Eksperiment 4 Učinak feniletanol glikozida Cistanche Deserticola na perimenopauzalni sindrom kod miševa Depresija Materijali i metode 1 Eksperimentalni materijali

1.1 Eksperimentalne životinje

SPF miševi, rasa Kunming, ženka, 18~22g, obezbjeđena od Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., ova serija miševa broj certifikata: 0016003; laboratorijski certifikat broj SYXK (Yu) 2010-001. 1.2 Eksperimentalni lijekovi

Cistanche feniletanol glikozidpripremljen je po metodi Eksperimenta 1, a sadržaj je dostigao 66,47%. Gengnian'an kapsula, sastojci: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, kora božura, Poria cocos, sedef, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polyvineum u multiflora, polygonum multiflorum he. . Funkcije i indikacije:Negujte jin i savladajte jang, osloboditi nevoljeismiri um. Koristi se za valunge i znojenje u menopauzi, vrtoglavicu, tinitus, razdražljivost i nesanicu. Specifikacije: 0.3g po kapsuli. Upotreba i doziranje: Oralno, po 3 kapsule, 3 puta dnevno. Proizvođač: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Broj serije proizvodnje: 121104. Broj odobrenja: National Drug Approval No. Z14021848.

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi?

Sojini izoflavoni i vitamin E meke kapsule, lista sastojaka: izoflavoni soje u prahu, vitamin E, suncokretovo ulje, želatin, glicerin, voda, tartrazin, titanijum dioksid. Ikonični sastojci i sadržaj: Svakih 100 g sadrži 55,2 mg sojinih izoflavona (izračunatih kao genistein) i 608,5 mg vitamina E. Zdravstvene funkcije: Povećava gustinu kostiju. Uputstvo i doziranje: Uzimati 1 kapsulu 2 puta dnevno sa toplom vodom. Specifikacije: 500mg×100 kapsula. Proizvođač: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Broj serije proizvodnje: 13070302. Broj odobrenja: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Eksperimentalni reagensi

Natrijum karboksimetil celuloza, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., broj serije: 20120418; penicilin natrijum za injekcije, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikacija: 4 miliona jedinica, proizvodna serija: c1206807; otopina formaldehida (analitička kvaliteta), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., proizvodna serija: 20130902; 0,9% injekcija natrijum hlorida, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikacija: 250ml, proizvodna serija: 1301265303;

Hloralhidrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, serijski broj 20120827; miš E2 ELISA komplet za detekciju, kompanija za istraživanje i razvoj, serijski broj: 20140101A; komplet za T ELISA detekciju miša, kompanija za istraživanje i razvoj, serijski broj: 20140101A; komplet za detekciju LH ELISA za miš, kompanija za istraživanje i razvoj, serijski broj: 20140101A; Komplet za detekciju FSH ELISA za miš, kompanija za istraživanje i razvoj, broj serije: 20140101A;

Komplet za detekciju DA ELISA za miš, kompanija za istraživanje i razvoj, serijski broj: 20140101A; Miš 5-Kit za detekciju HT ELISA, kompanija za istraživanje i razvoj, serijski broj: 20140101A. 1.4 Eksperimentalni instrumenti

Elektronska vaga, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., model: JY601; elektronska analitička vaga, kompanija Ohaus (Šangaj), model: AR1140/C; brza stolna centrifuga, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, model: TGL-168 ; Električno termostatsko vodeno kupatilo, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., model: HWS12; Tester autonomne aktivnosti miša, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: ZZ-6; Mjerač izbjegavanja mraka miša, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: BA-200; Tester repnog ovjesa, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., model: TS-200; brza rashladna centrifuga, Zhongjia podružnica HKUST Innovation Co., Ltd., model: KDC-160HR; podesivi instrument za pipetiranje, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;

Čitač mikropločica, američka kompanija BIO-RAD, model: 680;

Električni mikroskop, Japanska kompanija OLYMPUS, model: BX61.

