Procjena antioksidansa, izbjeljivanja i anti-aging svojstava hidrolizata rižinih proteina

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hui-Ju Chen 1,2, Fan-Jhen Dai 2, Cheng-You Chen 3, Siao-Ling Fan 2, Ji-Hong Zheng 4, Yu-Chun Huang 2, Chi-Fai Chau 1, Yung-Sheng Lin 3, 4,5,* i Chin-Shuh Chen 1,*

sažetak:Hidrolizati proteina biljnog porijekla imaju potencijalnu primjenu u ishrani. Proteinski hidrolizati riže (RPH), odličan izvor proteina, privukli su pažnju za razvoj kozmetičkih preparata. Međutim, nekoliko studija je prijavilo potencijalnu primjenu RPH u analizi, a ova studija je ispitala njihovuantioksidansaktivnosti i inhibitorne aktivnosti enzima starenja kože. Rezultati su pokazali da su ukupne koncentracije fenola i flavonoida bile 2.06 ± 0,13 mg ekvivalenta galne kiseline/g RPH i 25,96 ± 0,52 µg ekvivalenta kvercetina/g RPH, respektivno. RPH su pokazali aktivnost ovisno o dozi za uklanjanje slobodnih radikala iz 1,1-difenil-2-pikrilhidrazila [polu-maksimalna inhibitorna koncentracija (IC50)=42.58 ± 2,1 mg/g RPHs] i 2 ,20-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (IC50=2.11 ± 0,88 mg/g RPHs), kapacitet smanjenja doze (6,95 ± 1,40) mg ekvivalenta vitamina C/g RPH) i kapacitet apsorpcije radikala kisika (473 µmol Trolox ekvivalent/g RPHs). Koncentracije otopine RPH potrebne za postizanje 50 posto inhibicije hijaluronidaze itirozinazaaktivnosti su utvrđene na 8,91 i 107,6 mg/mL, respektivno. Ova studija je pokazala da RPH imajuantioksidans,antihijaluronidazne i antitirozinazne aktivnosti za buduću kozmetičku primjenu.

Ključne riječi:hidrolizat proteina riže;antioksidans; hijaluronidaza;tirozinaza; kozmetički

cistancheizbjeljivanjeefekatna koži doantioksidacija

1. Uvod

Izloženost ultraljubičastom zračenju odgovorna je za fotostarenje (ili spoljašnje starenje); za razliku od toga, reaktivne vrste kisika koje nastaju u staničnom metabolizmu i pogoršanje bioloških funkcija odgovorne su za intrinzično starenje [1,2]. Prerađena hrana često sadrži prirodnuantioksidansikao što su katehini, askorbinska kiselina, tokoferoli, ružmarinska kiselina i fenolni ekstrakti iz raznih biljaka. Istraživanja provedena na prirodnim antioksidansima sada uzimaju u obzir netradicionalno porijeklo. Prirodni izvorantioksidansisu poželjniji od hemijski proizvedenihantioksidansibudući da su neki sintetički antioksidansi prijavljeni kao kancerogeni [3]. Pirinač (Oryza sativa) je glavna namirnica u ishrani ljudi širom sveta, posebno onih koji žive u Aziji. Godišnja proizvodnja riže u svijetu iznosi oko 741 milion tona [4]. U azijskim zemljama, pirinač je navodno izvor 75 posto energetskog unosa za preko 2 milijarde ljudi [5]. Ekstenzivna proizvodnja riže rezultira odgovarajućom količinom proizvodnje nusproizvoda. Preostali proizvod procesa proizvodnje riže sadrži većinu proteina zrna (~60–85 posto), ali se baca ili koristi za ishranu životinja [6–8]. Peptidi dobiveni iz različitih proteinskih hidrolizata navodno djeluju kao potencijalniantioksidansi[9]. Prirodni i netoksični antioksidansi se stoga potencijalno mogu ekstrahovati iz hidrolizata proteina hrane. Brojni naučnici su koristili modele bogate lipidima i prijavili hidrolizate proteina, kao i peptide proteina mlijeka, zeina i soje, koji imaju ključne antioksidativne karakteristike, uključujući uklanjanje slobodnih radikala, inhibiciju hrane i in vitro peroksidaciju lipida i kelaciju prijelaznih metala [10– 12].

Hijaluronska kiselina (HA) pomaže u podmlađivanju kože jer povećava viskozitet, sadrži vlagu i čini ekstracelularne tečnosti manje propusnim. Zbog svog odličnog kapaciteta zadržavanja vode, HA povećava mladost, hidrataciju i glatkoću kože i smanjuje stepen bora [13,14]. Nažalost, nivo HA u koži prirodno opada s godinama. Hijaluronidaza je enzim koji uništava HA, uzrokujući gubitak snage, fleksibilnosti i vlage kože, što zauzvrat dovodi do starenja kože. Stoga se bore mogu liječiti inhibicijom hijaluronidaze i održavanjem sadržaja HA u koži [15,16]. Enzim koji proizvodi melanintirozinazavitalno doprinosi koraku koji ograničava brzinu procesa kroz koji se proizvodi melanin. Stoga se poremećaji pigmentacije obično liječe, a posvjetljivanje kože postiže se inhibicijom ili smanjenjemtirozinazaaktivnost [17,18].

U nekoliko studija otkriveno je da hidrolizati proteina žitarica i peptidi koji se iz njih mogu dobiti imaju antioksidativno, antihipertenzivno i antitumorsko djelovanje [19,20]. Pozitivan doprinos ljudskom zdravlju peptida i proteina koji potiču iz hrane postepeno se prepoznaju [21]. Potrošači sve više zahtijevaju da kozmetička i zdravstvena industrija koriste prirodne bioaktivne spojeve. Proteinski hidrolizati riže (RPH) privukli su pažnju kao odličan izvor proteina. Međutim, nekoliko studija je objavilo karakterizaciju i funkcionalnu analizu RPH. Stoga je ova studija procijenila antioksidativnu aktivnost i hijaluronidazu itirozinaza-inhibitorne aktivnosti RPH.

2. Rezultati i diskusija

2.1. Ukupna koncentracija fenola (TPC) i ukupni sadržaj flavonoida (TFC)

Standard u TPC testu bila je galna kiselina nekoliko koncentracija. Veća apsorpcija ukazuje na viši TPC. TPC uzoraka RPH dobijen je unošenjem vrijednosti optičke apsorpcije RPH uzoraka u kalibracionu krivu galne kiseline. Prikazujući koncentraciju RPH u odnosu na koncentraciju fenola (Slika 1a), dobijen je prosječni TPC od 2.06 ± 0.13 mg GAE/g RPH. TFC od 25,96 ± 0,52 µg QE/gRPHs dobijen je slijedeći sličnu proceduru (Slika 1b). Slika 1c dalje povezuje TPC i TFC uzoraka RPH. Otkriva da se odnos između TPC i TFC može izraziti kao y=0.0121x plus 0,0659, gdje su x i y TPC i TFC, respektivno.

