Poboljšanje proteomike moždanog tkiva odozgo prema dolje uz FAIMS, dio 4

Također smo identificirali brojne fragmente izvedene iz nekanonskih spojenih izoforma tauproteina za koje je poznato da se eksprimiraju u ljudskom mozgu.83 Ukratko, tau izoforme su definirane brojem N-terminalnih umetaka zbog alternativnog spajanja egzona 2 i/ili 3 (navedeno na as0N, 1N i 2N) i broj ponavljanja vezivanja mikrotubula zbog alternativnog spajanja eksona 10 (koji se naziva 3R ili 4R).84

Tau protein je važan protein u neuronskim stanicama, koji igra vrlo važnu ulogu u održavanju normalne strukture i funkcije neuronskih stanica. Studije su pokazale da je tau protein usko povezan s pamćenjem, a njegova abnormalna ekspresija može dovesti do kognitivnog pada, pa čak i kognitivnog oštećenja.

Naučnici su uradili mnogo istraživanja o odnosu između tau proteina i pamćenja. Prema istraživanjima, tau protein može pomoći u regulaciji stabilnosti nervnih vlakana, čime se potiče prijenos informacija i formiranje memorije između neuronskih stanica. Međutim, kada je tau protein nenormalan, kao što je nakupljanje proteina, to će dovesti do lomljenja nervnih vlakana i smrti velikog broja neuronskih ćelija, što će uticati na formiranje i održavanje pamćenja, pa čak i dovesti do oštećenja pamćenja. Stoga je održavanje normalne ekspresije i funkcije tau proteina vrlo važno za održavanje zdravlja pamćenja.

Nedavne studije su također otkrile da su hranjive tvari sadržane u nekim namirnicama i pićima također korisne za održavanje normalne funkcije tau proteina. Na primjer, antioksidansi, omega{0}} masne kiseline i povrće i voće bogato kofeinom mogu pomoći u regulaciji ekspresije i funkcije tau proteina, što pomaže poboljšanju pamćenja i kognitivnih funkcija.

Stoga trebamo obratiti pažnju na održavanje dobrih životnih navika, kontrolu prehrane, smanjenje stresa itd., kako bismo održali normalnu ekspresiju i funkciju tau proteina. Istovremeno, održavanje dobrih navika učenja i umjereno vježbanje također mogu pomoći u promicanju prijenosa informacija i formiranja memorije između neuronskih stanica. Vjerujem da sve dok vodimo računa o održavanju zdravog načina života, možemo imati zdravo pamćenje i bolje uživati ​​u životu. To pokazuje da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche tradicionalni kineski medicinski materijal s mnogim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanchea proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite znati 10 načina za poboljšanje pamćenja

Također je vrijedno napomenuti da su endogeni fragmenti tau čest nalaz u ljudskom moždanom tkivu i cerebrospinalnoj tekućini, a diferencijalna fragmentacija taua može igrati ulogu u napredovanju AD.85,86

Uočili smo nekoliko fragmenata koji bi mogli nedvosmisleno razlikovati {{0}}N i 1N tau (slike 10A, S7 i S8). Činjenica da uočavamo visoke spektralne brojeve za 0N (86 PrSM) i 1N (91 PrSM), ali ne primjećujemo nikakve PrSM za 2N, usklađena je s prethodnim kvantitativnim imunoblotingom koji je otkrio da su 0N i 1N dominantni oblici i čine ∼ 91% ukupnog tau, dok je 2N činilo samo ∼9%.87

Što se tiče nedvosmislene dodjele ponavljanja za vezivanje mikrotubula, uočili smo spektre koji se mogu pripisati i 3R (Slike 10A i S9) i 4R tau (Slike 10A i S10).

Štedljivo zaključivanje nam je omogućilo da zaključimo da je braintau uglavnom predstavljen mješavinom 1N3R (Tau-B) praćenih 0N4R (Tau-D) varijantama spajanja, što je u skladu s prethodnim zapažanjima.87,88

Dok su druge izoforme spajanja također imale jedinstvene fragmente, mali broj spektralnih podudaranja (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Iznenađujuće, N-termini fragmenata koji sadrže dominantnu R-domenu nastavak su od C-kraja fragmenata koji sadrže dominantnu N-domenu, ili drugim riječima, čini se da su povezani fragmenti proizvedeni iz mogućeg proteolitičkog cijepanja (koji se naziva lokacija #1 na slici 10A). Nadalje, C-termini proteoforma koji sadrže 3R i 4R domene dijele isto mjesto cijepanja (koji se naziva mjesto #2 na Slici 10A), iako su same sekvence različite zbog varijacije spajanja eksona 10.