2 Eksperimentalne metode

2.1 Modeliranje i primjena lijekova

Odabrano je 90 ženki Kunming miševa tjelesne težine 23-25g, a 10 je nasumično odabrano kao prazna grupa i podvrgnuto je lažnoj operaciji, a preostali miševi su korišteni za kreiranje perimenopauzalni modeli. Nakon vaganja, miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 10% hloral hidrata (0,03ml/10g) i fiksiran je abdominalni položaj. Zatim je dlaka ošišana sa stražnje strane miša ispod zadnjeg rebra, na raskrsnici midaksilarne linije i oko 1 cm od vanjske strane kičme, a zatim urezana nakon dezinfekcije. Koža i leđni mišići su široki oko 0.5-1cm. U polju reza se vidi mlečno bijela sjajna masna masa, u koju je ugrađen jajnik. Malom pincetom nježno uhvatite masnu masu i izvucite je iz reza, odvojite masnu masu i vidjet ćete grupu tankih, nepravilnih, žutocrvenih jajnika. Prilikom rezanja prvo podvezite jajovode (uključujući masnoću) ispod jajnika tankim nitima, a zatim uklonite jajnike. Nakon operacije rogovi materice se vraćaju u trbušnu šupljinu, šivaju se mišići i koža, a na isti način se uklanjaju oba jajnika. Nakon operacije, životinje su pažljivo uzgajane i penicilin 200,{12}} u/kg (0,1 mL svaki) je intramuskularno ubrizgan kako bi se spriječila infekcija 3 uzastopna dana, jednom dnevno. 5 dana nakon operacije, rađen je vaginalni bris na svakom mišu jedan po jedan, jednom dnevno tokom 5 uzastopnih dana da bi se utvrdilo da li su jajnici potpuno uklonjeni. Miševi koji su pokazivali estrusnu reakciju u razmazu su odbačeni, a 60 potpuno kastriranih miševa je nasumično i ravnomjerno podijeljeno u 6 grupa za eksperimentalne svrhe, odnosno grupa modela, grupa Mengnianan, grupa izoflavona soje, velika, srednja iNiska doza Cistanche feniletanol glikozidne grupe. Životinje u svakoj grupi su 10. dana nakon operacije dobile odgovarajuće lijekove. Nakon 6 dana primjene, miševi u slijepoj grupi su uzgajani po 5 po kavezu, sa normalnom hranom i vodom, bez ikakve stimulacije. Svih 6 modelnih grupa uzgajano je po 1 miš po kavezu, i svaki dan nasumično su davane različite stimulacije. Sedam faktora stresa je primijenjeno nasumično u roku od 18 dana: vlažna stelja (1g legla/1ml vode); plivanje u ledenoj vodi (4 stepen, 5 min); toplotni stres (45 stepeni, 5 min); noćno osvetljenje (24h); stezanje repa (1 min); nedostatak vode (24 h); post (24h). Stimulus je davan nasumično svaki dan, a svaki se stimulus nije mogao pojavljivati ​​neprekidno 18 dana.

Način pripreme: 0.5% CMC Način pripreme: Izvagati 4 g natrijum karboksimetil celuloze i pomešati sa destilovanom vodom da dobijete 800 ml.

Doze velikih, srednjih i malih doza grupe Cistanche feniletanol glikozida bile su 200mg/kg, 10{{20}}mg/kg i 50mg/kg respektivno (zapremina za davanje 0,1ml/10g). Način pripreme: Odvažite 2000mg, 1000mg, odnosno 500mg Cistanche feniletanoidnog glikozida, rastvorite ih sa malom količinom 0,5% CMC, zatim podesite zapreminu na 100ml, dobro promiješajte i to je to. Gengniangan kapsule (675 mg/kg, pomešane sa destilovanom vodom do 67,5 mg/ml, 0,1 ml/10 g, što odgovara 15 puta većoj kliničkoj dozi); način pripreme: uzmite 9 Gengnianan kapsula, prvo upotrijebite malu količinu 0,5% CMC rastvora, zatim podesite volumen na 40 ml, i dobro promiješajte da dobijete dozu Gengnianan kapsule suspenzije (675 mg/kg). Meka kapsula vitamina E iz soje izoflavona (250 mg/kg, koristite destilovanu vodu da napravite 25 mg/ml, 0,1 ml/10 g, što odgovara 15 puta većoj kliničkoj dozi); Način pripreme: Uzmite 2 meke kapsule sojinog izoflavona vitamina E, prvo ih upotrebite. Otopite malu količinu 0,5% CMC, zatim podesite volumen na 40 ml i dobro promiješajte da dobijete dozu meke suspenzije sojinog izoflavona vitamina E (250 mg/kg ). Način čuvanja: u frižideru, na toplom tokom upotrebe.

Način primjene: Životinje u svakoj grupi su 10. dana nakon operacije dobile odgovarajuće lijekove. Grupi Gengnian'an oralno je davana suspenzija Gengnian'an kapsula 675 mg·kg-1, grupa sojinih izoflavona oralno je davana 250 mg·kg-1 meka suspenzija sojinog izoflavona vitamina E, i velika, srednje imale doze Cistancheafeniletanol. Grupi glikozida su oralno davane velike, srednje i male doze Cistanche feniletanol glikozida 200mg·kg-1, 10mg·kg-1, 50mg·kg{{ 5}}, 0,1ml/10g respektivno. Grupa slepih uzoraka i grupa modela su davane istom zapreminom 0,5% rastvora CMC jednom dnevno tokom 30 uzastopnih dana.

2.2 Stavke posmatranja i metode detekcije

Prinudno plivanje: Prvog dana nakon završetka stimulacije hroničnim stresom, mjereno je vrijeme nepokretnosti miševa u svakoj grupi u roku od 6 minuta u trajanju od 2-6 minuta. (Stavite miševe iz svake grupe u čašu od 2000 mL. Temperatura vode je 25 stepeni. Pored neophodnog minimalnog pokreta potrebnog za održavanje plutanja, udovi životinje prestaju da se kreću i evidentiraju se kao nepokretni. Zabilježite ukupno vrijeme nepokretnosti od 2 do 6 minuta u roku od 6 minuta ) Test dobrovoljne aktivnosti: Drugog dana nakon završetka hronične stresne stimulacije mjeren je broj spontanih aktivnosti miševa u svakoj grupi u roku od 5 minuta.

