Abstract

Oksidativni stres izazvan prekomernim slobodnim radikalima jedan je od ključnih pokretača starenja ljudskih ćelija, hronične upale i višestrukih metaboličkih degenerativnih poremećaja. Nutraceutski sastojci biljnog porijekla iz homolognih resursa za lijekove za hranu zadobili su veliku globalnu pažnju kao prirodne antioksidativne alternative sintetičkim antioksidativnim aditivima.Lycium ruthenicum, također poznat kao crna goji bobica, iCistanche deserticola(pustinjska metlica) su reprezentativni endemski ljekovito-jestivi biljni resursi koji potiču iz Hexi koridora u sjeverozapadnoj Kini. Sadrže obilje karakterističnih fitokemijskih sastojaka uključujući antocijanine, polifenole, bioaktivne polisaharide kao i feniletanoidne glikozide. Iako su pojedinačne biološke aktivnosti ove dvije sirovine dokumentirane u više postojećih studija, ograničena istraživanja su se fokusirala na to kako ljudski gastrointestinalni uvjeti probave mijenjaju biodostupnost i stvarni antioksidativni potencijal njihovog miješanog praha. U ovom istraživanju korišćeni su jednokomponentni prah i tri grupe mešanog praha sa različitim masenim omjerima (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola= 1:2, 1:1, 2:1) su pripremljeni. Implementiran je statički dvostepeni model gastrointestinalne probave in vitro, koji se sastoji od 2-satne simulirane želučane probave pod pH 2,0 s pepsinom, nakon čega slijedi 2-satna simulirana crijevna probava pod pH 7,0 dopunjena tripsinom. Dinamičko uzorkovanje je sprovedeno u više vremenskih intervala tokom inkubacije digestije. Kvantitativno smo odredili rastvorljive sadržaje ukupnih polifenola, polisaharida, antocijanina i feniletanoidnih glikozida, uz kapacitet uklanjanja slobodnih radikala DPPH i ABTS. Urađena je Pearsonova korelaciona analiza kako bi se otkrile unutrašnje veze između koncentracija bioaktivnih jedinjenja i antioksidativnih indikatora. Eksperimentalni rezultati su pokazali da je probava u želucu značajno poboljšala rastvorljivost četiri glavne funkcionalne fitokemikalije, što je dodatno poboljšalo učinak uklanjanja radikala i DPPH i ABTS. Tokom naknadne faze probave u crijevima, rastvorljivost polifenola i feniletanoidnih glikozida je rasla, dok se mjerljivi sadržaji polisaharida i antocijana značajno smanjivali. Intestinalna probava je imala promotivne efekte na aktivnost uklanjanja radikala ABTS, ali nije generirala pozitivno poboljšanje stope eliminacije slobodnih radikala DPPH. Polifenoli, antocijanini i feniletanoidni glikozidi pokazali su statistički značajne linearne korelacije sa parametrima antioksidativnog kapaciteta (P < 0.05). Among all three blending formulations, the mixing ratio of 2:1 (Lycium ruthenicumtoCistanche deserticola) pokazao superioran sveobuhvatan antioksidativni kapacitet nakon simulacije pune gastrointestinalne probave. Ova studija je razjasnila pravila varijacije bioaktivnih supstanci u gastrointestinalnom simuliranom okruženju za pojedinačne i kombinovane crne goji bobice i prah pustinjske repice. Naši rezultati pružaju solidnu eksperimentalnu podršku za razvoj novih funkcionalnih dodataka prehrani koji koriste pustinjske biljne materijale Hexi-Corridor.

Ključne riječi: Lycium ruthenicum; Cistanche deserticola; in-vitro gastrointestinalna probava; biopristupačnost; polifenoli; feniletanoidni glikozidi; antocijanini; antioksidativna aktivnost; homologija hrane i lijekova

1. Uvod

Starenje stanovništva i rastuća javna potraga za podzdravstvenim intervencijama učinili su istraživanje nutricionizma protiv starenja vrućom tačkom u globalnoj funkcionalnoj prehrambenoj i nutricionističkoj industriji. Hipoteza o starenju slobodnih radikala je široko prihvaćena za tumačenje mehanizma starenja organizma. Kontinuirano nakupljanje reaktivnih vrsta kisika u ljudskom tijelu će pokrenuti peroksidaciju lipida, oštetiti strukturu DNK i funkciju proteina, ubrzati ćelijsko starenje i povećati rizik od obolijevanja od ateroskleroze, kroničnih upalnih bolesti i degenerativnih simptoma povezanih sa starenjem. Unos prirodnih fitokemijskih antioksidanata hranom smatra se nježnom i sigurnom nutritivnom strategijom za ublažavanje oksidativnog stresa u usporedbi s farmaceutskim intervencijama. Sintetički antioksidansi kao što su BHT i BHA postepeno se suočavaju sa strožim regulatornim nadzorom na mnogim regionalnim tržištima, što dodatno podstiče potražnju tržišta za prirodnim antioksidativnim sirovinama biljnog porijekla.