TPC RPH uključivao je koncentracije fenolnih aminokiselina i fenolnih spojeva peptida. Interakcija protein-fenolno jedinjenje općenito uključuje kovalentnu i nekovalentnu vezu. Fenolna jedinjenja se oslobađaju tokom enzimske hidrolize. Specifični enzimi mogu biti najsposobniji da unište komplekse protein-polifenol; to rezultira oslobađanjem većeg broja fenolnih jedinjenja i peptida sa fenolnim grupama, kao što je tirozin [22]. Prijavljena je jaka korelacija između ukupnog sadržaja polifenola u žitaricama i njihove biološke aktivnosti. Poznato je da polifenoli imaju jake antioksidativne aktivnosti [23]. Iako se nalaze u manjoj količini, terpeni [24] ili seskiterpeni [25] u pirinču također mogu doprinijeti antioksidativnim aktivnostima.

2.2. Aktivnost antioksidansa

2.2.1. Aktivnost uklanjanja radikala slobodnih radikala DPPH

Slika 2 prikazuje aktivnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH u otopini RPH. Otkriveno je da veća koncentracija otopine rezultira većom aktivnošću. Polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50), koja je koncentracija ekstrakta za koju se može ukloniti polovina svih slobodnih radikala DPPH, bila je 42,58 ± 2,1 mg/mL rižinih peptida.

2.2.2. Aktivnost čišćenja ABTS slobodnih radikala

Aktivnost uklanjanja slobodnih radikala ABTS RPH, ilustrovana na slici 3, bila je veća kada je korištena veća koncentracija ekstrakta. IC50 je bio 2,11 ± 0,88 mg/mL pirinčanih peptida. Ovaj rezultat je pokazao da RPH imaju jaku aktivnost uklanjanja slobodnih radikala ABTS. Aminokiseline koje sadrže sumpor, uključujući Met i Cys, i hidrofobne aminokiseline, uključujući Ala, Val, Ile, Leu, Met, Cys, Tyr, Phe, Try i Pro, mogu biti važni faktori u pogledu slobodnih radikala ABTS. aktivnost čišćenja.

U ovoj studiji, IC50 vrijednost aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala ABTS bila je niža od aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala DPPH, što se slaže s rezultatima ljuske i jezgre sjemena Jatropha curcas L. [28] i sjemenke i ljuske ploda žižule [29]. Ovaj nalaz takođe odgovara izveštaju o hidrolizatu proteina pirinčanih mekinja sa 43,98–66,25 µmoL Trolox ekvivalenta/g uzorka i 403,28–430,12 µmoL Trolox ekvivalenta/g uzorka za DPPH aktivnost uklanjanja slobodnih radikala, poštivanje aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala ABTS27].

Jedan od mogućih razloga je razlika u rastvorljivosti između slobodnih radikala DPPH (topiv u ulju) i slobodnih radikala ABTS (topiv u ulju/vodi) [30,31]. Na antioksidativni potencijal hidrolizata proteina rižinih mekinja utjecao je profil njihove molekularne težine, sastav aminokiselina i hidrofobnost [32].

2.2.3. Reduction Capacity

Nalazi testa redukcijske sposobnosti za RPHs prikazani su na slici 4. Kapacitet redukcije se povećavao s koncentracijom RPH. Kapacitet redukcije bio je 6,95 ± 1,40 mg VCE/g RPH, što ukazuje da su RPH efikasan antioksidans.

2.2.4. Kapacitet apsorpcije radikala kisika (ORAC)

ORAC test ima prednosti u odnosu na druge pristupe određivanju antioksidativne aktivnosti, uključujući reaktante koji se koriste kao peroksi radikali sa sličnim mehanizmom reakcije i redoks potencijalom kao fiziološki oksidanti; ukupni naboj i protonacijsko stanje s kojim jeantioksidansireakcije su slične onima u ljudskom tijelu [33]. ORAC metoda također ima biološki značaj za efikasnost antioksidanata u ljudskom tijelu. Slika 5 prikazuje rezultate ORAC analize RPH i Trolox standarda u različitim koncentracijama. ORAC je izveden iz jednadžbe regresije krivulje kalibracije koja povezuje neto AUC sa koncentracijom Troloxa. Rezultati su pokazali da RPH ima ORAC od 473 µmol TE/g RPH.

Antioksidativni peptidi ili aminokiseline mogu se dobiti enzimskom hidrolizom proteina, što rezultira visokom aktivnošću protiv oksidansa [34]. Kelacija metalnih jona, inhibicija peroksidacije lipida i uklanjanje slobodnih radikala biološki aktivnih peptida odgovorni su za njihovu antioksidativnu aktivnost. Slobodni radikali se mogu ugasiti, a ekspresija proteina i enzima koji smanjuju oksidativni stres reguliraju antioksidativni peptidi. Antioksidativna efikasnost proteinskih hidrolizata i peptida navodno zavisi od redosleda aminokiselina i veličine peptida, na koje utiču uslovi hidrolize, izvor proteina i tip proteaze [35]. Prema Adebiyiju i dr. [36], najveći probavljivi protein pirinčanih mekinja može se razbiti na manje komade subtilizinom, što rezultira većim prinosom i sadržajem proteina. Specifičnost enzima može uticati na TPC hidrolizata i antioksidativnu aktivnost. Stoga, na antioksidativnu aktivnost peptida mogu uticati karakteristike izvora proteina, specifičnost enzima i nivo hidrolize [37].

Postoje mnogi izvještaji o korištenju proteaza (kao što je Alkalaza, komercijalni naziv asubtilizina A iz Bacillus vrsta) za hidrolizu proteina biljnog porijekla kako bi se dobili antioksidativni peptidi. U tom smislu, sojini proteini su jedan od proteina koji se najviše prijavljuju [38]. Nadalje, alkalazna hidroliza proteina pirinčanih mekinja je također pronađena. U optimalnim uslovima, alkalazna hidroliza glutinoznih pirinčanih mekinja proizvodi proteinske hidrolizate sa IC50 vrijednošću 0.87 ± 0.02 mg/mL u DPPH uklanjanju slobodnih radikala [39]. U našoj studiji, IC50 vrijednost RPH je bila 42,58 ± 2,1 mg/mL. Iako vrijednost IC50 u uklanjanju slobodnih radikala DPPH u ovoj studiji nije bila tako djelotvorna kao ona iz proteina pirinčanih mekinja, ABTS uklanjanje slobodnih radikala (IC50=2.11 mg/mL) bilo je efikasnije od hidrolizata sojinih proteina dobivenih alkalasehidrolizom ( IC50=2.93 mg/mL) [40].

2.3. Inhibicijska aktivnost hijaluronidaze

Proteolitički enzim, hijaluronidaza, nalazi se u dermisu i katalizira razgradnju HA u ekstracelularnom matriksu [41]. Ova studija koristila je taninsku kiselinu kao pozitivnu kontrolu u svrhu poređenja. Slika 6 otkriva da taninska kiselina ima veću inhibiciju aktivnosti hijaluronidaze; IC50 je bio 0.14 mg/mL, slično vrijednosti koju su dobili Nishida et al. (0,121 mg/mL; 71,1 mM) [42]. Nasuprot tome, za RPH rastvor je izračunat IC50 od 8,91 mg/mL. Ovaj rezultat otopine RPH odgovara našoj prethodnoj vrijednosti IC50, 7,61 mg/mL [43]. Proteini, polisaharidi, te sintetička jedinjenja biljnog porijekla su među nizom spojeva u kojima su prisutni inhibitori hijaluronidaze. Ovi inhibitori pomažu u održavanju ravnoteže sinteze i razgradnje HA [44]. Niska koncentracija HA u koži dovodi do isušivanja i bora. Stoga je inhibicija aktivnosti hijaluronidaze put kojim se može poboljšati morfologija kože i odgoditi njeno starenje.