Metoda izbjegavanja mraka: Trećeg dana nakon završetka kronične stresne stimulacije, stavite rep miša u kutiju za mjerenje okrenut prema malom otvoru u mračnoj komori i provedite trening. Nakon 24 sata, ponovo izmjerite latenciju miša koji prvi put ulazi u mračnu prostoriju i vrijeme potrebno da uđe u tamnu prostoriju unutar 5 minuta. Broj strujnih udara.

Test suspenzije repa: Petog dana nakon završetka stimulacije hroničnim stresom, mjereno je vrijeme nepokretnosti miševa u svakoj grupi unutar 6 minuta u trajanju od 2-6 minuta.

2 sata nakon posljednje doze (12 sati bez hrane i vode), miševi su izmjereni, očne jabučice su uklonjene, krv je sakupljena, serum je odvojen i sadržaj E2, T, LH i FSH u serumu izmjereno; miševi su zatim ubijeni dislokacijom vratnih pršljenova, a miševi su secirani. , uklonite timus, slezinu i tkivo materice, izmjerite njihovu vlažnu težinu i izračunajte indeks organa (indeks organa=mokra težina organa mg/težina miša g), zatim uklonite mozak, odsječite polovicu i pripremite mozak homogenat tkiva. Enzimski imunotest je korišten za određivanje sadržaja monoaminskih neurotransmitera 5-HT i DA u homogenatu moždanog tkiva. Tkiva timusa, slezine, materice i mozga su fiksirani u 10% rastvoru formaldehida, umočeni u parafin, isečeni i obojeni HE. Morfološke promjene svake grupe promatrane su pod svjetlosnim mikroskopom. 2.3 Metoda određivanja kompleta

Uzmite uzorke seruma: Koristite epruvete koje ne sadrže pirogene i endotoksine. Izbjegavajte bilo kakvu ćelijsku stimulaciju tokom operacije. Nakon prikupljanja krvi, centrifugirajte je na 3000 o/min 10 minuta kako biste brzo i pažljivo odvojili serum i crvena krvna zrnca. Uzmite uzorke homogenata tkiva: Dodajte odgovarajuću količinu fiziološke otopine u tkivo i izgnječite. Centrifugirajte na 3000 o/min 10 minuta i uzmite supernatant.

Metoda određivanja mišjeg (mišja) estradiola (E2) ELISA kompleta je ista kao u eksperimentu 2. Koncentracije standardnih proizvoda (S0-55) su: 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pmol/L.

Metoda određivanja mišjeg testosterona (T) ELISA kompleta je ista kao i za estradiol (E2). Koncentracije standardnih proizvoda (S0-55) su: 0, 50, 100, 200, 400, 800 pg/mL.

Metoda određivanja ELISA kompleta za mišji folikul-stimulirajući hormon (FSH) je ista kao i za estradiol (E2). Koncentracije standardnih proizvoda (S0-55) su: 0, 5, 10, 20, 40 i 8{{30} }mIU/mL. Metoda određivanja ELISA kompleta za luteinizirajući hormon (LH) miša (miša) ista je kao i za estradiol (E2). Koncentracije standarda (S0-55) su: 0, 0,5, 1, 2, 4 i 8mIU/mL. Metoda određivanja mišjeg 5-hidroksitriptamina (5-HT) ELISA kompleta je ista kao i za estradiol (E2). Koncentracije standardnih proizvoda (S0-55) su: 0, 15, 30, 60, 120, 240 ng/ml. Metoda određivanja ELISA kompleta za otkrivanje dopamina (DA) miša (miša) ista je kao i za estradiol (E2). Koncentracije standardnih proizvoda (S0-55) su: 0, 7,5, 15, 30, 60 i 120 pg/ml.

Može se vidjeti iz tabele 21 i slike 25 da se u poređenju sa grupom slijepih miševa, vrijeme nepokretnosti miševa u grupi modela značajno povećalo u eksperimentima prisilnog plivanja i ovjesa repa (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).

2 Učinci na autonomne aktivnosti kod miševa modela perimenopauzalne depresije

Rezultati testa autonomne aktivnosti miševa u svakoj eksperimentalnoj grupi prikazani su u tabeli 22 i slici 26.

Iz tabele 23 i slika 27 i 28 može se vidjeti da je u poređenju sa slijepom grupom, period latencije miševa u grupi modela značajno smanjen, a broj elektrošokova značajno povećan (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).

4 Efekti na indeks organa kod miševa modela perimenopauzalne depresije

Iz tabele 24 i slike 29 može se vidjeti da su u poređenju sa slijepom grupom timusni indeks, indeks slezine i uteralni indeks grupe modela značajno smanjeni (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Cistanche feniletanol glikozidgrupa Timusni indeks i uteralni indeks kod miševa mogu biti značajno povećani (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).