Tradicionalni biljni resursi iz istočnoazijskog homolognog sistema hrane i medicine privukli su sve veće interesovanje među zapadnim istraživačima ishrane i proizvođačima suplemenata.Lycium ruthenicumMurr., višegodišnja vrsta žbuna iz porodice Solanaceae, rasprostranjena je u aridnim i polusušnim zonama sjeverozapadne Kine. Njegov tamnoljubičasti plod stječe reputaciju "kralja antocijana", zbog izuzetno visoke koncentracije aciliranih derivata antocijana koji se rijetko pojavljuju u običnom voću. Osim antocijana, voće crne goji bobice bogato je i složenim mješavinama polifenola, polisaharidima topivim u vodi, jedinjenjima flavonoida i raznim mineralnim elementima u tragovima. Prethodni in-vitro eksperimenti i eksperimenti sa ćelijskom kulturom potvrdili su njegovu snažnu antiinflamatornu i imunomodulatornu bioaktivnost u uklanjanju radikala. Većina postojećih publikacija oLycium ruthenicumfokusiranje na identifikaciju komponenti sirovog materijala, optimizaciju procesa ekstrakcije i procjenu antioksidansa sirovog ekstrakta.

Cistanche deserticola, uobičajeno nazvana pustinjska metla, je obavezna holoparazitna biljka koja pripada porodici Orobanchaceae. Hiljadama godina ova biljka se koristi kao tonik biljni materijal u tradicionalnoj kineskoj medicini. Njegove glavne prepoznatljive bioaktivne komponente su feniletanoidni glikozidi uključujući ehinakozid i akteozid, zajedno sa specifičnim frakcijama polisaharida rastvorljivih u vodi. Savremena farmakološka istraživanja otkrivaju da feniletanoidni glikozidi izCistanche deserticolaposjeduje antioksidativno, neuroprotektivno i imunoregulacijsko djelovanje, dok njegove polisaharidne frakcije mogu modulirati imuni odgovor makrofaga. Sirovina je geografski koncentrisana u pustinjskim oaznim zonama Gansu Hexi koridora i pustinjskog područja Unutrašnje Mongolije.

Iz lokalne industrijske perspektive, obje biljne vrste su karakteristične ekonomske kulture u Gansu Hexi koridoru. Lokalna poljoprivredna preduzeća istražuju funkcionalne prehrambene proizvode s dodanom vrijednošću na bazi ove dvije pustinjske biljke. Klasična kineska teorija kompatibilnosti biljaka sugerira da se podudaraLycium ruthenicumiCistanche deserticolamože proizvesti sinergističke tonične efekte. Trenutno, većina objavljenih radova samo evaluira svaku biljku posebno. Za njihovu formulu spoja dostupni su vrlo ograničeni eksperimentalni podaci.

Važno je napomenuti da ukupni fitokemijski sadržaj detektovan u sirovom prahu ne može direktno predstavljati stvarni antioksidativni efekat u ljudskom gastrointestinalnom traktu. Jednom kada se biljni prah konzumira oralno, bioaktivni molekuli će proći kroz drastične promjene okoliša: jako kiselo stanje želuca s hidrolizom proteaze, nakon čega slijedi neutralno-alkalno okruženje tankog crijeva s katalizom enzima pankreasa. Mnoge fenolne supstance, antocijanini i polisaharidi su osetljivi na pH; mogu se rastvoriti, transformisati, degradirati ili konjugirati tokom postupka varenja. Prava biopristupačna frakcija, umjesto originalnog ukupnog sadržaja, određuje fiziološku funkciju.