2.4. Aktivnost inhibicije tirozinaze

Hidrolizati proteina iz prirodnih izvora imaju potencijal da inhibirajuaktivnost tirozinaze. In vitro test inhibicije tirozinaze se obično koristi za procjenu kako sredstva za izbjeljivanje kože direktno utiču na aktivnost tirozinaze [45]. Učestvujući u koraku koji ograničava brzinu sinteze melanina, tirozinaza katalizira hidroksilaciju L-tirozina u L-DOPA, a zatim oksidaciju potonjeg u o-dopakinon. Kada je poželjno spriječiti biosintezu melanina, inhibicija aktivnosti L-tirozinaze može biti ključna. ovdje,tirozinazaje korišten za mjerenje aktivnosti RPH antitirozinaze. Kao što je prikazano na slici 7, koncentracija 107,6 mg/mL postigla je 50 posto inhibicije aktivnosti tirozinaze. Askorbinska kiselina je pokazala visoku aktivnost inhibicije tirozinaze (IC50=0.098 mg/mL), što je bilo slično 0,102 mg/mL koju su Seo et al. objavljeno [46].

Hidrolizati proteina pirinčanih mekinja pokazali su značajno visok nivotirozinaza-inhibitorna aktivnost [47,48]. Inhibicijska aktivnost rastvora RPH na tirozinazu može biti rezultat profila aminokiselina peptida. Schurink et al. opisao da je efikasantirozinaza-inhibitorni peptidi se sastoje od ostataka arginina i fenilalanina [49]. Aktivnost inhibicije tirozinaze može se poboljšati hidrofobnim aminokiselinskim ostacima (npr. alanin), a alanin može poremetiti proizvodnju melanina [50]. Osim toga, Zhang et al. također su izvijestili da hidrolizat pirinčanog proteina može smanjiti sadržaj melanina i aktivnost tirozinaze u UVB-induciranom modelu ćelija [51].

cistanche bodybuilding

2.5. Profili aminokiselina i MW-ovi RPH

Sadržaj proteina pirinča nakon uklanjanja škroba u ovoj studiji bio je 23,56% po težini, a stepen hidrolize uzorka hidrolizovanog proteazom bio je 9,36%. Tabela 1 opisuje sastav aminokiselina u RPH. U uzorku je svakih 100 g sadržavalo 5,18 g aminokiselina. Što se tiče komponenti aminokiselina, RPH su bili bogati alaninom, leucinom, argininom, glutaminskom kiselinom i asparaginskom kiselinom. Svakih 100 g uzorka sadržavalo je ukupno 1,73 g hidrofobnih aminokiselina (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin i cistein). Ovaj rezultat je bio potpuno drugačiji od našeg prethodnog izvještaja [43] u otopini amilaze i temperaturi tretmana za uklanjanje škroba. Sadržaj hidrofobnih aminokiselina bio je 1,90 puta veći od našeg prethodnog izvještaja. Niža temperatura tretmana (60 ◦C) u ovoj studiji može spriječiti denaturaciju proteina u velikim količinama, tako da se aktivnost aminokiselina može bolje očuvati. Osim toga, sličan zaključak je dobiven i iz drugih gljivičnih amilaze i glukoamilaze koje saharificiraju škrob u bijelim pirinčanim mekinjama [52].

Istraživanja su pokazala da su hidrofobne aminokiseline sličneantioksidansipovećanjem rastvorljivosti na bazi lipida u proteinskim hidrolizatima i peptidima iz različitih izvora proteina, čime se promoviše interakcija sa slobodnim radikalima [38,53]. Neke aminokiseline su objavili Chen et al. [54] općenito bitiantioksidansi; spomenute kiseline uključuju triptofan, cistein, metionin, tirozin i histidin. U ovoj studiji, aromatične aminokiseline (fenilalanin, tirozin i triptofan) sadržavale su 0.53 g/100 g RPH. Stoga su ove aminokiseline porijeklom iz peptida vjerovatno odgovorne za antioksidativnu aktivnost RPH.

Osim toga, proteini koji su hidrolizirani u kraće peptide imaju različitu MW distribuciju, a neke hidrofobne grupe presavijene u unutrašnjosti kompletnih prirodnih proteinskih molekula obično su izložene vodenoj fazi. Ovo je povezano sa strukturnim preuređenjem proteinskih molekula i stoga sa funkcionalnim svojstvima proteina [55,56]. Podaci tricin-SDS-PAGE pokazuju da je MW RPH u rasponu 5–35 kDa (Slika 8a).

Slika 8b prikazuje relativni sadržaj različitih MW u RPH. Sve u svemu, 45,24 posto svih proteina bilo je u glavnom pojasu (MW ≈ 2,4 kDa). Slični rezultati su dobijeni u vezi sa peptidom hidrolizata proteina pirinčanih mekinja. Najveća antioksidativna aktivnost koju su postigli Thamnarathip et al. [37] je to za peptide MW=6–50 kDa. Osim toga, postoje veze između funkcije proteinskih hidrolizata i MW distribucije i sastava aminokiselina [57]. Ovo objašnjava antioksidativnu aktivnost RPH uočenu u ovoj studiji.

2.6. Test toksičnosti ćelija

Za buduću primjenu potrebna je niska toksičnost ćelija. Da bi se procijenila citotoksičnost i biokompatibilnost RPH, vijabilnost ćelija sirovih 264,7 ćelija u otopini RPH mjerena je MTT metodom. Kao što je prikazano na slici 9, vitalnost ćelija je bila iznad 100 procenata kada se tretira sa 25–2000 µg/mL RPH tokom 24 h i 48 h. Rezultati ukazuju na izuzetno nisku citotoksičnost RPH. Stoga se RPH mogu potencijalno koristiti kao kozmetičke primjene s vrlo niskom citotoksičnošću.

3. Materijali i metode

3.1. Reagensi

Gvožđe(III) hlorid, 2,20-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS), Trolox(6-hidroksi-2,5 ,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina), l-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH) i trihlorosirćetna kiselina nabavljeni su od Alfa Aesar (Tewksbury, MA, SAD). 2,20-azobis(2-metilpropionamidin) dihidroklorid (AAPH), Folin-Ciocalteuov fenol reagens, galna kiselina, askorbinska kiselina, gljivatirozinaza, a fluorescein natrijum je nabavljen od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Natrijum karbonat je dobijen od Riedel-de Haën (Seelze, Njemačka). Konačno, kalijum fericijanid, natrijum hidrogen fosfat i natrijum dihidrogen fosfat nabavljeni su od Showa Chemical (Tokio, Japan).

