Učinci četiri kineska biljna ekstrakta na stanice karcinoma malih stanica pluća osjetljive na lijekove i na više lijekova
Feb 19, 2022
David SadavaJulie Ahn Mei Zhan Mei-Lin PangJane DingSusan E. Kane
Apstraktna svrha:Ispitivali smo farmakologiju, ćelijsku biologiju i molekularnu biologiju malih stanica karcinoma pluća tretiranih sa četiri ekstraktaKineski biljni lekovi. Mnogi bolesnici od raka uzimaju ove lijekove, ali njihovi efekti na ćelijskom nivou su uglavnom nepoznati. Posebno su nas zanimali efekti na ćelije rezistentne na lijekove, jer je rezistencija značajan klinički problemkarcinom plućar. Metode: Osjetljive na lijekove (H69), multirezistentne na lijekove (H69VP) i normalne epitelne ćelije pluća (BEAS-2) bile su izložene ekstraktima dvije biljke koje se koriste u kineskoj biljnoj medicini zarak pluća: Glycyrrhiza glabra (GLYC) i Olenandria diffusa (OLEN), te ekstraktima dvije komercijalno dostupne kombinacijeKineski biljni lekovi, SPES (15 biljaka) i PC-SPES (8 biljaka). Citotoksičnost je mjerena u smislu inhibicije rasta stanica (IC50). Kinetika fragmentacije DNK nakon izlaganja biljnim ekstraktima izmjerena je BudR označavanjem nakon čega slijedi ELISA. Apoptoza je mjerena TUNEL testom nakon čega je uslijedila protočna citometrija. Ekspresija gena povezanih s apoptozom i ćelijskim ciklusom mjerena je reverznom transkripcijom mRNA praćenom hibridizacijom filtera na nizove sondi i detekcijom hemiluminiscencijom. Rezultati: U svakom slučaju, četiri biljna ekstrakta bila su podjednako citotoksična za H69 i H69VP i manje citotoksična za BEAS-2. Sva četiri ekstrakta izazvala su fragmentaciju DNK u ćelijama karcinoma pluća. Kinetika je pokazala da su fragmenti DNK pušteni u medijum (indikacija nekroze) u kulturama izloženim GLYC-u, ali unutar ćelija (indikacija apoptoze) u kulturama izloženim OLEN-, SPES- i PC-SPES. TUNEL analiza je potvrdila da je izlaganje posljednja tri ekstrakta, ali ne i GLYC, dovelo do apoptoze. U poređenju sa netretiranim i GLYC-tretiranim ćelijama, ćelije H69 i H69VP tretirane sa OLEN, SPES i PC-SPES pokazale su povišenu ekspresiju brojnih gena uključenih u apoptotičku kaskadu, slično ćelijama tretiranim etopozidom i vinkristinom.
zaključak:TheKineski biljni lijekekstrakti OLEN, SPES i PC-SPES su citotoksični i za rezistentne i osjetljive na lijekoverak plućaćelije, koje pokazuju određenu specifičnost tumorskih ćelija u poređenju sa njihovim učinkom na normalne ćelije, i proapoptotične su što se meri prekidima DNK i ekspresijom gena. Reakcija tumorskih ćelija na ove ekstrakte bila je slična njihovoj reakciji na konvencionalne hemoterapeutske lekove.
Cistanche, dragocjenKineski biljni lijek, djeluje na jačanje imuniteta irak pluća. Cistanche ima dugu istoriju medicinske upotrebe. Prvi put je snimljen u "Shen Nong's Materia Medica". Shennong je probao sve vrste bilja. Efikasnost i uloga Cistanchea su značajne u jačanju bubrega i njegujućoj esenciji, otklanjanju umora, vlaženju crijeva i defekacije, hranjenju janga i njezi jina itd., tako je zabilježeno u knjizi. Tokom dinastije Tang nakon dinastije, Cistanche je bila navedena kao jedna od devet kineskih vilinskih vrsta trave. Savremena istraživanja o tome provode se više od 60 godina. , protiv starenja, pomaže u poboljšanju pamćenja i imuniteta, itd.
Ključne riječi:Rak pluća, otpornost na lijekove,Kineski biljni lekovi,cistanche
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
Uvod
Mala ćelijarak pluća(SCLC) čini oko 20 posto svihkarcinoma plućai agresivan je, sa 5-godišnjom stopom preživljavanja kod dijagnoze manjom od 10 posto [19]. Pacijenti se obično javljaju s diseminiranom bolešću, pa je liječenje kemoterapijom, s kombinacijama koje obično uključuju cisplatin, etopozid, doksorubicin, 5-fluorouracil i taksol [12]. Nažalost, ovaj tretman na kraju postaje neefikasan jer većina SCLC tumora razvija rezistenciju na više lijekova [18]. Budući da postoji mnogo mehanizama rezistencije [15], prevladavanje rezistencije je veliki klinički izazov.