Statički in-vitro simulirani test probave gastrointestinalnog trakta je standardizirani preliminarni istraživački alat široko prihvaćen u nauci o hrani. Ovaj sistem za laboratorijsku simulaciju može oponašati varijaciju pH i stanje hidrolize proteaze ljudskog želuca i tankog crijeva. Istraživači mogu pratiti dinamičke promjene biopristupačnih fitokemikalija bez skupih ispitivanja hranjenja životinja ili testova humanitarne intervencije. Ova metoda se široko primjenjuje za procjenu voća, povrća, biljnog praha i nutricionističkih sirovina.

Do sada, nijedan javni izvještaj nije opisao in-vitro gastrointestinalne karakteristike probave za miješani kompozitni prahLycium ruthenicumu kombinaciji saCistanche deserticola. Stoga je ova studija izvela statičke simulirane eksperimente gastrointestinalne probave na jednom praškastom sirovom materijalu i tri grupe miješanog praha s varijantom proporcija. Kontinuirano smo pratili dinamičke promjene rastvorljivih polifenola, polisaharida, antocijanina, feniletanoidnih glikozida, kao i kapaciteta za uklanjanje radikala DPPH i ABTS u više tačaka digestije. Provedena je statistička analiza korelacije između koncentracije bioaktivne komponente i antioksidativnih indeksa. Naši ciljevi uključuju: (1) razjasniti kako okolina simulirana želucem i crijeva utječu na rastvorljivost i stabilnost glavnih funkcionalnih supstanci iz crne goji bobice i pustinjske brune; (2) uporediti učinak antioksidansa različitih omjera miješanja nakon probave; (3) izdvojiti optimalnu proporciju miješanja za složeni funkcionalni prah. Nalazi ovog rada mogu pružiti osnovne eksperimentalne dokaze za razvoj nove generacije antioksidativnih funkcionalnih prehrambenih proizvoda i dodataka prehrani dobivenih iz lokalnih biljnih resursa Hexi-Koridora.

2. Materijali i metode

2.1 Biljne sirovine

Zreli plodoviLycium ruthenicumubrani su iz vještačke plantažne šume u gradu Huahai, grad Yumen, provincija Gansu, Kina, 2022. godine. Plodovi sakupljeni na polju su podvrgnuti prirodnom procesu sušenja u hladu pod ventiliranom temperaturom okoline. Oštećeni plodovi, peteljke voća i ostaci nečistoća su ručno uklonjeni. Čisto sušeno voće je usitnjeno i prosijano kroz sito od 50-mesh kako bi se dobio homogeni prah crnih goji bobica za eksperimente probave.

Svježe mesnate stabljikeCistanche deserticolasakupljeni su u maju 2022. od umjetno inokuliranihHaloxylon ammodendronšuma dina smještena u okrugu Gaotai, provincija Gansu. Svježa tkiva su temeljito oprana kako bi se uklonila površinska kontaminacija pijeskom, isječena na tanke kriške i odmah uronjena u otopinu za zaštitu boje kako bi se spriječila reakcija fenolnog posmeđivanja. Prethodno obrađene kriške su osušene zamrzavanjem pod vakuumom. Liofilizirana čvrsta supstanca je smrvljena i propuštena kroz sito od 50-mesh da bi se pripremilaCistanche deserticolazamrznuto osušeni uzorak praha.

Tri grupe mešovitog praha pripremljene su mešanjemLycium ruthenicumprah iCistanche deserticolaliofilizirani prah u različitim masenim omjerima:

Grupa A: omjer mase 1 : 2 (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola)

Grupa B: omjer mase 1 : 1 (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola)

Grupa C: omjer mase 2 : 1 (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola)

Ukupna masa uzorka za svaki sistem za reakciju digestije je fiksirana na 0,75 g, odnos čvrsta i tečnost je kontrolisan na 1 : 40 (w/v).

2.2 Hemijski reagensi

Pepsin (aktivnost 3 000 U/g), tripsin (aktivnost 250 U/mg), standardna supstanca galne kiseline, Folin‑Ciocalteu reagens, DPPH (1,1‑difenil‑2‑pikrilhidrazil), ABTS (2,2′‑azino‑bis‑(3‑etilbenzotiazolin‑6‑sulfonska kiselina)) kupljeni su od Macklin Biochemical Co., Ltd., Šangaj, Kina. Hlorovodonična kiselina, natrijum bikarbonat, natrijum karbonat, fenol, koncentrovana sumporna kiselina i drugi neorganski hemijski agensi bili su domaći komercijalni reagensi analitičke čistoće.