3.2. Priprema RPH

RPH su pripremljeni kako je prethodno opisano, osim što je gljivična amilaza usvojena za saharificiranje škroba u pirinčanom brašnu, izbjegavajući oštećenje aminokiselina uzrokovano hidrolizom bakterijamilaze na visokim temperaturama [43,58]. Sto grama pirinčanog brašna natopljeno je u 1000 mL destilovane vode koja sadrži 0,5 posto gljivične amilaze (Genencor, NY, SAD); smjesa je zatim zagrijavana 24 h na 60 ◦C ( pH 4,2), nakon čega je ostavljeno da se ohladi na sobnu temperaturu. Centrifugiranje je izvedeno 10 minuta na 1968× g da bi se uklonio preostali supernatant. Nakon što je u nerastvorljivu porciju dodato 20-kratka voda i 2 mL 0,1 posto hidrolitičke proteaze (Healthmate, Changhua, Taiwan), otopina je protresena i inkubirana 4 h na 55 ◦C. Metoda pH-stata je korišćena da bi se pH rastvora održao na optimalnom nivou, a zatim je izvršeno zagrevanje na 85 ◦C za 10 min inaktivacije forenzima. Preostala nerastvorljiva frakcija je uklonjena centrifugiranjem u trajanju od 15 minuta na 3075 × g. Liofilizacija je izvršena na supernatantu, koji je pre upotrebe čuvan na -20 ◦C.

3.3. Antioksidativna aktivnost RPH

3.3.1. Ukupna koncentracija fenola (TPC)

Korištena je Folin-Ciocalteuova metoda za otkrivanje TPC-a RPH-a [59]. Prvo, 200 µL Folin-Ciocalteuovog fenolnog reagensa (0,3M) je jednoliko pomiješano kroz5-minutno mućkanje sa 200 µL otopine RPH i ovoj mješavini je dodano 400 µL deionizirane (DI) vode i 200 µL 10 postotnog (w/v) rastvora natrijum karbonata. Pomiješana otopina je podvrgnuta 60 minuta inkubacije u mraku na sobnoj temperaturi. Zatim je centrifugiran 15 minuta na 3000 o/min. Za mjerenje je korišteno 100 µL supernatanta. Za određivanje TPC (jedinica: mg) ekvivalenta galne kiseline (GAE) po gramu suvog RPH uzorka (jedinica: mg GAE/g RPH), podaci optičke apsorpcije su uneseni u standardnu ​​krivu koja predstavlja galnu kiselinu. Apsorbanca je dobijena na 700 nm korišćenjem EpochMicroplate spektrofotometra (BioTek, VT, SAD).

3.3.2. Ukupan sadržaj flavonoida (TFC)

TFC je dobijen prema pristupu Wathoni et al. uz manje izmjene [60]. Prvo je pomiješano 500 µL svakog uzorka i 2 procenta (w/v) rastvora aluminijum hlorida. Reakciona otopina je dobro promiješana i ostavljena 10 min, te je procijenjena apsorpcija na 415 nm. Rezultat je iskazan u mikrogramima kvercetinskog ekvivalenta (QE) po gramu suvog uzorka RPH (µg QE/g RPH).

cistanche bodybuilding

3.3.3. DPPH aktivnost uklanjanja slobodnih radikala

Prvo su pomiješani 198 µM DPPH rastvora etanola (50 µL) i RPH rastvor ili DI voda (0,5 µL; uzorak i kontrola, respektivno), a zatim ostavljeni da odstoje 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Nakon toga je dobijena apsorbancija rastvora na 517 nm. Relativna aktivnost čišćenja je izračunata određivanjem razlike u apsorpciji između uzorka i kontrole. Visoka aktivnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH odražava se niskom optičkom apsorbancijom. U procjeni aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala DPPH otopine RPH, korišteni standard je vitamin C [61–63].

3.3.4. Aktivnost čišćenja ABTS slobodnih radikala

Pristup koji su iznijeli Wu et al. je korišten za procjenu antioksidativne aktivnosti otopine RPH [64]. Prvo, 7 mM matične otopine ABTS (250 µL) reaguje sa 2,45 mM kalijum persulfata (250 µL) kako bi se dobio ABTS kation slobodnih radikala (ABTS• plus), pri čemu je smjesa zadržana 16 h na 4 ◦C u mraku prije upotrebe. Nakon ekvilibracije u mraku na sobnoj temperaturi, 0.1 M fiziološki rastvor puferiran sa fosfatom (PBS; pH 7,4) je upotrijebljen da se otopina razrijedi do 0,70 ± 0,02 apsorbancije na 734 nm. Zatim je u 180 µL razrijeđene ABTS otopine dodano 20 µL Troloxa (pozitivna kontrola) ili otopine RPH (uzorak). Smjesa je zatim podvrgnuta 10 min inkubacije na sobnoj temperaturi. Ova studija je utvrdila optičku apsorbanciju na 734 nm; niža apsorpcija odgovara višoj ABTS aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala. Standard koji se koristi za procjenu ABTS aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala RPHsolution je antioksidans Trolox.

3.3.5. Reduction Capacity

Test antioksidativne snage redukcije željeza korišten je za određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti RPH rješenja. Kako navode Lin et al. [29], otopina RPH (200 µL) je jednoliko pomiješana sa 1 posto (w/v) K3Fe(CN)6 i 0,2 M PBS pufera (pH 6,6; 100 µL svaki) .U toku 20 minuta, korišćeno je vodeno kupatilo od 50 ◦C za zagrevanje smeše; nakon vađenja smjese iz kupke, brzo je hlađena 3 min. Nakon toga, izvršeno je dodavanje 10 posto (w/v) trihlorosirćetne kiseline (100 µL) i 10-min centrifugiranje na 3000 rpm. Nakon toga je uslijedila ekstrakcija supernatanta (400 µL) i njegovo ravnomjerno miješanje sa O. 1 posto (w/v) FeCl3 (100 µL) i DI voda (400 µL). Fe4[Fe(CN)6]3 je dobijen10-minutnom reakcijom ove smjese u mraku. Nakon toga, veća optička apsorbancija (izmjerena na 700 nm) ukazuje na veći kapacitet redukcije. Standardni vitamin C korišten je za određivanje sadržaja ekvivalenta vitamina C (VCE) po gramu RPH.

3.3.6. Kapacitet apsorpcije radikala kisika (ORAC)

Ova studija je dobila ORAC modifikacijom prethodno objavljene metode [65]. Nakon rastvaranja uzorka RPH u destilovanoj vodi, rastvor RPH (50 µL) je pomešan sa fluoresceinom (10 µM) u mikrotitarskoj ploči sa 96-jažicom. Rastvor je podvrgnut 15-min inkubaciji na 37 ◦C nakon čega je dodato 50 µL AAPH (500 mM). Svakih 5 minuta i tokom ukupno 120 min, fluorescencija je zabilježena (λex i λem=485 i 528 nm, respektivno). Antioksidativni kapacitet RPH otkriven je iz kinetike raspada fluorescencije izračunavanjem površine ispod krive (AUC ). U računanju RPH ORAC, standard je bio 15–250 µM Trolox. ORAC je prijavljen kao mikromol Trolox ekvivalenta (TE) pergrama suhog uzorka RPH (µmol TE/g RPHs).

