Empagliflozin ublažava simptome dijabetesa i bubrežne tubularne disfunkcije kod pacovog modela dijabetesa s uvećanim bubrezima (DEK)
Mar 20, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Ayaka Domon1, Kentaro KatayamaID1, Touko Sato2, Yuki Tochigi1, Hiroyuki Tazaki2, Hiroetsu SuzukiID1*
Abstract
Pozadina: Inhibitori kotransportera natrijum-glukoze 2 (SGLT2) se široko koriste za smanjenje hiperglikemije. Ova studija je istraživala efekte inhibitora SGLT2, empagliflozina, na hiperglikemiju u novom modelu pacova dijabetesa tipa 2 bez gojaznosti sa uvećanimbubrezi(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >300 mg/dl su klasifikovani kao nedijabetičari i dijabetičari, respektivno. Grupe pacova bez dijabetesa (kontrola) i dijabetičara (DM-cont) hranjene su standardnom hranom 12 sedmica, dok je druga grupa dijabetičkih (DM-empa) pacova hranjena standardnom hranom koja je sadržavala empagliflozin (300 mg/kg/dan) tokom 12 sedmica. . Mjereni su glukoza u krvi, tjelesna težina, tolerancija na glukozu, unos hrane i vode, volumen urina, biokemijski parametri plazme i urina, te mineralna gustina kostiju i njihovabubrezii pankreas su histološki analizirani. Rezultati: Tretman empagliflozinom smanjio je koncentraciju glukoze u krvi i unos hrane kod dijabetičkih štakora, ali je inhibirao gubitak adepsa i dovelo do povećanja tjelesne težine. Empagliflozin je ublažio poliuriju i polidipsiju, ali je povećao koncentraciju ukupnog holesterola, natrijuma i ukupnih proteina u plazmi do normalnog nivoa. Empagliflozin je također značajno smanjio izlučivanje proteina i elektrolita urinom i vratio mineralnu gustoću kostiju i koncentraciju valina i izoleucina u plazmi na normalne razine. Štaviše, proširenje bubrežnih tubula ibubregproširenje nije bilo oslabljeno u DM-empa grupi. Zaključak: Odgovor DEK pacova na empagliflozin se razlikovao od odgovora drugih dijabetičkih životinjskih modela, što sugerira da DEK pacovi imaju jedinstvene karakteristike za proučavanje i procjenu višestrukih bioloških efekata inhibitora SGLT2. Ovi nalazi su također pokazali da empagliflozin može poboljšati sistemski metabolizam i poboljšati gabubrežnifunkcija tubula udijabetičaruslovima.
Cistanche tubulosa sprečavabubregbolesti, kliknite ovdje da dobijete uzorak
Uvod
Širom svijeta prevalencija dijabetes melitusa (DM) nastavlja da raste, a procjenjuje se da će broj pacijenata dostići 700 miliona do 2045. godine [1]. Oko 90-95 posto ovih pacijenata ima DM tipa 2, koji se odlikuje progresivnim smanjenjem lučenja inzulina sa ili bez insulinske rezistencije [2] i glavni je faktor rizika za bubrežne i kardiovaskularne bolesti [3]. DM tipa 2 je vodeći uzrok završnog stadijuma zatajenja bubrega (ESRD), s dijabetičkom nefropatijom, koja se također naziva dijabetičkabubregbolesti, koje su odgovorne za ESRD kod 20-40 posto ovih pacijenata [4]. Pacijentima sa ESRD-om je potrebna dijaliza ili transplantacija bubrega da bi se održali u normalnom stanjufunkciju bubrega. Ovi postupci opterećuju društva i pojedince, kao i utiču na kvalitet života pacijenata [5]. Stoga su potrebni napori da se spriječi ili ublaži DM i dijabetička nefropatija [6].
Inhibitori natrijum-glukoznog kotransportera 2 (SGLT2) su nova klasa antidijabetičkih lekova koji deluju nezavisno od endogenog insulina [7]. SGLT2 inhibitori smanjuju koncentraciju glukoze u krvi inhibirajući reapsorpciju glukoze u proksimalnim bubrežnim tubulima [7]. Inhibitori SGLT2 takođe imaju blagotvorne efekte na bubrežne i kardiovaskularne komplikacije DM [8–10], kao i na poboljšanje metabolizma [11], pri čemu su svi delimično nezavisni od njihovih efekata na snižavanje glukoze. Nadalje, inhibitori SGLT2 poboljšavaju bubrežne ishode kod pacijenata bez DM sa kroničnim stanjembubregbolesti [12]. Međutim, efekti inhibitora SGLT2, uključujući bubrežne ishode, variraju među pacijentima [13]. Ove varijacije vjerovatno odražavaju razlike u više faktora, uključujući genetsku predispoziciju, metabolički status, hemodinamiku i način života.