2.3 Laboratorijska oprema i instrumenti

DK‑98‑Ⅱ digitalno vodeno kupatilo konstantne temperature (Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, Kina); QUINTIX‑224 elektronska analitička vaga (Sartorius, Njemačka); GL‑12B stolna rashladna centrifuga velike brzine (Hunan Hexi Instrument Equipment Co., Ltd., Kina); DR6000 ultraljubičasto vidljivi spektrofotometar (Hach Company, SAD); Termostatski inkubator u vodenom kupatilu serije SPH‑110X (Shanghai Shiping Instrument Co., Ltd., Kina).

2.4 Statički in-vitro protokol gastrointestinalne digestije

Procedura dvofazne digestije je modificirana i optimizirana u odnosu na prethodno objavljene statičke protokole gastrointestinalne probave za matricu biljne hrane. Svaki test probave je izveden sa tri biološka paralelna ponavljanja.

Faza probave želuca (GD, ukupno vrijeme inkubacije=2 h):Precizno smo izmjerili uzorak praha od 0,75 g i prebacili ga u polipropilensku centrifugalnu epruvetu od 50 mL. Odgovarajuća zapremina dejonizovane vode je dodata da se potpuno navlaži čvrsta praškasta matrica. pH vrijednost suspenzije uzorka je pažljivo podešena na pH 2,0 korištenjem 1 mol/L vodenog rastvora hlorovodonične kiseline. Nakon toga je dodato 4 mL prethodno pripremljene simulirane želučane tekućine; simulirana želučana tečnost sadržavala je 3 g pepsina rastvorenog u 50 mL 0,01 mol/L rastvora HCl. Centrifugalne epruvete su stavljene u termostatski inkubator za mućkanje, temperatura inkubacije je održavana na 37 stepeni da bi oponašala fiziološku temperaturu ljudskog tela, brzina rotacije mućkanja je podešena na 100 o/min. U predviđenim vremenskim tačkama uzorkovanja (0 h, 0,5 h, 1,0 h, 1,5 h, 2,0 h), izvađena je djelomična reakciona smjesa. Aktivnost enzima je prekinuta zagrijavanjem u kipućoj vodenoj kupelji u trajanju od 10 minuta. Tretirana smjesa je centrifugirana na 4 stepena, brzinom rotacije 6 000 r/min 15 min. Bistra supernatantna tečnost je sakupljena i sačuvana za naknadnu fitokemijsku kvantifikaciju i testove antioksidativne aktivnosti.

Faza crijevne probave (ID, ukupno vrijeme inkubacije=2 h):Nakon završene 2-satne inkubacije želučane digestije, pH vrijednost digeste je podešena sa pH 2,0 na neutralni pH 7,0 dodavanjem u kapima 1,0 mol/L otopine natrijum bikarbonata. Radni rastvor tripsina je zatim dodat u sistem za varenje; ovaj radni rastvor je pripremljen otapanjem 0,3 g tripsina u prahu u 50 mL 0,01 mol/L rastvora natrijum karbonata. Uslovi inkubacije u intestinalnoj fazi su održavani dosljednim: temperatura 37 stepeni, brzina mućkanja 100 o/min. Vremenske tačke uzorkovanja za probavu u crijevima postavljene su na 0 h, 0,5 h, 1,0 h, 1,5 h i 2,0 h. Nakon uzorkovanja, koraci deaktivacije enzima, centrifugiranja u hladnjaku i prikupljanja supernatanta bili su identični operacijama u želučanoj fazi.

2.5 Određivanje bioaktivnih funkcionalnih komponenti

Ukupni sadržaj rastvorljivih polifenola je analiziran Folin-Ciocalteu kolorimetrijskom metodom, rezultati proračuna su izraženi kao miligram ekvivalenta galne kiseline po gramu uzorka (mg GAE/g). Ukupni sadržaj topivih polisaharida mjeren je kolorimetrijskom kvantitativnom metodom fenol-sumporna kiselina. Ukupni sadržaj antocijana detektovan je pH-diferencijalnom spektrofotometrijom. Ukupni sadržaj feniletanoidnih glikozida kvantificiran je metodom ultraljubičastog spektrofotometrijskog određivanja. Svaki uzorak supernatanta je izmjeren u tehničkom trostrukom primjerku kako bi se smanjila devijacija u testiranju.