3.4. Inhibicijska aktivnost hijaluronidaze

Test inhibicije hijaluronidaze je izveden korištenjem {{0}}mikroploče i ranije objavljene metode sa malim modifikacijama [40]. N-acetilglukozamin se oslobađa reakcijom hijaluronidaze sa HA supstratom. U prisustvu bilo kojeg inhibitora, oslobađanje N-acetilglukozamina je smanjeno, pri čemu je ovo oslobađanje detektirano dobijanjem 600-nm apsorbancije. HA je precipitirana kiselim rastvorom albumina sastavljenom od 0.1 M acetatnog pufera (pH 3,9) i albumina goveđeg seruma (1 mg/mL). Rastvor uzorka i 5 mg/mL hijaluronidaze podvrgnuti su 20-min inkubaciji na 37 ◦C. U smjesu za inkubaciju, naknadno je dodana HA (1{{20}}0 µL; 5,0 mg/mL u 0,1 M acetatnom puferu). Dalja inkubacija na 37 ◦C u trajanju od 40 min. Dodano je 0,1 mL 0,4 M rastvora alkalnog borata da se zaustavi enzimska reakcija.

3.5. Aktivnost inhibicije tirozinaze

Ova studija je procijenila antitirozinazno djelovanje RPH korištenjem prethodno objavljenog protokola s modifikacijama [66]. Rastvor enzima (135 U/mL) je pripremljen otapanjem tirozinaze u 20 mM fosfatnog pufera (pH 6,8). Dodatno, DIvoda je korištena za pripremu otopine 1,25 mM L-DOPA. Zatim je pomešano 40 µL različitih koncentracija rastvora RPH uzoraka sa 40 µL rastvora tirozinaze i 120 µL rastvora L-DOPA. Ova mješavina je 30 minuta držana na 37 ◦C u testu inhibicije RPHstirozinazaaktivnost. Spektrofotometar (FLUOstar Omega MicroplateReader, BMG Labtech GmbH, Njemačka) je korišten za dobivanje 475-nm apsorbancije. Sva mjerenja su izvršena tri puta. Apsorbancija odgovarajuće grupe kadatirozinazanije bilo oduzeto. Stopa inhibicije enzima određena je kao

3.6. Karakterizacija RPH

3.6.1. Profili aminokiselina

Ovo istraživanje otkrilo je sastav aminokiselina RPH. Prvo, tokom 24 sata i na 115 ◦C, 4 M metansulfonska kiselina je korištena za hidrolizu uzoraka u evakuiranim zatvorenim cijevima. Dva sistema za isporuku rastvarača Waters 510 i analizator aminokiselina (L 8900; Hitachi, Tokio, Japan) korišćeni su za odvajanje derivatizovanih amino kiselina na aSpherisorb ODS2 koloni dužine 25 m × 64,6 mm. Ova studija je koristila sljedeće rastvarače: (a) natrijum acetat (0,14 M) i trietilamin (850 µL/L; pH 5,6) i (b) 60 posto acetonitrila, za koji je gradijent bio 0 posto tokom 2 minute; 0–42 posto za 15,5 min (konveksna kriva); i 100 posto za 4 min. Dupli uzorci su uzeti za mjerenje profila aminokiselina na 254 nm [67,68].

3.6.2. Molekularna težina (MW) proteina

U skladu sa Schäggerovom metodom [69] i pod redukcijskim uslovima, u ovoj studiji je dobijena distribucija MW putem tricin–natrijum dodecil sulfat (SDS)–poliakrilamidegel elektroforeze (PAGE) uz neznatne modifikacije. Pufer za uzorak (30 g/L SDS, 0.375 MTris-HCl, 0.125 g/L Coomassie Brilliant Blue G-250 i 75 g/ L glicerol; pH 7) je upotrijebljen za raspršivanje liofiliziranog uzorka, uz centrifugiranje koje je zatim izvedeno prije punjenja. Ukupno 20 µL 2-merkaptoetanola je dodano u 1 mL tricin-SDS-PAGE uzorka. Uzorak je zagrijavan na 100 ◦C 90 s. Jažica za uzorke je napunjena svakim uzorkom i Unstained Protein Standard Broad Range (Bio-Rad Laboratories, Njemačka) pomoću mikrošprica. Zatim je izvedena elektroforeza – prvo pri konstantnom naponu od 30 mV sve dok cijeli uzorak nije bio sadržan u gelu za slaganje, a zatim do završetka pri konstantnom naponu od 100 mV. Nakon toga, 0,02 posto Coomassie Brilliant Blue R{23}} otopina je primijenjena za bojenje gela. Apsolutno pozadinsko bojenje gelova izvedeno je mućkanjem gelova u 10 posto sirćetne kiseline preko noći. Konačno, gel slika je analizirana da bi se identifikovale trake proteina u trakama; ova analiza je obavljena u ImageJ (USNational Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Standardni markeri su korišteni da bi se dobila kalibracijska kriva iz koje je procijenjena MW. Ukratko, prvi korak je bio da se odredi dužina migracije svake trake (Rf) od vrha gela za razdvajanje. Ovaj drugi korak je bio proračun kalibracione krive upotrebom Rf i log (MW) za standardni marker sa datim MW. Određivanje MW je izvršeno korištenjem Rf proteinskih traka u RPH.

3.7. Cytotoxicity Assay

Sirove 264,7 ćelije uzgajane su u visokoglukoznom Dulbecco-ovom modificiranom mediju orla (DMEM) koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 4,5 g/L glukoze, 1 posto otopine antibiotika (100 jedinica/ mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina), 4 mM L-glutamina i 1,5 g/L natrijum bikarbonata na 37 ◦C i 5 posto CO2. Ćelijska toksičnost sirovih 264,7 ćelija za RPHs mjerena je metodom analize proliferacije 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil-tetrazolij bromida (MTT) . Otprilike 1 × 104 ćelija po jažici je postavljeno u 96- ploče sa bunarima. Nakon 24 h, različite koncentracije RPH (0-2000 µg/mL) su dodane u ćelije. Nakon 24 i 48 h inkubacije, dodano je 100 µL MTT rastvora (0,5 mg/mL). Uočeni su plavi kristali formazana kada su pregledani pod mikroskopom. DMEM je uklonjen i 100 µL dimetil sulfoksida (DMSO) je dodano po jažici. Apsorbancija je mjerena pomoću čitača mikrotitarskih ploča. Vijabilnost ćelija ( posto ) je zatim izračunata kao [A570 (tretirane ćelije) − A570 (pozadina)] / [A570 (netretirane ćelije) − A570 (pozadina)] × 100 posto [70].

3.8. Statistička analiza

Izvještaj za svaki uzorak hidrolizata bio je prosječna vrijednost iz tri nezavisna ponovljena eksperimenta i određivanja. Rezultati izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) analizirani su jednosmjernom ANOVA-om i Duncan-ovim post hoc testom koristeći StatisticalAnalysis System (verzija 20.0; SPSS, Armonk, NY, SAD). Vrijednosti p < 0,05="" smatrane="" su="" statističkom="">

4. Zaključak

Ova studija je ispitivala funkcije RPH. Eksperimentalni rezultati su otkrili da RPH sadrže fenolna jedinjenja i flavonoide i da pokazuju niz antioksidativnih aktivnosti, kao što su aktivnosti uklanjanja DPPH i ABTS, kapacitet redukcije i ORAC. Osim toga, RPH su efektivno inhibiranetirozinazai aktivnosti hijaluronidaze. Proteaza je bila kritičan faktor koji utiče na MW obrasce RPH. Analiza RPH ukazuje na njihov potencijal za upotrebu kao sastojak u kozmetici.