Nedavno smo ustanovili novi soj pacova bez gojaznosti tipa 2 DM sa uvećanimbubreg(DEK) iz LEA. PET-pet kongeni soj. Kod DEK soja, oko 50 posto muškaraca pokazuje dijabetes do 30. sedmice starosti. Ovi dijabetički štakori su pokazali progresivno smanjenje koncentracije inzulina u plazmi zbog gubitka stanica gušterače, povećanog bubrežnog parenhima i značajnog povećanjabubrezisa proširenjem bubrežnih tubula [14]. DEK pacovi su takođe pokazali smanjenje koncentracije ukupnog holesterola (TCHO), ukupnog proteina i albumina u plazmi [14]. Ove histološke i metaboličke karakteristike su jedinstvene za DEK pacove, što razlikuje ovaj model od drugih životinjskih modela dijabetesa i sugerira da bi DEK štakori mogli biti korisni za proučavanje farmakoloških učinaka antidijabetičkih lijekova nabubrezii metabolizam. Ova studija je stoga procijenila efekte inhibitora SGLT2, empagliflozina na bubrege i sistemski metabolizam DEK pacova.
Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >300 mg/dl je klasifikovano kao nedijabetičare i dijabetičare, respektivno [14]. Svi pacovi su održavani u konvencionalnim uslovima, uključujući ciklus svetlosti: tama od 14:10 h, sobnu temperaturu od 20 ±2˚C i relativnu vlažnost od 50±10 procenata. Sve studije na životinjama odobrene su od strane Komiteta za njegu i upotrebu životinja Nippon Veterinary and Life Science University i izvedene su u skladu sa smjernicama Komiteta za njegu i upotrebu životinja NipponVeterinary and Life Science University.
Male rats with blood glucose concentrations >300 mg/dl u dobi od 15-20 sedmica u DEK soju nasumično je podijeljeno u grupu dijeta empagliflozin (DM-empa) (n=5) i grupu standardne dijete (DM-cont) (n {{6} }) u roku od 2-3 sedmice nakon razvoja DM. Mužjaci pacova bez DM (nivo glukoze u krvi je još uvijek bio niži od 300 mg/dl u dobi od 30 sedmica) u DEK soju definirani su kao kontrola (n=12). Kontrolne i DM-cont grupe su imale ad libitum pristup vodi i standardnoj ishrani (CR-LPF, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio. Japan) 12 sedmica, dok su štakori u DM-empa grupi imali ad libitum pristup vodi i standardna dijeta plus empagliflozin (300 mg/kg; Eli Lilly Japan; Kobe, Japan). Doza empagliflozina je dizajnirana u skladu s prethodnim izvještajima [15, 16]. Koncentracije glukoze u krvi bez natašte, tjelesna težina i unos hrane mjerene su sedmično. Svi pacovi su žrtvovani nakon 12 sedmica i njihovibubregPrikupljeni su uzorci pankreasa i krvi. Postavili smo humane krajnje tačke za sve životinje koje su smanjile 25 posto tjelesne težine ili su pokazale simptome povezane s teškom bolešću. Međutim, u ovoj studiji nije bilo pacova koji su pokazali tako ozbiljno smanjenje tjelesne težine i lošeg stanja.
Oralni test tolerancije glukoze (OGTT)
Oralni testovi tolerancije glukoze (OGTT) su obavljeni dan nakon 12 sedmičnog perioda liječenja, kako je opisano [14]. Ukratko, pacovi su gladni 16 sati i oralno im je davana 2 g/kg tjelesne težine (BW) glukoze. Krv je uzeta iz repne vene, a koncentracije glukoze su mjerene 0, 30, 60, 120, 180 i 240 minuta nakon punjenja glukozom. Uzorci krvi su takođe sakupljeni iz jugularne vene pod anestezijom izofluranom koju kontroliše anestetizer za male životinje (TK-7, Biomachinery, Chiba, Japan) na 0, 30 i 60 minuta nakon punjenja glukozom, pomešani sa heparinom i centrifugirani 15 min na 4˚C da se dobije plazma. Koncentracije inzulina u plazmi mjerene su korištenjem LBIS inzulinskog ELISA kompleta (RTU) (Shibayagi, Gunma, Japan).
Mjerenje bubrežnih parametara
Tokom 12. sedmice, pacovi su bili smješteni pojedinačno u metaboličke kaveze 24 h, a mjereni su volumen urina i zapremina vode za piće [14]. Koncentracije kreatinina (Cre), azota uree (UN), kalcijuma (Ca), Na-K-Cl i glukoze (Glu) u urinu mjerene su pomoću Dri Chem 3500V (FUJIFILM, Tokio, Japan). Koncentracije proteina u urinu mjerene su pomoću Protein Assay Rapid Kit Wako II (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Tokio, Japan). Krv je sakupljena iz kaudalne šuplje vene pod anestezijom izofluranom, a plazmatske koncentracije UN, albumina (Alb), ukupnog proteina (TP), ukupnog holesterola (Tcho), Ca i Na K-Cl mjerene su pomoću Dri-Chem 3500V. Koncentracija Cre u plazmi je mjerena korištenjem FUJIFILM VET Systems Co., Ltd. (Tokio, Japan). Klirensi kreatinina (Ccre), glukoze (Cglu), kalcijuma (Cca), natrijuma (Can), kalijuma (Ck) i hlora (Ccl) su izračunati pomoću formule:
Klirens (Cx) (ml/min/kg)=[koncentracija urina (mg/dl ili mEq/l) × zapremina urina (ml/min)] / koncentracija u plazmi (mg/dl ili mEq/l) / tjelesna težina (kg).
