ABSTＲACT

Cilj: Pojasniti da li uopštenocistanozidi(GC) poboljšavakognitivna disfunkcijaubrzano starenje miševa (SAMP8) posredovanjem specifičnih androgenih receptora (AＲ) uregulacija ekspresije sinaptičkog proteina． 

Metode: Ukupno 76 7-mjesečnih mužjaka miševa SAMP8 nasumično je podijeljeno u grupu modela, GC grupu, GC + flutamid (F) grupu, GC + fulvestrant (ICI) grupu, F grupu i ICI grupu. Funkcije učenja i pamćenja miševa u svakoj grupi testirane su pomoću Morrisovog vodenog lavirinta. Western blotting i RT-PCR su korišteni za testiranjenivo ekspresije sinaptofizina( SYN), postsinaptička gustoća - 95 ( PSD - 95) i neurotrofni faktor koji potiče od mozga (BDNF) miševa u svakoj grupi.

Rezultati: GC-ovi su značajno poboljšali učenje i kognitivne funkcije SAMP8 miševa.

U poređenju sa GCs grupom, funkcija učenja i pamćenja miševa u GCs + F grupi i GCs + ICI grupi bila je značajno smanjena. Western blotting i RT-PCR rezultati su pokazali da je nivo ekspresije BDNF, SYN i PSD－ 95 značajno povećan na nivou proteina i gena u GC grupi u poređenju sa grupom Model (P ＜ 0． {{ 11}}5) . Nivo ekspresije SYN je povećan u grupi GCs + F i GCs + ICI, a nivoi ekspresije BDNF i PSD － 95 su značajno smanjeni u GCs + F i GCs + ICI grupi u poređenju sa GC grupom (P ＜ 0． 05) ．

Zaključak: GC mogu specifično posredovati AＲ kako bi se poboljšala sinaptička plastičnost kod SAMP8 miševa, što zauzvrat poboljšava učenje i kognitivne funkcije.

KLJUČNE RIJEČI:Opći cistanozidi; androgeni receptor; Sinaptička plastičnost; SAMP8 miševi

Cistanche dodatak za poboljšanje kognitivnih funkcija Dodatak prehrani PhGs75% Ech 30% Act 12%

Alchajmerova bolest(AD) je uobičajenoneurološke degenerativne bolesti, klinički karakteriziran progresivnim padom kognitivnih funkcija i promjenama mentalnog i psihičkog statusa [1]. Istraživanja su pokazala da je nivo testosterona kod muških pacijenata sa AD značajno niži nego kod normalnih muškaraca.

Thekognitivne funkcije pacijenataje poboljšan u različitom stepenu nakon toganadomjesna terapija ketonima[2], što ukazuje da smanjenje nivoa androgena u vezi sa godinama može biti faktor rizika za AD kod starijih muškaraca.

Cistanche deserticola ukupni glikozidi (opšti cistanozidi, GC) su jedan od glavnih ekstrakata Cistanche deserticola, koji može poboljšati učenje vezano za AD ikognitivna disfunkcija[3]. Osim toga, primjena GC-a putem sonde značajno je povećala nivoe testosterona kod životinja [4]. GC također imaju funkciju promoviranja janga i mogu djelovati

Farmakodinamički efekti slični androgenu. Prethodne studije su izvijestile da testosteron može poboljšati učenje i kognitivne funkcije životinja modela AD, a ovaj proces se oslanja na specifični androgeni receptor (androgen receptor, AR) posredovan [5].

Dobro je poznato da je kognitivna disfunkcija kod pacijenata sa AD usko povezana sa sinaptičkom plastičnošću. Međutim, još uvijek je nejasan specifični mehanizam putem kojeg GC reguliraju sinaptičku plastičnost i time poboljšavaju učenje i kognitivne funkcije. Ova studija imala je za cilj da istraži da li GC posreduju u specifičnom ARＲ da utječu na sinaptičku plastičnost i na taj način poboljšaju učenje i kognitivne funkcije u AD.

1 Materijali i metode

1. 1 Eksperimentalne životinje i oprema

Mužjaci 3-mjesečnih SAMP8 miševa kupljeni su sa Medicinskog fakulteta Univerziteta u Pekingu (SCXK [Peking] 2016-0010) i uzgajani su do 7 mjeseci. Životinje su držane u čistom okruženju na (24 ± 1) stepen i

Životinjama je omogućeno prirodno osvjetljenje, slobodan pristup hrani i vodi, a humanitarna skrb je pružena u skladu sa 3R principima za korištenje eksperimentalnih životinja. Ovu eksperimentalnu studiju odobrio je Odbor za eksperimentalnu etiku životinja Medicinskog fakulteta Baotou (Baotou Medical College br. 20201102).