Što je još više iznenađujuće, sva ova mjesta cijepanja leže unutar tri dobro opisana heksapeptidna motiva.89–95 Slika 10B pokazuje sve jedinstvene fragmente koje smo identificirali iz naših skupova podataka koji bi mogli biti mapirani na 1N3R tau izoformu, kao i lokaciju cijepanja web stranice.

Mjesto cijepanja #1 nalazi se unutar druge regije tau bogate prolinom, koja dijeli KVAVVR heksapeptidnu sekvencu i pruža jedno od najjačih mjesta vezivanja za mikrotubule (Slika 10B).89–91 Mjesto cijepanja #2 nalazi se unutar 3R i 4R heksapeptidnih motiva VQIVYK i VQIINK, za koje je pokazano da pokreću agregaciju tau (Slika 10B).92–95

Zanimljivo je da mnogi fragmenti, kao što je prikazano na slici 10B, počinju ili završavaju u blizini ova dva mjesta cijepanja. Poznato je da svaki od ovih heksapeptidnih motiva formira strukturu, često u obliku ukosnica koje su u osnovi agregacije uključene u različite neurodegenerativne bolesti.89,93,96 Intrigantno, ova zapažanja naglašavaju mogućnost zajedničkog puta proteolitičke degradacije među tau izoformama koje su sposoban da poremeti njihove agregacijske regije.25,85,86

Konačno, pronašli smo brojna spektralna podudaranja za A koja su se mogla promatrati isključivo korištenjem FAIMS-a.

Ovi A proteoformi, koji tipično zahtijevaju posebne tehnike frakcioniranja ili rukovanja kako bi se poboljšao oporavak zbog svojih hidrofobnih svojstava i svojstava sklonih agregaciji,9,16,97,98 su uočeni netaknuti korištenjem FAIMS u rasponu od -40 do -50 CV.

Ovo uključuje kanonske A 1–42 i A 1–40 (Slike 11A, B, respektivno), kao i nekoliko N-terminalno skraćenih oblika (posebno A 2–42 i A 4–42, slika 11C, D).

Vrijedi napomenuti da je A proteoforme s različitim N- i C-terminalnim cijepanjima izuzetno teško identificirati u analizama odozdo prema gore zbog ekstremne hidrofobnosti triptičkih proizvoda, što naglašava prednost analize intaktnog proteina.

Vjerujemo da FAIMS-TDP metodologija nudi robustan način za postizanje netaknute identifikacije ovih A proteoforma, omogućavajući lako određivanje različitih kombinacija N i C-terminalnih proizvoda cijepanja koji postoje.

ZAKLJUČCI

Opisali smo kako nano-LC separacija reverzne faze proteina koji sadrže proteine ​​koji sadrže veoma složen uzorak, u širokom rasponu mase, može imati koristi od implementacije frakcioniranja gasne faze putem FAIMS-a u kontekstu masene spektrometrije odozgo prema dolje.

Pokazalo se da FAIMS utječe na prijenos proteoforma po veličini i/ili naboju, smanjujući složenost MS1 i omogućavajući veću dubinu pokrivenosti proteoma.

FAIMS na jednom CV-u (-50) omogućio je identifikaciju 1833 ± 17 jedinstvenih proteoforma u prosjeku, više nego dvostruko u poređenju sa bez FAIMS-a (754 ± 35). Dodavanje FAIMS-a nije dovelo do pogoršanja ponovljivosti kvantifikacije i ostalo je blizu 20% RSD, što je uporedivo sa pristupima odozdo prema gore bez oznaka.

Zapaženo je smanjenje CV FAIMS-a kako bi se povećala molekularna masa vrsta jona koje se prenose na instrument (medijan MWof ~5 kDa pri −50 CV naspram ~15 kDa pri −20 CV), a također je uočeno da modulacija CV utječe na prijenos omotač stanja naelektrisanja proteoforme različito.

Također smo definirali optimalne kombinacije CV-a koje bi mogle proizvesti najveći teoretski maksimum proteoforma/gena ili pokrivenost proteomske sekvence. U poređenju sa tri "No FAIMS" skupa podataka, eksterni CV korak na -50, -40 i -30 V mogao bi više nego udvostručiti broj jedinstvenih proteoforma, jedinstvenih gena i pokrivenosti sekvence proteoma.

Također je vrijedno istaći da je naš rad istraživao samo relativno mali raspon životopisa za koji smo smatrali da najbolje odgovara našem TDP pristupu koristeći složeni uzorak. Budući da se FAIMS može lako prilagoditi drugim metodama, MS1 analize niske rezolucije sa Orbitrap analizatorima mogu poboljšati identifikaciju većih proteoforma unutar CV raspona koji smo testirali, kao i iznad -20 V gdje bi se vjerovatno uočile veće proteoforme.