cistanche bodybuilding

Reference

1. Ichihashi, M.; Ando, ​​H.; Yoshida, M.; Niki, Y.; Matsui, M. Fotostarenje kože. Anti-Aging Med. 2009, 6, 46–59. [CrossRef]

2. Kim, J.-S.; Kim, D.; Kim, H.-J.; Jang, A. Zaštitni efekat hidrolizata želatina iz magareće kože na UVB-indukovano fotostarenje fibroblasta ljudske kože. Proces. Biochem. 2018, 67, 118–126. [CrossRef]

3. Carocho, M.; Ferreira, IC Pregled antioksidansa, prooksidansa i srodnih kontroverzi: Prirodna i sintetička jedinjenja, metodologije skrininga i analize i buduće perspektive. Food Chem. Toxicol. 2013, 51, 15–25. [CrossRef]

4. Guo, X.; Zhang, J.; Ma, Y.; Tian, ​​S. Optimizacija ograničene hidrolize proteina u ostatku riže i karakterizacija funkcionalnih svojstava proizvoda. J. Food Proc. Preserv. 2013, 37, 245–253. [CrossRef]

5. Park, H.-Y.; Lee, K.-W.; Choi, H.-D. Sastojci rižinih mekinja: Imunomodulatorno i terapeutsko djelovanje. Funkcija hrane. 2017, 8,935–943. [CrossRef] [PubMed]

6. Zhou, K.; Canning, C.; Sun, S. Efekti hidrolizata proteina riže pripremljenih mikrobnim proteazama i ultrafiltracijom na slobodne radikale i oksidaciju lipida mesa. LWT 2013, 50, 331–335. [CrossRef]

7. Piu', LD; Tassoni, A.; Serrazanetti, DI; Ferri, M.; Babini, E.; Tagliazucchi, D.; Gianoti, A. Eksploatacija tečnog nusproizvoda industrije škroba za proizvodnju bioaktivnih peptida iz hidroliziranih proteina riže. Food Chem. 2014, 155, 199–206. [CrossRef]

8. Ferri, M.; Graen-Heedfeld, J.; Bretz, K.; Guillon, F.; Michelini, E.; Calabretta, MM; Lamborghini, M.; Gruarin, N.; Roda, A.; Kraft, A.; et al. Frakcije peptida dobijene iz nusproizvoda riže putem ekološki prihvatljivog procesa pokazuju in Vitro bioaktivnosti povezane sa zdravljem. PLOS ONE 2017, 12, e0170954. [CrossRef]

9. Wen, C.; Zhang, J.; Zhang, H.; Duan, Y.; Ma, H. Antioksidativni peptidi dobijeni iz biljnih proteina: izolacija, identifikacija, mehanizam djelovanja i primjena u prehrambenim sistemima: pregled. Trends Food Sci. Technol. 2020, 105, 308–322. [CrossRef]

10. Phelan, M.; Aherne, A.; FitzGerald, RJ; O'Brien, NM Bioaktivni peptidi izvedeni iz kazeina: biološki efekti, industrijska upotreba, sigurnosni aspekti i regulatorni status. Int. Dairy J. 2009, 19, 643–654. [CrossRef]

11. Udenigwe, CC; Aluko, RE Bioaktivni peptidi dobijeni od proteina iz hrane: proizvodnja, prerada i potencijalne zdravstvene koristi. J.Food Sci. 2012, 77, 11–24. [CrossRef] [PubMed]

12. Fardet, A.; Rock, E. In vitro i in vivo antioksidativni potencijal mlijeka, jogurta, fermentisanog mlijeka i sireva: narativni pregled dokaza. Nutr. Res. Rev. 2018, 31, 52–70. [CrossRef]

13. Leach, JB; Kathryn, AB; Charles, WPJ; Christine, ES Foto-povezani hidrogelovi hijaluronske kiseline: prirodne, biorazgradive skele za inženjerstvo tkiva. Biotechnol. Bioeng. 2003, 82, 578–589. [CrossRef]

14. Jegasothy, SM; Zabolotniaia, V.; Bielfeldt, S. Efikasnost nove topikalne nano-hijaluronske kiseline kod ljudi. J. Clin. Aesthet.Dermatol. 2014, 7, 27–29.

15. Ndlovu, G.; Fouche, G.; Tselanyane, M.; Cordier, W.; Steenkamp, ​​V. In vitro određivanje anti-aging potencijala četiriju južnoafričkih ljekovitih biljaka. BMC Complement. Altern. Med. 2013, 13, 304. [CrossRef]

16. Jiratchayamaethasakul, C.; Ding, Y.; Hwang, O.; Im, S.-T.; Jang, Y.; Myung, S.-W.; Lee, JM; Kim, H.-S.; Ko, S.-C.; Lee, S.-H. In vitro skrining inhibitornih i antioksidativnih aktivnosti elastaze, kolagenaze, hijaluronidaze i tirozinaze 22 ekstrakta halofitnih biljaka za nove kozmeceutike. Riba. Aquat. Sci. 2020, 23, 1–9. [CrossRef]

17. Kang, M.; Park, S.-H.; Oh, SW; Lee, SE; Yoo, JA; Nho, YH; Lee, S.; Han, BS; Cho, JY; Lee, J. Anti-melanogeni efekti resorcinola su posredovani supresijom cAMP signalizacije i aktivacijom p38 MAPK signalizacije. Biosci. Biotechnol. Biochem.2018, 82, 1188–1196. [CrossRef]

18. Chatatikun, M.; Yamauchi, T.; Yamasaki, K.; Aiba, S.; Chiabchalard, A. Antimelanogeni efekat listova Croton roxburghii i Crotonsublyratus u -MSH stimulisanim B16F10 ćelijama. J. Tradit. Dopuna. Med. 2019, 9, 66–72. [CrossRef] [PubMed]

19. Rizzello, CG; Nionelli, L.; Coda, R.; Gobbetti, M. Synthesis of the Cancer Preventive Peptide Lunasin by Lactic Acid BacteriaDuring Sourdough Fermentation. Nutr. Cancer 2012, 64, 111–120. [CrossRef] [PubMed]

20. Rizzello, CG; Tagliazucchi, D.; Babini, E.; Rutella, GS; Saa, DLT; Gianoti, A. Bioaktivni peptidi iz matrica biljne hrane: Istraživački trendovi i nove biotehnologije za sintezu i oporavak. J. Funct. Foods 2016, 27, 549–569. [CrossRef]

21. Coscueta, ER; Campos, DA; Osório, H.; Nerli, BB; Pintado, M. Enzimska hidroliza proteina soje: alat za proizvodnju biofunkcionalnih sastojaka hrane. Food Chem. X 2019, 1, 100006. [CrossRef]

22. Aydemir, LY; Yemenicioglu, A. Da li su fenolni antioksidansi vezani za proteine ​​u mahunarkama nevidljivi dio ledenog brega? J. Plant. Biochem.Physiol. 2013, 1, 1–3. [CrossRef]

23. Huang, SH; Ng, LT Kvantifikacija sadržaja polifenola i bioaktivnih sastojaka nekih komercijalnih sorti riže na Tajvanu. J. Food Compos. Anal. 2012, 26, 122–127. [CrossRef]