Frakciono izlučivanje glukoze (FEglu), kalcijuma (FEca), natrijuma (FEna), kalija (FEk) i hlora (FEcl) izračunato je pomoću formule:
Izlučivanje frakcije (FEx) ( posto )=Cx (ml/min/kg) / Ccre (ml/min/kg) × 100.
Koncentracija vezivanja masnih kiselina u jetri (L-FABP) u urinu mjerena je pomoću kompleta za miš/pacov FABP1/L-FABP (R&D Systems, Inc., MN, SAD)
Histologija, imunofluorescencija i proračun inzulinsko pozitivnog područja
Životinje su eutanazirane predoziranjem pentobarbital natrijuma nakon 12 sedmičnog perioda liječenja. Thebubrezii pankreas je uklonjen sa svakog eutanaziranog štakora i izvagan. Uzorci tkiva su fiksirani sa 4 procenta paraformaldehida u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS), ugrađeni u parafin prema standardnim procedurama, i isečeni na 1 μm ili 4 μm debljine za periodično kiselinsko-Schiff (PAS) i imunofluorescentno bojenje. Bubrežna tubularna dilatacija je ocijenjena kao što je prethodno opisano [17]. Bodovano je deset nasumičnih nepreklapajućih 40 x uvećanih polja korteksa bubrega i jukstamedularnog područja. Tubularna dilatacija je ocijenjena na skali {{10}}-3, pri čemu 0, 1, 2 i 3 označavaju 0,<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >10 sekcija otočića po štakoru korištenjem softvera Image J, i izračunat je postotak inzulinsko-pozitivne površine po površini otočića.
Koštana denzitometrijska analiza femura
Bedrene kosti su izrezane od četiri eutanazirane ne-DM kontrole, tri DM-cont i tri DM-empa štakora nakon 12 sedmičnog perioda tretmana i skenirane mikro-CT sistemom (Latheta LCT-100, Aloka, Tokio, Japan) . Mineralna gustina kostiju (BMD, mg/cm3) i mineralni sadržaj kosti (BMC, mg) izračunati su pomoću Latheta softvera.
Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) analiza aminokiselina u plazmi
Uzorci plazme su dobijeni od 30-nedjeljnih kontrolnih pacova i od 27-32 sedmice starih DM cont i DM-empa pacova nakon 12-nedeljnog perioda tretmana. Uzorci plazme tretirani su Phenomenex EZ: kompletom za brzu AA analizu (Phenomenex, Torrance, CA), sa norvalinom koji je korišten kao interni standard [18]. Za GC-MS analizu korišteni su GCMS-QP2010Plus i softver rješenja GCMS (Shimadzu, Kyoto, Japan) [19].
Statistička analiza
Rezultati, predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna greška (SE), upoređeni su u dvije grupe dvostranim studentskim t-testom iu više grupa Tukey-Kramer testovima. P-vrijednost < 0.05="" se="" smatra="" statistički="">
Rezultati
Opća stanja povezana s dijabetesom
Sedmična mjerenja unosa hrane su pokazala da je procijenjeni prosječni dnevni unos hrane bio nešto veći u DM-cont nego u DM-empa grupi (36,9±1,5 g naspram 34,3±1.0 g). Procijenjena dnevna doza empagliflozina u grupi koja je primala DM-empa bila je 23,7±0,7 mg/kg tjelesne težine (BW). Empagliflozin je dramatično smanjio koncentraciju glukoze u krvi dan nakon početka liječenja, sa 404,6±36,3 mg/dl na 143,8±14,6 mg/dl), pri čemu je glukoza u krvi u DM-empa grupi bila značajno niža nego u DM -nastavak grupe tokom 12-nedeljnog perioda tretmana (slika 1A). Ovaj nivo u DM-empi je ličio na normalnu kontrolu sa normalnom prehranom (147.{{40}}±1,2 mg/dl) [14]. BW se postepeno povećavao s godinama u DM-empa grupi, ali ne i u DM-cont grupi (slika 1B), pri čemu je konačna TM nakon 12 sedmica iznosila 444,6±18,0 g u DM empa i 372,3±26,4 g u DM- cont group. U istoj dobi, tjelesna težina kontrolne skupine iznosila je približno 533,4±9,8 g [14]. U skladu s povećanjem tjelesne težine, uzde adepsa (1,4±0,2 g) su ostale u DM-empa, ali ne i u DM-cont grupi.