2.6 Antioxidant capacity measurement

2.6.1. Test čišćenja slobodnih radikala DPPH

Procenat uklanjanja radikala DPPH izračunat je prema formuli (1): \\(\\text{stopa uklanjanja DPPH radikala (\\%)}= \\left(1-\\frac{A_1-A_2}{A_0}\\desno)\\times 100 \\tag{1}\\) Gdje:A₁predstavlja očitavanje apsorpcije miješanog rastvora koji sadrži supernatant uzorka i radni rastvor DPPH;A₂A₀predstavlja apsorpciju radne otopine DPPH pomiješane s kontrolnom grupom čiste dejonizirane vode.

2.6.2 ABTS test čišćenja slobodnih radikala kationa

Brzina uklanjanja ABTS radikala izračunata je prema formuli (2): \\(\\text{Brzina uklanjanja ABTS-a (\\%)}= \\left(1-\\frac{A_1-A_2}{A_0}\\right)\\put 100 \\tag{2}\\) Definicije parametra apsorpcijeA₁, A₂, A₀održavati dosljednu logiku kao DPPH proračun.

2.7 Statistička obrada podataka

Svi probavni eksperimenti su ponovljeni za tri nezavisna biološka ponavljanja. Usvojen je statistički softverski paket SPSS 22.0 za jednosmjernu analizu varijanse (ANOVA), test značajnosti i izračunavanje Pirsonovog koeficijenta korelacije. Za crtanje eksperimentalnih figura primijenjen je softver Origin 2018. Prag statističke značajnosti je definisan kaoP < 0.05; P < 0.01 was judged as extremely significant difference. Different lowercase letters marked on chart bars indicate significant statistical difference between different treatment groups.

3. Rezultati

3.1 Promjene bioaktivnih supstanci i antioksidativnog kapaciteta za pojedinačneLycium ruthenicumprah

Unutar okruženja simulirane želučane probave, sadržaj rastvorljivih polifenola u prahu crnih goji bobica se značajno povećao u prvih 1,5 h inkubacije i pokazao blagi pad u kasnijoj fazi želučane probave. Stanje želučane kiseline uvelike je potaknulo rastvaranje molekula polisaharida i komponenti antocijanina (P < 0.05). Once the digesta transferred to intestinal digestion alkaline environment, detected soluble polysaccharide and anthocyanin contents showed obvious decreasing tendency. Experimental observation confirmed that alkaline pH value of simulated intestinal fluid constituted the primary driving factor for anthocyanin molecular degradation.

Iz perspektive antioksidativne aktivnosti, postotak uklanjanja radikala i DPPH i ABTS kontinuirano raste tokom inkubacije želudačne probave. Kada je probava ušla u crijevnu fazu, kapacitet uklanjanja radikala DPPH naglo se smanjio.

Rezultati proračuna Pearsonove korelacije pokazali su da u uslovima želučane probave sadržaj polifenola ima značajnu pozitivnu korelaciju sa brzinom uklanjanja DPPH. Polifenol i antocijanin pokazali su izuzetno značajnu pozitivnu korelaciju sa ABTS performansama uklanjanja radikala (P < 0.01). In intestinal digestion environment, polyphenol concentration presented significant negative correlation with antioxidant indexes. This phenomenon suggested partial degradation and structural transformation of phenolic compounds under intestinal‑simulated condition. Meanwhile, polysaccharide and anthocyanin still maintained positive correlation with radical‑scavenging capability throughout intestinal digestion process.

3.2 Promjene bioaktivnih supstanci i antioksidativnog kapaciteta za pojedinačneCistanche deserticolaprah

Za zamrzavanjeCistanche deserticolakoncentracija u prahu, rastvorljivog polifenola dostigla je vršnu vrijednost na 1,5 h u inkubaciji želučane faze, praćena opadajućim trendom. Tokom crijevne probave, sadržaj polifenola se brzo povećao u prvih 0,5 h, zatim je opao i ponovo porastao pred kraj 2-satne crijevne inkubacije. Sadržaj rastvorljivih polisaharida pokazao je ukupnu tendenciju smanjenja u želučanoj i intestinalnoj fazi probave. Koncentracija rastvorljivog feniletanoidnog glikozida održavala je kontinuirani rast kroz cijeli 2-satni postupak probave želuca.

