Efekti glieozida Cistanche na učenje kognicije i sinaptičke plastičnosti u modelu deprivacije sna pacovima

SAŽETAK

Cilj:Istražiti mogu li glikozidi cistanche poboljšati učenje i kognitivne funkcije štakora modela deprivacije sna reguliranjem sinaptičke plastičnosti.

Metode: Pedeset mužjaka Wistar štakora nasumično je podijeljeno u praznu kontrolnu grupu (Kontrola), kontrolnu grupu platforme (PC), grupu modela (Model),glikozidi cistanche grupe (GC)i grupa estazolama (Est). Model deprivacije sna pacova pripremljen je modificiranom multiplatformskom metodom vodenog okruženja. Morrisov vodeni labirint i test otvorenog polja korišteni su za otkrivanje prostornih kognitivnih funkcija i emocionalnih promjena pacova. Nisslovo bojenje je korišteno za uočavanje promjena u morfologiji i količini nervnih ćelija uhipokampalno područje CAl pacova. Western blot i R'T - PCR su korišteni za otkrivanje nivoa ekspresije sinaptofizina (SY'N), supstance guste postsinaptičke membrane 95 ( PSD -95 ) ineurotrofni faktor iz mozga (BDNF). 

Rezultati;Rezultati Morrisovog vodenog lavirinta pokazali su da je u poređenju sa kontrolnom grupomučenje i kognitivne sposobnosti pacovau grupi Model je značajno smanjen (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats waspoboljšan tretman GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the nivoi ekspresije proteina i gena BDNF, SYN i PSD -95u grupi Mlodel su značajno smanjeni (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

BILJNE FORMULACIJE CISTANCHE DODACI ZAPOBOLJŠANJE UČENJA I KOGNITIVNE FUNKCIJE

KLJUČNE RIJEČICistanche glikozidi; Hipokampus; Deprivacija sna; Učenje i pamćenje; Anksioznost; Sinaptička plastičnost

Poremećaj spavanja (SD)je afunkcionalni poremećaj abnormalnog snauzrokovano nizom složenih faktora kao nprnesanica, sanjivost, ilako buđenje. posljednjih godina,incidenca SDpostepeno se povećavao. Povezane studije su izvijestile da SD može uzrokovatikardiovaskularne bolesti,metabolička disfunkcija,imunološke bolesti, icentralnog nervnog sistemadegenerativne bolesti kao što je Alchajmerova bolest [1]. SD može uzrokovati oksidativno oštećenje hipokampalnih neurona, uzrokovati kognitivnu disfunkciju i uzrokovati promjene raspoloženja kao što su anksioznost i depresija [2]. Cistanche deserticola je dragocjen ljekoviti materijal koji se u Kini može koristiti i kao lijek i kao hrana. Ima efekte toniziranja bubrega i obnavljanja Qi-ja, vlaže crijeva, podstičući rad crijeva i jača yang. Glavni ekstrakt Cistanche deserticola, glikozidi cistanhe (GC), ima antioksidativno, antiapoptotičko, zaštitno i neuroprotektivno djelovanje [3]. Naše prethodno istraživanje je pokazalo da GC mogu poboljšati učenje i kognitivne funkcije SAMP8 miševa igrajući antioksidativnu i anti-apoptotičku ulogu [4].

Srodne studije su pokazale da je kognitivna disfunkcija uzrokovana SD usko povezana sa sinaptičkom plastičnošću [5]. Međutim, postoji nekoliko izvještaja o mehanizmu pomoću kojeg GC reguliraju sinaptičku plastičnost i poboljšavaju učenje i oštećenje pamćenja te kognitivni pad kod štakora uzrokovan nedostatkom sna. Stoga, ova studija ima za cilj istražiti da li GC-ovi utječu na sinaptičku plastičnost regulacijom ekspresije sinaptičkih markera, čime se poboljšava učenje i kognitivne funkcije štakora s modelima deprivacije sna, te pruža nove ideje za liječenje i planove za GC za liječenje učenja i kognitivnih sposobnosti. oštećenja uzrokovana poremećajima spavanja.