Ranije je pokazano da oboljeli DEK štakori pokazuju ozbiljnu intoleranciju na glukozu, nema lučenja inzulina kao odgovor na opterećenje glukozom i gubitak stanica [14]. Ispitivali smo da li empagliflozin poboljšava toleranciju glukoze i lučenje inzulina te sprječava gubitak stanica. Nivo glukoze u krvi nakon 16 sati gladovanja bio je značajno niži u DM-empa grupi nego u DMcont grupi, kao i nivo glukoze u krvi 60-240 minuta nakon punjenja glukozom (slika 1C). Vremenski zavisna promjena glukoze u krvi u OGTT DM-empa gotovo je ličila na onu kod nedijabetičkih kontrolnih pacova DEK soja [14]. Međutim, sekrecija inzulina izazvana glukozom nije se pojavila ni u jednoj grupi (slika 1D). Imunofluorescentno bojenje inzulina u otočićima pankreasa pokazalo je da nema ili slabe inzulinske signale u DM-cont grupi i gotovo 100 posto pozitivne signale kod kontrolnih pacova, dok je slab signal inzulina, koji čini 24,2 ± 3,5 posto po površini otočića, uočen kod tri štakora u grupi. DM-empa grupa (slika 2).
Metabolički i bubrežni parametri i koštana denzitometrija
Mjerenja metaboličkih parametara nakon 12 sedmičnog perioda liječenja pokazala su da je unos hrane bio značajno niži u DM-empa grupi nego u DM-cont grupi u relativnim (slika 3A) i apsolutnim (S1 slika) vrijednostima. Osim toga, unos vode (Slika 3B, S1 Slika) i volumen urina (Slika 3C, S1 Slika) bio je oko 50 posto manji u DM-empa grupi nego u DM-cont grupi.
Na kraju 12-nedeljnog perioda lečenja, koncentracije Tcho, Cre, Alb, TP i Na u plazmi bile su značajno niže u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, sa većinom ovih smanjenja u DM-cont grupa koja pokazuje djelomični oporavak u DM-empa grupi. Konkretno, koncentracije Tcho, TP i Na u plazmi bile su značajno veće u DM-empa nego u DM-cont grupi, iako su sve ove koncentracije bile niže u DM-empa nego u kontrolnoj grupi. Nivoi Alb i Cre u plazmi su takođe bili viši u DM-empa nego u DM-cont grupi, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 1). Izlučivanje glukoze, UN, Ca, Na, K, Cl i proteina u urinu bilo je značajno veće u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, pri čemu je većina ovih povećanja ublažena u DM-empa grupi. Konkretno, izlučivanje Glu, UN, Na, K i Cl u urinu bilo je značajno niže u DM-empa nego u DM-cont grupi, iako su sve ove ekskrecije bile značajno veće u DM-empa nego u kontrolnoj grupi. . Povećano izlučivanje Ca i proteina u urinu također je ublaženo u DM-empa grupi, bez značajne razlike između DM-empa i kontrolne grupe (Tabela 2). Osim Ccre, koji se nije značajno razlikovao među tri grupe, svi ispitivani klirensi i frakcione ekskrecije bili su značajno veći u DM-cont nego u kontrolnoj grupi (Tabela 3). Štaviše, osim za Cglu i FEglu, koji su ostali viši u DM-empa grupi, većina tih povećanja u DM-cont grupi je ublažena u DM-empa grupi. Konkretno, Cca, Cna i Ccl su bili značajno niži u DM-empa nego u DM-cont grupi, ali su ostali viši u DM-empa nego u kontrolnoj grupi (Tabela 3).
BMD femura bio je značajno niži u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, pri čemu je utvrđeno da empagliflozin obnavlja BMD femura u DM-empa grupi (Tabela 4). BMC je imao tendenciju da bude viši u DM-empa nego u DM-cont grupi, ali razlika nije bila statistički značajna (Tabela 4)
Patologija bubrega
Pogođeni DEK štakori su pokazali progresivno povećanje bubrega sa proširenim tubulima [14]. Iako je liječenje empagliflozinom dramatično smanjilo razinu glukoze u krvi, nije se smanjilo
težina bubrega, koja je bila slična u grupama DM-empa i DM-cont (2,35±0.08 g naspram 2,24 ±0,08 g). Histološki pregled je pokazao da je izražena teška dilatacija u bubrežnim tubulima jukstamedularnih regija i kod DM-cont i DM-empa pacova (slika 4A). Empagliflozin nije ublažio dilataciju u bubrežnim tubulima (slike 4B i 4C). U skladu s tim, izlučivanje L-FABP, biomarkera bubrežne tubularne ozljede [20], u urinu je bilo veće u DM-cont i DM-empa u odnosu na kontrolu, a nije bilo razlike između DM-cont i DM-empa ( slike 4D i 4E). Kao što je ranije objavljeno [14], nije bilo tipičnih glomerularnih lezija kao što je hipertrofija u kontroli, DM-cont i DM-empa (slika 4F).