24. Yoshitomi, K.; Taniguchi, S.; Tanaka, K.; Uji, Y.; Akimitsu, K.; Gomi, K. Terpen sintaza riže 24 (OsTPS24) kodira monoterpen sintazu koja reaguje na jasmonat i koja proizvodi antibakterijski terpinen protiv patogena riže. J. Plant. Physiol. 2016, 191,120–126. [CrossRef]

25. Kamolsukyeunyong, W.; Sukhaket, W.; Pitija, K.; Thorngkham, P.; Mahatheeranont, S.; Toojinda, T.; Vanavičit, A. RiceSesquiterpene igra važnu ulogu u antiksenozi protiv smeđe biljčice u riži. Biljke 2021, 10, 1049. [CrossRef][PubMed]

26. Liu, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Liang, M.; Yang, L. In vitro antioksidativna aktivnost rižinog proteina pod utjecajem alkalnog stupnja i probave gastrointestinalnih proteaza. J. Sci. Food Agric. 2016, 96, 4940–4950. [CrossRef] [PubMed]

27. Phongthai, S.; D'Amico, S.; Schoenlechner, R.; Homthavornchoo, W.; Rawdkuen, S. Frakcioniranje i antioksidativna svojstva hidrolizata proteina pirinčanih mekinja stimuliranih in vitro gastrointestinalnom probavom. Food Chem. 2018, 240, 156–164. [CrossRef][PubMed]

28. Huang, S.-L.; Wang, W.-H.; Zhong, X.-Y.; Lin, C.-T.; Lin, W.-S.; Chang, M.-Y.; Lin, Y.-S. Antioksidativna svojstva Jatropha curcas L. Ekstrakti ljuske sjemena i jezgre. Appl. Sci. 2020, 10, 3279. [CrossRef]

29. Lin, Y.-S.; Lin, W.-S.; Tung, J.-W.; Cheng, Y.-C.; Chang, M.-Y.; Chen, C.-Y.; Huang, S.-L. Antioksidativni kapaciteti sjemenki voća žižule i kore pulpe. Appl. Sci. 2020, 10, 6007. [CrossRef]

30. Shahi, Z.; Sayyed-Alangi, SZ; Najafian, L. Efekti tipa enzima i vremena procesa na stepen hidrolize, trake elektroforeze i antioksidativna svojstva hidrolizovanih proteina dobijenih iz odmašćenog Bunium persicum Bioss. press cake. Heliyon 2020, 6,e03365. [CrossRef] [PubMed]

31. Xie, H.; Huang, J.; Woo, MW; Hu, J.; Xiong, H.; Zhao, Q. Efekat deaktivacije hladnih i vrućih enzima na strukturna i funkcionalna svojstva hidrolizata proteina rižinog ostatka. Food Chem. 2021, 345, 128784. [CrossRef]

33. Rani, S.; Pooja, K.; Pal, GK Istraživanje hidrolizata i peptida rižinih proteina s posebnim osvrtom na antioksidativni potencijal: Računski izvedeni pristupi za određivanje bioaktivnosti. Trends Food Sci. Technol. 2018, 80, 61–70. [CrossRef]

33. Bisby, RH; Brooke, R.; Navaratnam, S. Efekat antioksidativnog oksidacionog potencijala u testu kapaciteta apsorpcije radikala kiseonika (ORAC). Food Chem. 2008, 108, 1002–1007. [CrossRef]

34. Elias, RJ; Kellerby, SS; Decker, E. Antioksidativna aktivnost proteina i peptida. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2008, 48, 430–441.[CrossRef] [PubMed]

35. Mine, Y.; Li-Chan, E.; Jiang, B. (Eds.) Bioaktivni proteini i peptidi kao funkcionalna hrana i nutricionisti; Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, SAD, 2010; str. 29–42.

36. Adebiyi, AP; Adebiyi, AO; Yamashita, J.; Ogawa, T.; Muramoto, K. Prečišćavanje i karakterizacija antioksidativnih peptida izvedenih iz hidrolizata proteina pirinčanih mekinja. EUR. Food Res. Technol. 2008, 228, 553–563. [CrossRef]

37. Thamnarathip, P.; Jangchud, K.; Nitisinprasert, S.; Vardhanabhuti, B. Identifikacija molekulske težine peptida iz hidrolizata proteina pirinčanih mekinja sa visokim antioksidativnim djelovanjem. J. Cereal Sci. 2016, 69, 329–335. [CrossRef]

38. Tacias-Pascacio, VG; Morellon-Sterling, R.; Siar, E.-H.; Tavano, O.; Berenguer-Murcia, Á.; Fernandez-Lafuente, R. Upotreba alkalazeina u proizvodnji bioaktivnih peptida: pregled. Int. J. Biol. Macromol. 2020, 165, 2143–2196. [CrossRef] [PubMed]

39. Sarringkarin, W.; Laokuldilok, T. Optimizacija uslova proizvodnje glutinoznog hidrolizata proteina pirinčanih mekinja sa antioksidativnim svojstvima. CMU J. Nat. Sci. 2017, 16, 1–18. [CrossRef]

40. Zhang, Q.; Tong, X.; Qi, B.; Wang, Z.; Li, Y.; Sui, X.; Jiang, L. Promjene u antioksidativnoj aktivnosti alkalaza-hidroliziranog sojinog hidrolizata pod simuliranom gastrointestinalnom probavom i transepitelnim transportom. J. Funct. Foods 2018, 42, 298–305. [CrossRef]

41. Tu, PTB; Tawata, S. Antioksidativna, anti-aging i anti-melanogena svojstva esencijalnih ulja iz dvije sorte alpinia zerumbet. Molecules 2015, 20, 16723–16740. [CrossRef]

42. Nishida, Y.; Sugahara, S.; Wada, K.; Toyohisa, D.; Tanaka, T.; Ono, M.; Yasuda, S. Inhibicijski efekti ekstrakta etil acetata iz lukovica Scilla scilloides na aktivnosti lipoksigenaze i hijaluronidaze. Pharm. Biol. 2014, 52, 1351–1357. [CrossRef]

43. Chen, H.-J.; Dai, F.-J.; Fan, S.-L.; Huang, Y.-C.; Chau, C.-F.; Lin, Y.-S.; Chen, C.-S. Kinetika inhibicije hijaluronidaze hidrolizatom proteina riže (Oryza sativa L.). Appl. Sci. 2020, 10, 9087. [CrossRef]

44. Girish, K.; Kemparaju, K. Čarobni ljepilo hijaluronan i njegova gumica hijaluronidaza: biološki pregled. Life Sci. 2007, 80,1921–1943. [CrossRef] [PubMed]

45. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Khan, MTH; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Sveobuhvatni pregled inhibitora tirozinaze. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef] [PubMed]

47. Seo, EJ; Hong, ES; Choi, MH; Kim, KS; Lee, SJ Antioksidativni i izbjeljivanje kože ekstrakti Rhamnus yoshinoi. KoreanJ. Food Sci. Technol. 2010, 42, 750–754.