1 Materijali i metode

1.1 Pokusne životinje

Mužjaci Wistar pacova u dobi od 6 do 8 sedmica, težine 280 do 300 g, kupljeni su od Beijing Sibeifua, sa licencom za proizvodnju životinja [SCXK (Peking) 2019-0010]. Sve životinje su držane u Centru za eksperimente na životinjama Medicinskog fakulteta Baotou pod sledećim uslovima: temperatura (24 ± 1) stepen, vlažnost 50% do 55%, 12 h svetlo i 12 h mrak, i bez ograničenja u hrani i vodi. Ovaj eksperiment je odobrio školski etički komitet [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 Glavni reagensi i instrumenti

Ukupni glikozidi Cistanche deserticola su kupljeni od Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (broj serije: KSM20220609011); Estazolam tablete su kupljene od CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (br. serije: 044220343); pufer za punjenje proteina (P1015), RIPA pufer za lizu (R0010), hemiluminiscentni rastvor (PE0010), itd. su svi kupljeni od Peking Solebaoa; supstanca postsinaptičke gustine u 95 (PSD-95) antitelu (AB192757) i sinaptofizinskom (SYN) antitelu (ab32127) kupljena je od Abcam, USA Company; neurotrofni faktor iz mozga (BDNF) (48503-2) i -aktin (52901) kupljeni su od kompanije SAB, SAD; kozje anti-zečje IgG sekundarno antitijelo (SA00001-20) kupljeno je od Proteintech Company, SAD; melatonin pacova (MT) i ELISA komplet za naučno istraživanje (MM-0657R1) kupljeni su od Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Parafin rezač (Leica, Njemačka); optički mikroskop (Leica, Njemačka);

Morris vodeni labirint, testna kutija na otvorenom (Shanghai Xinruan); aparat za vertikalnu elektroforezu (Peking Liuyi Company); šejker za dekolorizaciju (Peking Liuyi Company); sistem za analizu proteina (Shanghai Tanon Technology); fluorescentni kvantitativni PCR instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Eksperimentalne metode

1.3.1 Grupiranje životinja i primjena lijekova

50 mužjaka Wistar štakora nasumično je podijeljeno u praznu kontrolnu grupu (kontrolna grupa), kontrolnu grupu platforme (kontrolna platforma, PC grupa), modelsku grupu (modelsku grupu), ukupne glikozide Cistanche deserticola grupe (GCs grupa , 50 mg/kg) i grupa estazolina (Est grupa, 0,54 mg/kg), sa 10 pacova u svakoj grupi. Kontrolnoj grupi i PC grupi dat je 0,9% fiziološki rastvor putem sonde. Sve grupe su davane u 7 ujutro svakog dana nakon početka modeliranja, a sonda je trajala 21 dan.

1.3. 2. Priprema životinjskog modela deprivacije sna

Model deprivacije sna uspostavljen je korištenjem modificirane višeplatformske metode vodenog okruženja [6]. Eksperimentalna oprema je bio pravokutni rezervoar za vodu od polietilenske smole dimenzija 130 cm × 50 cm × 45 cm. U rezervoar za vodu postavljena je mala platforma prečnika 5 cm i visine 20 cm. Platforma PC grupe imala je prečnik od 10 cm i visinu od 20 cm. Rezervoar za vodu je napunjen vodom do dubine od oko 18 cm, a temperatura vode je održavana na (20 ± 1) stepen. Nedelju dana pre početka eksperimenta, pacovi su stavljeni u kutiju za deprivaciju sna svaki dan na 60 minuta kako bi se upoznali sa okolinom. Nakon uspostavljanja modela, izuzev kontrolne grupe, pacovi iz svake grupe stavljeni su na malu platformu na vrijeme od 8 do 20 sati svakog dana zbog deprivacije sna tokom 21 uzastopnog dana.

Svi pacovi su imali slobodan pristup hrani i vodi i slobodno su se kretali po platformi. Ciklus svjetla i mraka je bio 12 sati svaki dan.

1. 3. 3 Morrisov eksperiment vodenog lavirinta

Morrisov vodeni labirint je podijeljen na 4 područja, ispunjen vodom, a platforma je postavljena u 4. kvadrant. Vodena površina je bila oko 2 cm iznad platforme. U vodu je dodan jestivi melanin za hranu, a temperatura vode je održavana na (25 ± 1) stepen. (1) Eksperiment pozicioniranja navigacije: Odabrano je središte svake oblasti i pacovi su nježno stavljeni u vodu. Dozvoljeno im je da slobodno istražuju. Zabilježeno je vrijeme koje je pacovima bilo potrebno da pronađu ciljnu platformu u roku od 60 sekundi. Pacovi koji nisu pronašli platformu vođeni su do platforme i ostali 20 sekundi. Obuka je nastavljena 5 dana. (2) Test prostornog istraživanja: 6. dana platforma je uklonjena i pacovi su stavljeni u vodu iz sredine 2. kvadranta uza zid. Zabilježen je broj puta kada su pacovi prošli platformu u roku od 120 s i vrijeme kada su ostali u 4. kvadrantu.