GC-MS analiza aminokiselina u plazmi
Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.
Sarkozin u plazmi je imao tendenciju da bude viši u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, pri čemu je empagliflozin dalje povećavao sarkozin u plazmi. Nasuprot tome, triptofan u plazmi je imao tendenciju da bude niži u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, s tim da je empagliflozin dalje smanjivao triptofan u plazmi (Tabela 5). Nivoi glicina u plazmi bili su slični u DM-cont i kontrolnoj grupi, ali su bili značajno viši u DM-empa nego u druge dvije grupe. Koncentracije glutamina i ornitina bile su značajno niže u DM-cont nego u kontrolnoj grupi i nisu bile obnovljene liječenjem empagliflozinom. U poređenju sa kontrolnom grupom, plazma -aminomaslačna kiselina je bila značajno niža u DM-cont grupi, pri čemu je empagliflozin dodatno smanjivao njegovu koncentraciju. Koncentracije valina i izoleucina u plazmi bile su značajno veće u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, pri čemu su te koncentracije vraćene na kontrolnu razinu liječenjem empagliflozinom.
Diskusija
Inhibitori SGLT2 smanjuju nivo glukoze u krvi na inzulinski nezavisan način i pokazuju renoprotektivne efekte kod pacijenata sa DM tipa 2, kao i na nekoliko životinjskih modela [8, 12, 21–23]. Većina studija na životinjama sa SGLT2 inhibitorima sprovedena je na gojaznim životinjama sa DM tipa 2 [22, 24–28]. Međutim, mnogi pacijenti sa DM tipa 2, posebno u Aziji, nisu gojazni [29]. Efekti SGLT2 inhibitora na pacijente sa bubrežnim lezijama ili dijabetesom bez gojaznosti ostaju nejasni [29, 30]. Ova studija je istraživala efekte empagliflozina na metabolizam, funkciju bubrega i histopatologiju kod DEK pacova, novog modela dijabetičkog štakora bez gojaznosti sa predispozicijom za povećanje bubrega [14]. U poređenju sa dijabetičkim životinjskim modelima s gojaznošću, fenotip dijabetičkih DEK štakora karakterizirao je progresivno smanjenje koncentracije inzulina u plazmi zbog gubitka stanica gušterače, a ne inzulinske rezistencije, tako da su dijabetički DEK štakori pokazali smanjenje tjelesne težine i masti s progresija DM. Pored toga, dijabetički DEK pacovi su pokazali povećan bubrežni parenhim i značajno povećanje bubrega sa proširenjem bubrežnih tubula [14].
SGLT2 inhibitori potiču korištenje masti, mišića i aminokiselina kao izvora energije [31-33], smanjujući masnu masu i tjelesnu masu kod gojaznih ljudi i životinja [28, 34, 35]. Gubitak masne mase i smanjenje debljanja također su primijećeni kod ne-gojaznih dijabetičkih glodara koji su liječeni inhibitorima SGLT2 [31]. Osim toga, i ljudi i glodari liječeni inhibitorima SGLT2 pokazali su kompenzatornu hiperfagiju kako bi održali ravnotežu energije i nutrijenata [27, 32, 36]. U ovoj studiji, liječenje empagliflozinom snizilo je nivoe glukoze u krvi DEK pacova u roku od 24 sata, pri čemu su se ove niže koncentracije održavale tokom 12-nedjeljnog perioda liječenja, slično drugim studijama inhibitora SGLT2 [15, 24]. Za razliku od prethodnih nalaza [27, 28, 36], otkrili smo da liječenje empagliflozinom smanjuje unos hrane i smanjuje gubitak adepsa i inhibiciju povećanja tjelesne mase. Ovaj neočekivani rezultat je vjerovatno bio povezan s poboljšanjem energetskog bilansa. U početku je izlučivanje glukoze u urinu bilo značajno niže kod DM-empa nego kod DM-cont štakora, iako je značajno veći Cglu u DM empa grupi rezultat potpune inhibicije reapsorpcije glukoze, pri čemu je FEglu bio skoro 100 posto. Ovaj nalaz je dodatno podržan značajnim smanjenjem izlučivanja UN urinom, parametra katabolizma proteina, uprkos normalnom nivou BUN, u DM-empa grupi [37]. Pored toga, povećanje TP u plazmi i smanjenje proteina u urinu u grupi koja je primala DM-empa ukazuje na to da empagliflozin poboljšava zadržavanje proteina. Zadržavanje i korištenje glukoze i vraćanje iz kataboličkog u asimilirano stanje kod pacova liječenih empagliflozinom možda su posljedica njegove uspješne kontrole nivoa glukoze u krvi.