47. Ochiai, A.; Tanaka, S.; Tanaka, T.; Taniguchi, M. Protein pirinčanih mekinja kao moćan izvor antimelanogenih peptida sa aktivnošću inhibicije tirozinaze. J. Nat. Prod. 2016, 79, 2545–2551. [CrossRef] [PubMed]

48. Kubglomsong, S.; Theerakulkait, C.; Reed, RL; Yang, L.; Maier, CS; Stevens, JF Izolacija i identifikacija inhibicije tirozinaze i peptida koji keliraju bakar iz hidroliziranog albumina dobivenog iz rižinih mekinja. J. Agric. Food Chem. 2018, 66, 8346–8354.[CrossRef]

49. Schurink, M.; van Berkel, WJ; Wichers, H.; Boeriu, CG Novi peptidi sa inhibitornom aktivnošću tirozinaze. Peptides 2007, 28,485–495. [CrossRef]

50. Ishikawa, M.; Kawase, I.; Ishii, F. Kombinacija aminokiselina smanjuje pigmentaciju u B16F0 stanicama melanoma. Biol. Pharm.Bull. 2007, 30, 677–681. [CrossRef] [PubMed]

51. Zhang, R.; Wei, Y.; Li, M.; Cai, M.; Gu, R.; Ma, Y.; Chen, L.; Wang, J. Efekti melanogeneze hidrolizata pirinčanog proteina i njegovih karakterističnih peptida Leu-Leu-Lys, Leu-Pro-Lys i pyroGlu-Lys na ćelije epidermalnih melanocita izazvanih UVB zrakama. FoodFunct. 2020, 11, 8757–8767. [CrossRef]

52. Wang, Y.; Cai, D.; On, M.; Wang, Z.; Qin, P.; Tan, T. Otvorena fermentativna proizvodnja l-mliječne kiseline korištenjem bijelih pirinčanih mekinja istovremenom saharifikacijom i fermentacijom. Bioresour. Technol. 2015, 198, 664–672. [CrossRef] [PubMed]

53. Pan, M.; Jiang, TS; Pan, JL Antioksidativna aktivnost hidrolizata proteina uljane repice. Bioproces hrane. Technol. 2009, 4, 1144–1152.[CrossRef]

54. Chen, HM; Muramoto, K.; Yamauchi, F.; Nokihara, K. Antioksidativna aktivnost dizajniranih peptida na bazi antioksidativnog peptida izolovanog iz digestata sojinog proteina. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2619–2623. [CrossRef]

55. Liu, Q.; Kong, B.; Xiong, YL; Xia, X. Antioksidativna aktivnost i funkcionalna svojstva hidrolizata proteina svinjske plazme pod utjecajem stupnja hidrolize. Food Chem. 2010, 118, 403–410. [CrossRef]

56. Lemes, A.; Sala, L.; Ores, JDC; Braga, ARC; Egea, MB; Fernandes, KF Pregled najnovijih dostignuća u šifriranim bioaktivnim peptidima iz otpada bogatog proteinima. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 950. [CrossRef] [PubMed]

57. Wang, J.-S.; Zhao, M.-M.; Zhao, Q.-Z.; Jiang, Y.-M. Antioksidativna svojstva papain hidrolizata pšeničnog glutena u različitim oksidacionim sistemima. Food Chem. 2007, 101, 1658–1663. [CrossRef]

58. Gao, M.-T.; Kaneko, M.; Hirata, M.; Toorisaka, E.; Hano, T. Korištenje pirinčanih mekinja kao izvora hranjivih tvari za fermentativnu proizvodnju mliječne kiseline. Bioresour. Technol. 2008, 99, 3659–3664. [CrossRef] [PubMed]

59. Huang, WY; Lin, YR; Ho, RF; Liu, HY; Lin, YS Efekti vodenih rastvora na ekstrakciju listova zelenog čaja. Sci. World J. 2013, 2013, 368350. [CrossRef]

60. Wathoni, N.; Shan, CY; Shan, WY; Rostinawati, T.; Indradi, RB; Pratiwi, R.; Muchtaridi, M. Karakterizacija i antioksidativna aktivnost pektina iz kore indonezijskog mangostina (Garcinia mangostana L.). Heliyon 2019, 5, e02299. [CrossRef]

61. Tsai, C.-C.; Chan, C.-F.; Huang, W.-Y.; Lin, J.-S.; Chan, P.; Liu, H.-Y.; Lin, Y.-S. Primjena Lactobacillus rhamnosus SpentCulture supernatanta u kozmetičkoj primjeni antioksidacije, izbjeljivanja i zadržavanja vlage. Molecules 2013, 18, 14161–14171.[CrossRef]

62. Huang, W.-Y.; Lee, P.-C.; Hsu, J.-C.; Lin, Y.-R.; Chen, H.-J.; Lin, Y.-S. Efekti kvaliteta vode na rastvaranje praha ekstrakta Yerba Mate. Sci. World J. 2014, 2014, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

63. Chan, C.-F.; Wu, C.-T.; Huang, W.-Y.; Lin, W.-S.; Wu, H.-W.; Huang, T.-K.; Chang, M.-Y.; Lin, Y.-S. Inhibicija antioksidacije i melanogeneze raznih Dendrobium tosaense ekstrakata. Molecules 2018, 23, 1810. [CrossRef] [PubMed]64. Wu, C.-T.; Agrawal, DC; Huang, W.-Y.; Hsu, H.-C.; Yang, S.-J.; Huang, S.-L.; Lin, Y.-S. Analiza funkcionalnosti istrošenih ekstrakata mljevene kafe dobivenih hidrotermalnom metodom. J. Chem. 2019, 2019, 1–8. [CrossRef]

65. Dorta, E.; Rodríguez-Rodríguez, EM; Jiménez-Quezada, A.; Fuentes-Lemus, E.; Speisky, H.; Lissi, E.; López-Alarcón, C. Upotreba testa kapaciteta apsorpcije radikala kisika (ORAC) za predviđanje kapaciteta nusproizvoda manga (Mangifera indica L.) da inhibiraju oksidaciju bjelančevina mesa. Food Anal. Metode 2016, 10, 330–338. [CrossRef]

66. Lin, Y.-S.; Chen, H.-J.; Huang, J.-P.; Lee, P.-C.; Tsai, C.-R.; Hsu, T.-F.; Huang, W.-Y. Kinetika inhibitorne aktivnosti tirozinaze pomoću ekstrakta lista Vitis vinifera. BioMed Res. Int. 2017, 2017, 5232680. [CrossRef] [PubMed]

67. Bidlingmeyer, BA; Cohen, SA; Tarvin, TL Brza analiza aminokiselina upotrebom derivatizacije prije kolone. J. Chromatogr. BBiomed. Sci. Appl. 1984, 336, 93–104. [CrossRef]

68. Asai, TT; Oikawa, F.; Yoshikawa, K.; Inoue, N.; Sato, K. Kolagen peptidi dobijeni iz hrane, prolil-hidroksiprolin (Pro-Hyp) i hidroksiprolil-glicin (Hyp-Gly) poboljšavaju rast primarno kultivisanog fibroblasta mišje kože koristeći fetalni goveđi serum bez hidroksiprolil peptida. Int. J. Mol. Sci. 2019, 21, 229. [CrossRef]

69. Schägger, H. Tricine–SDS–PAGE. Nat. Protoc. 2006, 1, 16–22. [CrossRef]

70. Diao, J.; Chi, Z.; Guo, Z.; Zhang, L. Hidrolizat proteina zrna Munga modulira imuni odgovor putem NF-kB puta u makrofagama RAW 264.7 stimuliranim lipopolisaharidom. J. Food Sci. 2019, 84, 2652–2657.[CrossRef]