Glavni reagensi u eksperimentu su:Cistanche deserticola ukupni glikozidi(GCs, Xi'an Ciyuan Biological Co., Ltd.); antagonist androgenih receptora-flutamid (Sigma Company, SAD); antagonist receptora estrogena-fulvestrant (ICI 182780, SAD) Med Chem Express); Zečja anti-mišja BDNF antitijela,

PSD-95 antitijelo, SYN antitijelo, -aktinsko antitijelo (Proteintech Company iz Sjedinjenih Država); rastvor za elektroforezu proteina, rastvor za transfer proteina, TEMED, akrilamidni pufer, amonijum persulfat, Tris (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.); Komplet za sintezu cDNA, kvantitativna detekcija fluorescencije talenta

Komplet reagensa (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.), itd. Glavna eksperimentalna oprema uključuje rezervoar za elektroforezu vertikalne ploče, aparat za elektroforezu, rezervoar za prenos, šejker za uklanjanje boje (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), sistem za analizu proteinskog gela (Shanghai Tanon Technology Co., Ltd.), fluorescentni kvantitativni PCR instrument u realnom vremenu (SAD Roche) itd.

1. 2 Grupisanje i administracija

Dva miša su umrla prirodno tokom procesa hranjenja, a preostalih 78 miševa je nasumično podijeljeno u modelsku grupu, GCs grupu, GCs + flutamid (F) grupu, GCs + fulvestrant (ICI) grupu, F grupu, ICI

Grupe od po 13 životinja. Osim grupe modela, F grupe i ICI grupe, ostale grupe su kontinuirano davale GC u dozi od 50 mg/(kg·d) tokom 30 dana.

Od 24. dana nakon primjene GC, grupa GC + flutamid (F) i GC + fulvestrant (ICI) grupa su dobile intraperitonealnu injekciju F (5 mg/kg/d) 30 minuta nakon primjene GC-a gavagom. ), ICI (1 mg/kg/d), kontinuirana injekcija 7 dana. Podesite koncentraciju doziranja kako biste osigurali da maksimalni volumen želuca kod miševa bude 0,5 mL, 1 put/d.

1. 3 Morrisov test vodenog lavirinta

Miševi su se prilagodili vodenom okruženju jedan dan unaprijed. Morrisov vodeni lavirint je trajao 6 dana. Prvih 5 dana bio je test pozicioniranja i navigacije. Miševi su trenirani jednom dnevno u svakom od četiri kvadranta po 1 minut svaki put. Svaki interval treninga bio je 15 minuta, a zapisi su se snimali u isto vrijeme. Izbjegavanje latencije testa pozicioniranja i navigacije životinje; 6. dana izvadite platformu iz vode i izvršite test istraživanja svemira. Zabilježite broj prelazaka platforme i postotak vremena provedenog u ciljnom kvadrantu miša. ciljni kvadrant) i trajektorija plivanja za istraživanje prostora (Swimming trajectory of spatialprobe test) i drugi indikatori.

1. 4 Western blot detekcija

Ekspresija proteina vezanih za SYN, PSD-95 i BDNF sinapse. Nakon Morrisovog testa vodenog lavirinta, svi miševi su rutinski anestezirani, glave su im odsječene, mozak im je izvađen, a hipokampusi su im otkinuti. Hipokampalno tkivo je proteinsko lizirano, poremećeno ultrazvukom na 4 stepena, ostavljeno na ledu 30 minuta i centrifugirano na 12,000 r/min 15 minuta na 4 stepena. Uzet je supernatant, a koncentracija proteina je mjerena BCA metodom. Nakon punjenja proteina, izvršite slaganje gel elektroforezu pri konstantnom naponu od 80 V, elektroforezu separacije u gelu pri konstantnom naponu od 120 V i mokri transfer pri konstantnom protoku od 300 mA; izvadite PVDF membranu, blokirajte je sa 5% obranog mlijeka na 80 minuta na sobnoj temperaturi i operite membranu tri puta sa TBST. 15 min/vreme, primarno antitelo je inkubirano preko noći na stolu za mućkanje na 4 stepena; sledećeg dana, membrana je isprana 3 puta sa TBST.

15 min/vreme, sekundarno antitelo je inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 2 h, zatim je izvršen razvoj ECL boje, a snimanje je izvedeno hemiluminiscentnim sistemom za snimanje. -aktin je korišten kao interna referenca, a vrijednost optičke gustine trake je analizirana pomoću softvera Image J.

1. 5ＲRT－PCRＲDetekcija

Ekspresija mRNA SYN, PSD-95 i BDNF ekstrahovana je iz ukupne RNK hipokampalnog tkiva prema metodi ekstrakcije Trizol, a cDNK je generisana nakon reverzne transkripcije. Za kvantitativnu detekciju relativne fluorescencije korišten je komplet za kvantitativnu detekciju fluorescencije Talent. Eksperiment je ponovljen tri puta, a rezultati su konvertovani u 2 - ΔΔCT je analiziran. Mišji -aktin, SYN, PSD-95 i BDNF prajmeri su dizajnirali Shanghai Sangon Company, a sekvence prajmera su prikazane u tabeli 1.

1. 6 Statistička analiza

Preko SPSS 25. 0 statističkog softvera za obradu, softver Graphpad Prism 8 je korišten za crtanje statističkih grafikona, a jednosmjerna ANOVA je korištena za poređenje parnih srednjih vrijednosti više uzoraka. P < 0. 05 znači da je razlika statistički značajna.