastvor na 60 min. isprano tekućom vodom, dehidrirano gradijentnim etanolom, prozirnim ksilelom i montirano neutralnom gumom. Zatim promatrajte rezultate bojenja pod mikroskopom.

2.4 Imunohistohemijsko bojenje

Kriške se rutinski deparafiniziraju u vodu, a antigen se popravlja citratnim puferom u mikrovalnoj pećnici. Djelujte s otopinom A 10 minuta kako biste uklonili endogenu peroksidazu i blokirajte otopinom B (razrijeđeni kozji serum) 10 minuta. Dodajte primarno antitelo u vlažnu kutiju na 4 stepena preko noći i isperite rastvorom PBS pH 7,4 5 min×3 puta drugog dana. Zatim dodajte biotinom obeležen C rastvor (sekundarni radni rastvor antitela) i inkubirajte 10 min, isperite rastvorom PBS 5 min×3 puta. Dodati otopinu D označenu peroksidazom hrena i inkubirati 10 min, ispirati otopinom PBS-a 5 min×3 puta. Konačno, razvijen je u DAB rastvoru u trajanju od 5 minuta, ispran vodom iz slavine, obojen HE, dehidriran gradijentom etanola, proziran ksilenom i montiran neutralnom gumom. Posmatrajte pod svjetlosnim mikroskopom nakon postavljanja filma. U svakoj seriji eksperimenata, fiziološka otopina puferirana fosfatom (PBS) korištena je kao negativna kontrola umjesto primarnog antitijela.

2.5 Analiza ekspresije sintaze azot oksida 3

Preliminarnim posmatranjem vizuelnom polukvantitativnom metodom pod svetlosnim mikroskopom, NOS3 pozitivan proizvod je tamno smeđi ili smeđi. Pozitivan proizvod se nalazi u citoplazmi hepatocita ili endotelnih ćelija između hepatocita, a plava pozadina je negativna. Zatim koristite sistem za analizu slike u boji da izmjerite sivu vrijednost pozitivnog reaktanta. Pod objektivom od 40x, parametri 4 vidna polja se nasumično mjere za svaki film i uzima se prosječna vrijednost. Ovaj parametar se koristi da odražava promjenu intenziteta bojenja NOS3.

2.6 Statističke metode

Svi podaci su izraženi kao x-±s, a SPSS11.0 statistički softverski paket se koristi za t-test, a P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3 rezultata

3.1 Posmatranje strukture tkiva pod optičkim mikroskopom

Struktura lobula jetre u normalnoj grupi je jasna, ćelijske vrpce su uredno raspoređene, sinusoidi jetre su normalni, ćelije jetre nemaju očigledne lezije, a nuklearna struktura je jasna. Nestala je normalna struktura tkiva kontrolne grupe za vježbanje, granice lobula su bile nejasne, a ćelijska vrpca je poremećena, većina jetrenih sinusoida je nestala, a ekstenzivna vakuolna degeneracija hepatocita se manifestuje povećanim volumenom ćelije. Citoplazma je labava, lagano obojena, čak bistra i prozirna, a neke ćelije jetre pokazuju tipičnu balon promenu, sa malom količinom fokalne ili punktatne nekroze. Ćelije jetreCistancheeksperimentalne grupe su bile blago zamućene, ali su redovno raspoređene. U ćelijama nije bilo očiglednih vakuola i labavosti, ćelijske vrpce su bile uredno raspoređene, a struktura jezgra jasna.

3.2 Učinci na aktivnost izoenzima laktat dehidrogenaze jetre kod miševa pod opterećenjem (vidjeti Tabelu 1)

3.3 Posmatranje bojenja glikogena u jetri pod optičkim mikroskopom

Iako sadržaj glikogena u normalnoj kontrolnoj grupi nije visok, glikogena ima u svakoj ćeliji jetre, raspodjela je ujednačena i nema fenomena vakuole. Kontrolna grupa je imala manje glikogena, raspršenog u ćelijama jetre, a u nekim područjima su se pojavile vakuole; eksperimentalna grupa Cistanche bila je bogata glikogenom, ali je skupila mnogo na jednoj strani ćelije.

3.4 Promatranje ekspresije sintaze dušikovog oksida 3 optičkim mikroskopom i kvantitativna analiza slike

Postoji jaka pozitivna ekspresija u citoplazmi hepatocita u normalnoj kontrolnoj grupi, koja je difuzno raspoređena, posebno u binuklearnim ćelijama, i pozitivna ekspresija u endotelnim ćelijama. Ekspresija u citoplazmi hepatocita i endotelnih ćelija u kontrolnoj grupi je bila oslabljena.Cistancheeksperimentalna grupa je imala pozitivnu ekspresiju u citoplazmi hepatocita, a jaku pozitivnu ekspresiju u endotelnim ćelijama. Rezultati analize analizatora slike u boji prikazani su u tabeli 2.