Takođe se može zamisliti da bi buduća instrumentacija analizatora mase koja poboljšava akviziciju većih proteoforma i kompatibilna sa FAIMS-om mogla imati koristi od istraživanja CV-a ispod -20, šireći se u raspon pozitivnog napona.

Naš TDP radni tok nam je omogućio da identifikujemo i karakterišemo jedinstvene proteoforme izvedene iz gena sa poznatom ulogom u neurodegenerativnim bolestima.

Ovo je uključivalo određivanje sastava nepoznatog pomaka mase prisutnog u blizini domena -sinukleina koji veže željezo, koji je korišten za preciziranje lokacija potencijalnih domena za vezivanje željeza u - i sinukleinu. Također je utvrđeno da je PARK7 modificiran sukcinil grupom na njegovom aktivnom mjestu Cys ostatku.

Bili smo u mogućnosti da nedvosmisleno razlikujemo tau fragmente koji odgovaraju 0N, 1N, 3R i 4R izoformama varijanti spajanja pojedinačno i opišemo nova mjesta proteolitičkog cijepanja koja se nalaze unutar ili blizu nekoliko agregacijskih zasijavanja heksapeptiderepeata.

Konačno, FAIMS je omogućio identifikaciju nekoliko intaktnih A proteoforma, uključujući A 1-42 sklon agregaciji, bez potrebe za složenim tehnikama frakcioniranja ili prečišćavanja.

Ukratko, vjerujemo da će dodavanje FAIMS-a za otkrivanje TDP-a pružiti robusnu i reproducibilnu metodu za povećanje proteoma dostupnog za detekciju i karakterizaciju.

Dodatni materijal

Pogledajte web verziju na PubMed Centralu za dodatni materijal.

ZAHVALNICA

Autori se žele zahvaliti Tao Liuu i Richardu Smithu na njihovim savjetima i korisnim raspravama.

Ovaj rad su podržali U01 AG061356 (PLDJ) i R01 AG015819 (DAB). Dio istraživanja obavljen je korištenjem EMSL-a (grid.436923.9), korisničkog centra DOE Office of Science sponzoriranog od strane programa bioloških i ekoloških istraživanja. Grafički apstraktni i slikovni materijali na slici 1 kreirani su pomoću Biorender.com.

REFERENCE

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd-Allah F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Carpenter DO; Carvalho F;Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE; Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Hay SI; Irvani SSN; Jha RP; Jonas JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T; Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Škarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S;Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR; Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Pond CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A; Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahraian MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; Venketasubramanian N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Globalno, regionalno i nacionalno opterećenje Alchajmerove bolesti i drugih demencija, 1990–2016: sistematska analiza za Globalnu studiju o teretu bolesti 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Masters CL Amiloidni prekursorski protein (APP) i beta A4 amiloid u etiologiji Alchajmerove bolesti: odnosi prekursora i proizvoda u poremećaju funkcije neurona. Pathol mozga. 1991, 1, 241–251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alchajmerova bolest: hipoteza amiloidne kaskade. Science 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Goedert M. Tau protein i neurofibrilarna patologija Alchajmerove bolesti. Trends Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau i neurodegenerativna bolest: priča do sada. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Tri dimenzije amiloidne hipoteze: vrijeme, prostor i 'krilci'. Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Takeda S. Tau propagacija kao dijagnostička i terapijska meta za demenciju: potencijali i pitanja bez odgovora. Front. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Proteomika odozgo prema dolje u zdravlju i bolesti: izazovi i mogućnosti. Proteomika 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrova AE; Kononikhin AS; Indeykina, Autori izjavljuju da nema konkurentnog finansijskog interesa. MI; Popov IA; Nikolaev EN Masovna spektrometrijska analiza raznolikosti Abeta peptida: poteškoće i buduće perspektive za otkrivanje AD biomarkera. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Masena spektrometrija je višestruko oružje koje se koristi u borbi protiv Alchajmerove bolesti: amiloidni beta peptidi i dalje. Mass Spectrom. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andreev VP; Petyuk VA; Brewer HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Kamp D; Smith RD;Lieberman AP; Albin RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ kvantitativna LC-MS proteomika Alchajmerove bolesti i normalno ostarjelog ljudskog mozga bez oznaka. J. Proteome Res. 2012, 11,3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Gearing M; Wang PG; Chin LS; Li L. Integrisana proteomika i analiza mreže identifikuju čvorišta proteina i promene mreže u Alchajmerovoj bolesti. ActaNeuropathol. Commun. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com