Pokazalo se da inhibitori SGLT2 povećavaju volumen urina, uz povećanje tubularne reapsorpcije koja nadoknađuje gubitak tjelesnih tekućina i elektrolita [21, 25, 38]. Stoga se volumen urina povećava odmah nakon početka liječenja inhibitorom SGLT2, ali dugotrajno liječenje može smanjiti i volumen urina i unos vode [38, 39]. Iako je nivo Cre u plazmi bio značajno niži u DM-cont i DM-empa nego u kontrolnoj grupi, Ccre se nije značajno razlikovao među kontrolnom, DM-cont i DM-empa grupama. Stoga, budući da nije bilo očiglednih dokaza o glomerularnoj hipertrofiji kod DEK-DM štakora [14], glomerularna hiperfiltracija se jedva pojavila ili je bila blaga u DM-cont. Osim toga, uvećani bubreg sa povećanim parenhimom mogao bi imati povećan broj nefrona, što ukazuje da bi uvećani bubreg u DM-cont i DM-empa mogao biti povezan sa smanjenim razinama Cre u plazmi. Stoga je smanjeni volumen urina u DM-empa grupi mogao biti rezultat poboljšanja reapsorpcije vode u bubrežnim tubulima, a ne smanjene brzine glomerularne filtracije. Sveukupno, povećano izlučivanje elektrolita u urinu u DM-cont grupi je oslabljeno u DM empa grupi, što ukazuje da su smanjene koncentracije elektrolita u plazmi u DM-cont grupi bile oslabljene liječenjem empagliflozinom kroz poboljšanje bubrežne tubularne funkcije. Ova hipoteza je podržana konzistentnim smanjenjem njihovog klirensa sa smanjenim izlučivanjem frakcija u DM-empa grupi.
Prijavljeno je da inhibitori SGLT2 imaju štetne efekte na kosti [31, 40]. Budući da je osteoporoza česta komplikacija DM, uporedili smo BMD i BMC u tri grupe pacova. BMD i BMC su bili značajno niži u DM-cont nego u kontrolnoj grupi, ali su ova smanjenja bila oslabljena u DM-empa grupi. Štaviše, ova povećanja BMD i BMC u DM-empa grupi su bila praćena smanjenjem izlučivanja Ca u urinu. Pošto su nivoi Ca u plazmi strogo regulisani, nije bilo značajnih razlika u nivoima Ca u plazmi između kontrolne, DM-cont i DM-empa grupa. Ovi nalazi sugeriraju da negativan bilans Ca u DM-cont grupi može biti nadoknađen mobilizacijom a iz kosti u cirkulaciju, s tim da je ovo stanje djelimično oslabljeno poboljšanom bubrežnom tubularnom funkcijom Ca u DM-empa grupi.
Slabljenje hipoproteinemije u grupi koja je primala DM-empa može biti rezultat poboljšanja proteinurije. Iako glomerularna hiperfiltracija i hipertrofija nisu bile jasno izražene u DM-cont grupi, smanjena razina glukoze u krvi može smanjiti glomerularnu filtraciju Alb. Osim toga, poboljšanja tubularne reapsorpcije proteina i aminokiselina mogu doprinijeti sintezi proteina plazme u jetri. Zahvaćene DEK pacove karakteriziraju niske koncentracije Tcho u plazmi [14]. Budući da je povećana proizvodnja Alb praćena povećanom proizvodnjom Tcho u jetri [41], viši nivoi Tcho u plazmi u DM-empa grupi mogu biti povezani sa povećanom proizvodnjom Alb u jetri. Potonje je moglo biti rezultat povećanih zaliha aminokiselina i energije povezanih s poboljšanjima u zadržavanju proteina i energetskoj ravnoteži.
Homeostaza aminokiselina razgranatog lanca (BCAA) je u velikoj mjeri određena BCAA kataboličkom aktivnošću u tkivima [42], pri čemu se defekti u homeostazi BCAA smatraju indeksom insulinske rezistencije ili dijabetičkog stanja [43–45]. Naša GC-MS analiza aminokiselina pokazala je da su koncentracije valina i izoleucina u plazmi kod DM-empa pacova bile jednake onima kod kontrolnih pacova bez dijabetesa, što sugerira da je liječenje empagliflozinom poboljšalo katabolizam proteina i dijabetička stanja. Osim toga, primijetili smo da je povećanje nivoa glicina u plazmi specifično za empagliflozin povezano s poboljšanjem dijabetesa. Zanimljivo je da je nizak nivo glicina u plazmi uočen kod dijabetesa kod ljudi [46], a utvrđeno je da primjena glicina inducira antioksidativne i renoprotektivne efekte kod pacova sa dijabetesom izazvanim streptozotocinom [47]. Viši nivoi glicina u plazmi stoga mogu biti povezani sa smanjenjem oksidativnog stresa i dijabetičke nefropatije kod dijabetičara i eksperimentalnih životinja liječenih empagliflozinom. Nivoi aminokiselina u plazmi su pod uticajem njihove upotrebe u tkivima i organima u celom telu i zavise od anaboličkih i kataboličkih uslova. Potrebne su daljnje studije kako bi se utvrdilo kako su promjene nivoa ovih i drugih aminokiselina povezane s metaboličkim stanjem.