4 Diskusija

Kretanju ljudskog tijela potrebna je energija, a i tijelu je potrebna energija u procesu metabolizma. Ćelijski metabolizam direktno koristi energiju iz razgradnje adenozin trifospata (ATP), a energija potrebna za sintezu ATP-a se u konačnici uglavnom osigurava katabolizmom šećera. . Istraživanja su pokazala da nakon napornog vježbanja tijelo proizvodi veliku količinu H plus, slobodnih radikala, mliječne kiseline i drugih tvari koje utiču na normalan metabolizam stanica. U isto vrijeme, nedostatak glukoze u stanicama dovodi do umora od vježbanja i oštećenja stanica. Rezultati ove studije pokazuju da je oštećenje strukture jetrenog tkiva vrlo ozbiljno nakon puno vježbanja, a utiče i na anabolizam stanica, kao što je smanjenje sinteze glikogena u jetri. Može se primijetiti da miševi koji uzimaju Cistanche smanjuju oštećenje jetre nakon puno vježbanja, uglavnom zbog smanjenja LDH5, a sadržaj glikogena u jetri je znatno veći nego u kontrolnoj grupi vježbanja, što sugerira daCistanchemože postići zaštitu jetre i održati normalnu fiziologiju smanjenjem funkcije LDH5. Iz rezultata bojenja glikogena, sadržaj glikogena uCistancheeksperimentalna grupa je veća od one normalne kontrolne grupe. DoesCistanchepovećati rezerve glikogena u jetri prije vježbanja ili ubrzati sintezu glikogena pod stresom nakon vježbanja? Ne može se izvući zaključak jer ne postoji kontrolna grupa koja ne vježbaCistancheu eksperimentu. To tek treba biti potvrđeno u sljedećem koraku, ali zaštitni učinak Cistanchea na jetru i promocija sinteze glikogena nakon puno vježbanja je očigledan.

NO je supstanca male molekule koja je posljednjih godina visoko cijenjena od strane sportske zajednice. NOS je glavni ograničavajući faktor za proizvodnju NO. Potvrđeno je da NOS ima 3 vrste izoenzima. NOS1 se naziva neuronska sintaza dušikovog oksida. Postoji u neuronskim ćelijama, ćelijama skeletnih mišića, itd., i uglavnom je uključen u neurorazvoj, neurosekreciju, učenje i procese pamćenja. NOS2 je inducibilna sintaza dušikovog oksida, koja se uglavnom nalazi u glatkim mišićnim stanicama, makrofagima i limfocitima. Jednom kada se ovaj enzim inducira, on može nastaviti sintetizirati NO sve dok se supstrat ne iscrpi ili ćelija ne umre. Trenutno se vjeruje da je uključen u oštećenje stanica; NOS3 je endotelna sintaza dušikovog oksida, koja je uglavnom raspoređena u endotelnim stanicama i hepatocitima. Proizvedeni NO je uglavnom uključen u fiziološke funkcije. Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je ekspresija NOS3 u endotelnim stanicama i hepatocitima oslabljena nakon puno vježbanja, a rezultirajući NO je smanjen, tako da se krvni sudovi ne mogu efikasno proširiti, protok krvi je smanjen, a sirovine za sintetički glikogen se ne može transportirati do stanica jetre, pa je sinteza glikogena smanjena.

Cistanche funkcija protiv umora

Cistanchemože povećati ekspresiju NOS3 u endotelnim stanicama i ćelijama jetre. Reaktivno širi krvne sudove. Povećajte protok krvi, ubrzajte sposobnost transporta sirovina za sintezu glikogena. Ubrzati sintezu glikogena i održavati tijelo na normalnom fiziološkom metaboličkom nivou. Stoga, smanjenje LDH5 radi zaštite jetre i povećanje ekspresije NOS3 za promicanje glukoneogeneze mliječne kiseline može biti važan mehanizam zaCistancheza zaštitu jetre i promicanje fizičkog oporavka. Ovo istraživanje daje naučnu eksperimentalnu osnovu za dalji razvoj i korištenjeCistancheu oblasti sportske medicine, a takođe postavlja temelje za razvoj i pročišćavanjeCistancheov efekatsupstance.

Članak iz: "Eksperimentalna studija mehanizama protiv sportskog umora Cistanche Deserticola" od YANG Hong-xin1, itd.

-----Kineski časopis informacija o TCM-u, april 2008. Vol.15 br.4