Što se tiče učinka antioksidansa, želučana probava je poboljšala brzinu uklanjanja DPPH radikala unutar prvih 1,5 h, a zatim je antioksidativna vrijednost opala. Nakon prelaska na intestinalnu probavu, brzina uklanjanja DPPH se prvo smanjila, a zatim se postepeno vratila. Stopa uklanjanja radikala ABTS-a pokazala je obrazac početnog opadanja i naknadnog porasta tokom punog vremena digestije.

Statistički rezultati korelacije pokazali su da su polifenoli i feniletanoidni glikozidi imali izuzetno značajnu pozitivnu korelaciju sa kapacitetom uklanjanja radikala DPPH u želučanoj probavi (P < 0.01). In intestinal digestion environment, phenylethanoid glycoside concentration showed significant correlation with both DPPH and ABTS scavenging indicators. This result strongly proved phenylethanoid glycosides act as the dominant antioxidant‑active constituents for Cistanche deserticolasirovina.

3.3 Bioaktivna jedinjenja i antioksidativna svojstva miješanog praha pod simuliranom želučanom probavom

Tri mešovite formulacije u prahu (Grupa A 1:2, Grupa B 1:1, Grupa C 2:1) predstavile su prepoznatljive obrasce fluktuacije komponenti pod simulacijom želučane probave. Za rastvorljivi polifenol: Grupa A i Grupa B su doživjele početno smanjenje praćeno povećanjem sadržaja kako se vrijeme varenja produžavalo. Grupa C je pokazala trajni opadajući trend rastvorljivog polifenola kroz inkubaciju želuca. Sadržaj rastvorljivih polisaharida, antocijanina i feniletanoidnih glikozida pokazao je karakteristike fluktuacije zavisne od omjera. Uopšteno govoreći, kisela gastrična sredina je olakšala rastvaranje ove četiri klase bioaktivnih fitokemikalija iz mješovitog biljnog matriksa u prahu.

Rezultati antioksidativnih testova otkrili su da se postotak uklanjanja radikala DPPH i ABTS u sve tri mješovite grupe značajno povećao s produženim vremenom probave u želucu (P < 0.05). Comparative analysis among three formula groups demonstrated that Group C (2:1 ratio, higher proportion of Lycium ruthenicum) postigla relativno veće vrijednosti uklanjanja radikala nakon probave u gastričnoj fazi.

3.4 Bioaktivna jedinjenja i antioksidativna svojstva mešanog praha pod simuliranom probavom u crevima

Nakon ulaska u fazu crijevne probave, topljivost miješanog praha polifenola i feniletanoidnih glikozida mogla bi održati trend daljeg rasta. Ipak, sadržaj rastvorljivih polisaharida i antocijanina koji se može detektovati generalno je pretrpeo gubitak supstance. Stopa uklanjanja radikala DPPH opala je u ranoj fazi probave u crijevima i oporavila se u kasnijem periodu inkubacije. Stopa uklanjanja radikala ABTS-a predstavlja statistički značajan opadajući trend za sve tri mješovite grupe u cijeloj inkubaciji crijevne probave (P < 0.05).

Sveobuhvatno poređenje s obzirom na nivo zadržavanja bioaktivne supstance kao i integrisani antioksidativni kapacitet nakon kompletne sekvencijalne probave želuca i creva ilustruje da je Grupa C sa omjerom mešanja 2:1 (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola) pružio je superiorne ukupne antioksidativne performanse, u poređenju sa Grupom A i Grupom B.

4. Diskusija

Naši eksperimentalni rezultati probave in-vitro jasno pokazuju da je kiselo želučano okruženje povoljno za oslobađanje rastvorljivih polifenola, polisaharida, antocijana i feniletanoidnih glikozida iz obaLycium ruthenicumiCistanche deserticolamatrica biljnog praha. Kombinirani efekti kisele hidrolize niske pH vrijednosti, inkubacije mehaničkim mućkanjem i pepsin proteaze mogu poremetiti djelomičnu strukturu biljnog zida, što ubrzava unutarćelijsko fitokemijsko otapanje u vodeni digestivni supernatant. Takvo poboljšanje rastvaranja direktno poboljšava koncentraciju biodostupne antioksidativne supstance i sposobnost uklanjanja radikala.