SGLT2 inhibitori ispoljavaju renoprotektivne efekte tako što potiskuju nekoliko procesa povezanih sa bubrežnim oboljenjima, kao što su albuminurija i povećana težina bubrega [15, 24, 48, 49]. Dilatacija bubrežnih tubula i proteinurija su markeri oštećenja bubrega povezanih s dijabetesom [50]. Međutim, empagliflozin nije bio u stanju suzbiti proširenje bubrežnih tubula i povećano izlučivanje L-FABP urinom u našem modelu štakora, ali je značajno poboljšao tubularnu funkciju. Ova neslaganja sugerira da je poboljšanje tubularne funkcije povezano s empagliflozinom rezultat manjih ili sekundarnih efekata koji nisu praćeni organskim promjenama u bubrežnim tubulima. Alternativno, budući da su tubularna dilatacija sa ozljedom i povećana težina bubrega održavani u normoglikemijskim uvjetima kod oboljelih DEK pacova, ove promjene mogu biti genetske osobine povezane s dijabetesom kod DEK pacova, a ne sekundarne hiperglikemije.
Iako inhibitori SGLT2 ciljaju na bubrežne tubule, malo se zna o efektima ovih agenasa na ukupne promjene u funkciji bubrežnih tubula, osim da glomerularna hipertrofija uključuje tubularni kotransport natrijuma s glukozom [13, 22, 24]. Studije o efektima inhibitora SGLT2 na tubularne funkcije pokazale su da reapsorpcija vode nije samo potisnuta osmotskom diurezom, već je pojačana regulacijom transportera akvaporina i uree pomoću još neutvrđenog mehanizma [21, 25]. Na bubrežne tubularne epitelne ćelije pacijenata sa dijabetesom utiče ne samo osmotski pritisak glukoze prisutne u tubularnoj tečnosti, već i višak glukoze i natrijuma koji se unose u ćelije preko SGLT2. Nedavno se smatra da je oksidativni stres u bubrežnim tubulima važan za napredovanje dijabetičke nefropatije (DN), a ipragliflozin je pokazao renoprotektivne efekte sprečavanjem prekomerne proizvodnje ROS u bubrežnim tubulima [51]. Iako nije pronađeno ozbiljno napredovanje DN kod oboljelih DEK štakora, oksidativni stres može narušiti tubularnu funkciju. Trenutno ne postoji jedinstveni konsenzus o efektima inhibitora SGLT2 na tubulnu funkciju, što ukazuje na potrebu za daljim studijama kako bi se razjasnio mehanizam kojim empagliflozin poboljšava tubularnu funkciju kod DEK pacova.
Utvrđeno je da inhibitori SGLT2 čuvaju ćelijsku masu kod modela DM tipa 1 i gojaznih modela DM tipa 2 [52, 53]. Otkrili smo ćelije sa slabim insulinskim signalima u DM-empa grupi, ali bez ćelija u DM-cont grupi. Međutim, OGTT je pokazao umjerena poboljšanja u toleranciji glukoze bez lučenja inzulina u DM-empa grupi. Budući da empagliflozin ima kratko poluvrijeme od oko 8 sati, smanjene razine glukoze u krvi uočene nakon 16-satnog gladovanja i poboljšanje tolerancije glukoze nisu posljedica djelovanja ostatka empagliflozina. Ovi nalazi, stoga, sugeriraju da bi dugotrajna primjena empagliflozina mogla poboljšati metabolizam glukoze i umjereno smanjiti razinu glukoze u krvi nakon jednokratnog punjenja glukozom na način neovisno o inzulinu.
Zaključno, rezultati ove studije pokazuju da empagliflozin poboljšava sistemski metabolizam i funkciju bubrežnih tubula kod DEK pacova, iako detaljni mehanizmi koji leže u osnovi jedinstvenog odgovora ovih životinja na empagliflozin ostaju nejasni. Ovi nalazi također ukazuju da su DEK pacovi koristan model za proučavanje i procjenu višestrukih bioloških efekata inhibitora SGLT2 kod dijabetesa.
Reference
1. Međunarodna federacija za dijabetes. IDF Diabetes Atlas 9. izdanje. Brisel, Belgija 2019.
2. Američko udruženje za dijabetes. Klasifikacija i dijagnoza dijabetesa. Odjeljak 2. Standardi medicinske njege kod dijabetesa-2019. Diabetes Care. 2019; 42 (Suppl 1): S13–S28.
3. Zheng Y, Ley SH, Hu FB. Globalna etiologija i epidemiologija dijabetesa melitusa tipa 2 i njegovih komplikacija. Nat Rev Endocrinol. 2018; 14(2):88–98.