1. 3. 4 Eksperiment na otvorenom terenu

Korištena je eksperimentalna kutija dimenzija 100 cm × 100 cm × 50 cm, a dno kutije podijeljeno je na 9 rešetki. Svaka grupa pacova je prethodno stavljena u eksperimentalnu prostoriju na otvorenom kako bi se prilagodila unutrašnjem okruženju u trajanju od 60 minuta. Na početku eksperimenta, test pacovi su naizmjence stavljeni u fiksne kutove eksperimentalne kutije otvorenog polja, a broj vremena stajanja, rastojanje kretanja i statičko vrijeme štakora unutar 5 minuta su zabilježeni korištenjem softvera za analizu ponašanja. Okolina je bila tiha tokom eksperimenta, a eksperimentalni uređaj je obrisan vodom, odnosno alkoholom između dva eksperimenta kako bi se spriječilo da miris prvog štakora utječe na procjenu ponašanja sljedećeg štakora.

1. 3. 5 Enzimski imunosorbentni test (ELISA)

Detekcija nivoa MT u serumu kod pacova Pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom, a 5 mL krvi je sakupljeno iz abdominalne aorte. Nakon čekanja 30 minuta na sobnoj temperaturi, krv je centrifugirana da se dobije serum. U svaku jažicu dodano je 40 μL razblaživača uzorka, a zatim je dodato 10 μL uzorka koji se testira. Nakon zatvaranja zaptivnim filmom, ploča je inkubirana na 37 stepeni 30 min. Opran 5 puta, dodano je 50 μL rastvora za obeležavanje enzima, a ploča je zapečaćena zaptivnim filmom i inkubirana na 37 stepeni 30 min. Opran 5 puta, a zatim su naizmenično dodani rastvor za razvijanje boje i rastvor za završetak reakcije. OD vrijednost svake jažice izmjerena je enzimskim markerom na talasnoj dužini od 450 nm.

1. 3. 6 Nissl bojenje

Iz svake grupe su odabrana tri štakora, a moždano tkivo je uklonjeno dekapitacijom i fiksirano sa 4% rastvorom polioksietilena. Tkivo je dehidrirano, uronjeno u otopinu voska, ugrađeno i isječeno konvencionalnim metodama. Rezovi su držani debljine 5 μm, isprani PBS-om, obojeni sa 0.1% toluidin plavim tokom 0,5 h, diferencirani sa 95% alkohola, dehidrirani sa 100% alkoholom, transparentni sa ksilenom i zapečaćena neutralnom gumom. Promjene u morfologiji i broju neurona u CA1 regiji hipokampusa pacova uočene su pod mikroskopom i prikupljene su slike.

1. 3. 7 Western blot eksperiment

Iz svake grupe su odabrana četiri štakora, a hipokampus je izolovan dekapitacijom. Tkivo hipokampusa je pomešano sa RIP A puferom za lizu u okruženju ledenog kupatila i tkivo je centrifugirano da bi se dobio supernatant. Koncentracija proteina je detektirana BCA metodom. Dodato je 20 ug proteina sa puferom za punjenje proteina za elektroforezu. Nakon što je elektroforeza proteina završena, membrana je prebačena pri konstantnom protoku od 300 mA, blokirana sa 5% obranog mlijeka u prahu, primarno antitelo je inkubirano na 4 stepena preko noći, a sekundarno antitelo je inkubirano na sobnoj temperaturi 2 h. Nakon što je korišćen rastvor za razvoj boje, proteinske trake su statistički analizirane korišćenjem sistema za analizu hemiluminiscencije.

1. 3. 8 RT-PCR eksperiment

Iz svake grupe su odabrana tri štakora za pripremu homogenata hipokampalnog tkiva. Ukupna RNK u tkivnoj tečnosti ekstrahirana je Trizol metodom i izmjerena je koncentracija. Fastking komplet za sintezu cDNA korišten je za reverznu transkripciju, a reakcija kvantitativne amplifikacije fluorescencije je izvedena korištenjem fluorescentnog kvantitativnog kompleta da bi se otkrio relativni nivo ekspresije mRNA proteina povezanog sa sinaptikom. Rezultati su analizirani korištenjem 2-ΔΔCt. Sekvence prajmera prikazane su u tabeli 1.

Tabela 1 RT-PCR sekvence prajmera

1.4 Statističke metode

Rezultati podataka koji su odgovarali normalnoj distribuciji izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x ± s), a statistička analiza je izvršena korištenjem softvera GraphPad Prism 9.5. Jednosmjerna analiza varijanse korištena je za poređenje između više uzoraka, a P < 0.05 ukazuje da je razlika statistički značajna.