Kada se sistem za varenje prebaci u neutralno-alkalnu crijevnu sredinu, različite fitokemijske kategorije imaju različite karakteristike stabilnosti. Antocijanini koji potiču iz crnih goji bobica su dobro poznati pH-osetljivi molekuli. Alkalno stanje crijeva ubrzava degradaciju antocijaninske prstenaste strukture, što dovodi do mjerljivog smanjenja sadržaja u supernatantu. Ovo zapažanje je u skladu s prethodnim zaključcima istraživanja dobivenim iz drugih bobičastih materijala bogatih antocijaninom. Djelomične molekule polisaharida mogu pretrpjeti hidrolitičko cijepanje pod kombiniranim utjecajem intestinalnog pH i katalitičkog djelovanja tripsina, uzrokujući smanjenje detektovane koncentracije topljivog polisaharida. Naprotiv, dijelovi polifenolnih jedinjenja i feniletanoidnih glikozida i dalje se mogu otapati iz biljnog ostatka matrice čak i pod inkubacijom simuliranom u crijevima.

Postoji primjetna razlika između rezultata DPPH testa i ABTS testa. DPPH reakcioni sistem radi u parcijalnim organsko-vodenim mješovitim rastvaračima i pokazuje veću osjetljivost na lipofilne fenolne molekule. ABTS sistem za analizu može detektovati i hidrofilna i lipofilna antioksidativna jedinjenja istovremeno. Ova metodološka razlika pruža djelomično objašnjenje za naš fenomen: crijevna probava je poboljšala učinak uklanjanja radikala ABTS, ali nije uspjela promovirati brzinu eliminacije DPPH. Neki originalni fitokemijski molekuli se razgrađuju tokom inkubacije simulirane u crijevima i proizvode sekundarne metabolite s promijenjenom antioksidativnom snagom. Ti novogenerisani proizvodi razgradnje će preoblikovati konačne rezultate testa uklanjanja radikala.

Korelaciona statistička analiza potvrđuje da antocijanini služe kao primarni antioksidansiLycium ruthenicum, dok feniletanoidni glikozidi dominiraju antioksidativnom aktivnošćuCistanche deserticola. Nakon fizičkog miješanja ova dva praha sirovog materijala, ova dva skupa bioaktivnih sastojaka koegzistiraju unutar digestivnog supernatanta i zajedno određuju ukupni antioksidativni kapacitet miješanog praha. Uporedni skrining između tri omjera miješanja identificira 2 : 1 (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola) kao optimalna formula za maksimiziranje in-vitro antioksidativnog kapaciteta nakon pune simulacije gastrointestinalne probave.

Od suštinskog je značaja razgovarati o intrinzičnim ograničenjima koja pripadaju ovom modelu in-vitro digestije u statičnom šaržnom režimu. Ova laboratorijska simulacija ne može u potpunosti reproducirati složene dinamičke fiziološke procese stvarnog ljudskog gastrointestinalnog trakta. Faktori kao što su kretanje gastrointestinalne peristaltike, kontinuirano lučenje probavnog soka, sudjelovanje žučne soli i proces fermentacije crijevne mikrobiote nisu uključeni u trenutnu eksperimentalnu postavku. Osim toga, korak deaktivacije enzima u kipućoj vodenoj kupelji primijenjen u našem protokolu može uzrokovati manji gubitak fitokemijskih sastojaka koji su otporni na toplinu. Kao uzorak za ispitivanje u ovoj studiji usvojen je sirovi grubi prah umjesto pročišćenih ekstrakata. Stoga, naši eksperimentalni rezultati mogu djelovati kao preliminarni referentni podaci, ali se ne mogu u potpunosti izjednačiti sa stvarnom biodostupnošću tvari u ljudskom tijelu. Da bi se dodatno potvrdili praktični fiziološki efekti ove formule u prahu, potrebna su naknadna ispitivanja hranjenja životinja ili studije intervencije na ljudskoj ishrani.

Iz perspektive razvoja industrijskog proizvoda, ovo istraživanje nudi teorijsku referencu za proizvodnju složenih funkcionalnih dodataka prehrani u prahu korištenjem sirovina crnog goji bobica i pustinjske repice dobivene iz regija koje proizvode Hexi-Corridor. Tokom dizajna formulacije proizvoda i procjene roka trajanja, proizvođači bi trebali obratiti veliku pažnju na svojstva kemijske stabilnosti komponenti antocijanina i feniletanoid-glikozida ovisno o pH. Treba usvojiti razumno prilagođavanje formulacije i kontrolu uslova skladištenja kako bi se minimizirala degradacija bioaktivnog sastojka tokom roka trajanja komercijalnog proizvoda.