4. Lin CC, Li CI, Liu CS, Lin WY, Lin CH, Yang SY, et al. Razvoj i validacija modela predviđanja rizika za završnu bubrežnu bolest kod pacijenata sa dijabetesom tipa 2. Sci Rep. 2017; 7(1):10177.
5.Valderra´bano F, Jofre R, Lo´pez-Go´mez JM. Kvaliteta života pacijenata u završnoj fazi bolesti bubrega. Am J Kidney Dis. 2001; 38(3):443–64.
6. Dvorana PM. Prevencija progresije dijabetičke nefropatije. Diabetes Spectr. 2006; 19(1): 18–24.
7. Hsia DS, Grove O, Cefalu WT. Ažuriranje o inhibitorima kotransportera natrijum-glukoze-2 za liječenje dijabetes melitusa. Curr Opin Endocrinol Diabetes Gojaznost. 2017; 24(1):73–79.
8. Perković V, Jardine MJ, Neal B, Bompoint S, Heerspink HJL, Charytan DM, et al. Kanagliflozin i renalni ishodi kod dijabetesa tipa 2 i nefropatije. N Engl J Med. 2019; 380(24):2295–2306.
9. Sarafidis PA, Tapas A. Empagliflozin, kardiovaskularni ishodi i mortalitet kod dijabetesa tipa 2. N Engl J Med. 2016; 374(11):1092.
10. Wiviott SD, Raz I, Bonaca MP, Mosenzon O, Kato ET, Cahn A, et al. Dapagliflozin i kardiovaskularni ishodi kod dijabetesa tipa 2. N Engl J Med. 2019; 380(4):347–357.
11. Brown E, Rajeev SP, Cuthbertson DJ, Wilding JPH. Pregled mehanizma djelovanja, metaboličkog profila i hemodinamskih efekata inhibitora kotransportera natrijum-glukoze{4}}. Diabetes Obes Metab. 2019; 21 Suppl 2:9–18.
12. Heerspink HJL, Stefansson BV, Chertow GM, Correa-Rotter R, Greene T, Hou FF, et al. Obrazloženje i protokol randomiziranog kontroliranog ispitivanja dapagliflozina i prevencija štetnih ishoda kod kronične bubrežne bolesti (DAPA-CKD). Transplantacija Nephrol Dial. 2020; 35(2):274–282.
13.Bae JH, Park EG, Kim S, Kim SG, Hahn S, Kim NH. Efekti inhibitora kotransportera natrijum-glukoze 2 na bubrežne ishode kod pacijenata sa dijabetesom tipa 2: sistematski pregled i meta-analiza randomiziranih kontroliranih studija. Sci Rep. 2019; 9(1):13009.
14. Domon A, Katayama K, Tochigi Y, Suzuki H. Karakterizacija novog modela pacova dijabetesa tipa 2 bez gojaznosti sa uvećanim bubrezima. J Diabetes Res. 2019; 2019:8153140. PMID: 31467929
15. Vallon V, Gerasimova M, Rose MA, Masuda T, Satriano J, Mayoux E, et al. SGLT2 inhibitor empagliflozin smanjuje rast bubrega i albuminuriju srazmjerno hiperglikemiji i sprječava glomerularnu hiperfiltraciju kod dijabetičkih Akita miševa. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306(2): F194–204.
16. Vickers SP, Cheetham SC, Headland KR, Dickinson K, Grempler R, Mayoux E, et al. Kombinacija natrijum-glukoznog kotransportera-2 inhibitora empagliflozina sa orlistatom ili sibutraminom dodatno poboljšava smanjenje tjelesne težine i homeostazu glukoze kod gojaznih pacova hranjenih dijetom u kafeteriji. Diabetes Metab Syndr Obes. 2014; 7:265–75.
17. Glastras SJ, Chen H, The R, McGrath RT, Chen J, Pollock CA, et al. Mišji modeli dijabetesa, gojaznosti i srodne bolesti bubrega. PLoS One. 2016; 11(8):e0162131.
18.Badawy AA, Morgan CJ, Turner JA. Primjena Phenomenex EZ:faast™ kompleta za analizu aminokiselina za brzo plinsko-hromatografsko određivanje koncentracija triptofana u plazmi i njegovih konkurenata u mozgu. Amino kiseline. 2008; 34(4):587–96.
19. Michishita M, Saito N, Nozawa S, Furumoto R, Nakagawa T, Sato T, et al. Profiliranje metabolita u stanicama koje formiraju sfere iz staničnih linija adenokarcinoma dojke psećih pomoću gasne hromatografije-masene spektrometrije. J Vet Med Sci. 2019; 81(9):1238–1248.
20. Kamijo-Ikemori A, Sugaya T, Kimura K. Protein koji vezuje masne kiseline u urinu kod bolesti bubrega. Clin Chim Acta. 2006; 374(1–2):1–7.