5. Zaključci

Simulirana želučana probava značajno poboljšava rastvorljivost polifenola, polisaharida, antocijanina i feniletanoidnih glikozida za obaLycium ruthenicumprah iCistanche deserticolaprah, a istovremeno povećava aktivnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH kao i ABTS.

U okruženju simulirane crijevne probave, rastvorljivost polifenola i feniletanoidnih glikozida stalno raste, dok se detektivni sadržaji polisaharida i antocijana smanjuju. Intestinalna probava pospješuje kapacitet uklanjanja radikala ABTS, ali ne pokazuje pozitivan promotivni učinak na brzinu uklanjanja radikala DPPH. Polifenoli, antocijanini i feniletanoidni glikozidi predstavljaju značajnu linearnu korelaciju sa antioksidativnim indikatorima. Antocijanini i feniletanoidni glikozidi daju dominantan doprinos antioksidativnom učinku ova dva pustinjska biljna materijala.

Među tri testirane proporcije miješanja, omjer miješanja2 : 1 (Lycium ruthenicum : Cistanche deserticola) postiže najveći sveobuhvatni antioksidativni kapacitet nakon kompletne simulirane gastrointestinalne probavne procedure.

Ovo istraživanje pruža temeljnu eksperimentalnu osnovu za razvoj inovativnih funkcionalno-prehrambenih proizvoda koristeći karakteristikeLycium ruthenicumiCistanche deserticolabiljnih resursa u sjeverozapadnoj Kini.

Priznanja

Ovaj rad je dobio finansijsku podršku od Projekta podrške industriji Univerziteta provincije Gansu (Grant br.. 2021CYZC‑56).

Sukobi interesa

Autori izjavljuju da ne postoji sukob interesa.

Reference

[1] Sun XK, Zhang YY, Zhang XY. Napredak istraživanja mehanizama starenja i terapije protiv starenja. Hrana i lijekovi. 2022;24(1):74-80.

[2] Yan YM, Dai GL, Ran LW. Analiza sastava polifenolaLycium ruthenicumplodovi iz različitih divljih staništa. Scientia Agricultura Sinica. 2014;47(12):2450‑2460.

[3] Gao Y, Tao P, Wang YJ. Studija molekularnog mehanizma antioksidativne aktivnosti feniletanoidnih glikozida izCistanche deserticolana osnovu mrežne farmakologije. Kineski časopis moderne primijenjene farmacije. 2022;39(17):2204‑2215.

[4] Bouayed J, Hoffmann L, Bohn T. Ukupni fenoli, flavonoidi, antocijanini i antioksidativna aktivnost nakon simulirane gastro-intestinalne probave i dijalize sorti jabuka: biodostupnost i potencijalni unos. Hemija hrane. 2011;128(1):14-21.

[5] Mihailović V, Kreft S, Benković ET. Hemijski profil, antioksidativna aktivnost i stabilnost u modelnom sistemu stimulisanog gastrointestinalnog trakta od triVerbascumvrste. Industrijske kulture i proizvodi. 2016;89:141‑151.

[6] Liu YX, Wu YP, Ji BP. Promjene komponenti i antioksidativnog djelovanja polifenola borovnice tokom simulirane gastrointestinalne probave. Časopis Kineskog instituta za nauku i tehnologiju hrane. 2016;16 (10):87‑95.

[7] Ryan L, Prescott SL. Stabilnost antioksidativnog kapaciteta dvadeset pet komercijalno dostupnih voćnih sokova podvrgnutih in-vitro digestiji. International Journal of Food Science & Technology. 2010;45 (6):1191-1197.

[8] 那吉 N, Zhang HF, Yang FY. In-vitro simulirana gastrointestinalna probava utječe na antioksidativne komponente i aktivnost kuhanog pirinča od tartarske heljde. Moderna hrana. 2022;28 (2):219‑223.

[9] Bermúdez-Soto MJ, Tomás-Barberán FA, García-Conesa MT. Stabilnost polifenola u aroniji podvrgnutoj in-vitro probavi želuca i pankreasa. Hemija hrane. 2007;102 (3):865‑874.

[10] O Sánchez-Velázquez, Mulero M, Cuevas-Rodríguez EO. In-vitro gastrointestinalna probava utječe na stabilnost, biodostupnost i antioksidativno djelovanje polifenola iz divljih i komercijalnih kupina. Hrana i funkcija. 2021;12 (4):1‑21.