Suočeni s palijativnom skrbi, mnogi bolesnici od raka koriste alternativne lijekove, uključujući biljne terapije [6, 23]. Među ovim terapijama, tradicionalna kineska medicina je vjerojatno najbolje uspostavljena i kodificirana, datira nekoliko hiljada godina unazad. Teorijska osnova ovog medicinskog sistema tiče se suprotstavljenih sila jin i jang, generativnih i destruktivnih ciklusa i životne sile, ili či [2]. Specifični biljni ekstrakti i kombinacije osmišljeni su za liječenje specifičnih bolesti uključujući rak [11, 27]. Iako postoje neki empirijski dokazi da su biljke efikasne u liječenju raka, njihovi mehanizmi djelovanja na ćelijskom nivou su uglavnom nepoznati. Ovo dobija dodatnu važnost ako pacijenti kombiniraju njihovu upotrebu s konvencionalnom kemoterapijom. Također, nisu prijavljeni efekti biljnih ekstrakata na rezistenciju na lijekove.
Istraživali smo efekte četiriKineski biljni lekovina tri ćelijske linije: SCLC, SCLC otporan na više lijekova i normalan epitel pluća. Dva od četiri ekstrakta bila su iz pojedinačnih biljaka koje se često propisuju za rak pluća, Glycyrrhiza glabra (GLYC) i Olenandria diffusa (OLEN). Ostale dvije bile su iz komercijalno dostupnih kombinacija biljaka pod nazivom SPES i PC-SPES. OLEN (kinesko ime Bai Hua she cao) ima antitumorsko, antimutageno i imunostimulirajuće djelovanje [1, 25, 29]. GLYC (kineski naziv gan car) je protuupalni, antitumogeni i antimutageni [7, 11]. SPES, koji je razvio BotanicLabs (Brea, Kalifornija), u obliku je kapsula koje sadrže liofilizirane ekstrakte 15 kineskih biljaka i pokazalo se da smanjuje bol kod pacijenata s uznapredovalim karcinomom [14]. Među biljkama u SPES-u su imunostimulansiCistanchedeserticola, antitumorsko sredstvo Rabdosia rubescens i protuupalno sredstvo Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, koji također priprema BotanicLabs, sadrži osam biljaka, uključujući antiandrogeni Serenoa repens koji inhibira hiperplaziju prostate [21], inhibitor protein kinaze C Scutellaria baicalensis [13], antitumorski agens Panax ginseng [30] i Glycyrrhiza glabra ( vidi gore). Iako nedostaju rigorozni dokazi za kliničku antitumornu efikasnost GLYC, OLEN i SPES, postoje neki dokazi za efikasnost PC-SPES. I u ćelijama raka prostate i na životinjskim modelima, PC-SPES je proapoptotičan i citotoksičan [8, 9, 10, 28]. Klinička ispitivanja su pokazala da je efikasan u snižavanju nivoa prostate specifičnog antigena i u zaustavljanju rasta tumora i kod androgen-zavisnog i kod androgen-nezavisnog karcinoma prostate [4, 5, 17, 20, 26].
Iako oboljeli od raka nesumnjivo koriste biljne ekstrakte, postoje oskudni pretklinički ili klinički podaci o učincima ovih ekstrakata na SCLC. Naš cilj je bio da započnemo ovu analizu ispitivanjem farmakologije (citotoksičnosti), ćelijske biologije (metoda ćelijske smrti) i molekularne biologije (ekspresija gena) u SCLC stanicama osjetljivim na lijekove i rezistentnim na lijekove.
materijali i metode
Ekstrakti i hemikalije
GLYC i OLEN su dobijeni kao osušene biljke od Jen-On Medical Group (Monterey Park, Kalifornija). Za pripremu ekstrakta, 0.5 g je mljeveno u fin prah sa malterom i tučkom i suspendovano u 30 ml destilovane vode. U kineskoj medicini, biljni ekstrakti se konzumiraju kao čajevi nakon zagrijavanja. Zbog toga je suspenzija inkubirana uz mućkanje na 70 stepeni 18 h. Nakon centrifugiranja na 1500 g tokom 10 minuta, supernatant je steriliziran filtriranjem kroz 045- lm filter pomoću šprica. Dobiveni ekstrakt je podešen destilovanom vodom na 17 mg/ml na osnovu originalnog biljnog materijala. Ekstrakti su čuvani na 4 stepena do 1 nedelje do upotrebe.
SPES i PC-SPES su dobijeni od BotanicLabs (Brea, Kalifornija) kao kapsule. Metoda ekstrakcije korištena je u prethodnim studijama ovih preparata [8, 9, 10]. Sadržaj jedne kapsule (320 mg) je rastvoren u 1 ml 95% etanola i suspenzija je inkubirana uz mućkanje na 37 stepeni 1 h. Nakon centrifugiranja na 3000 g u trajanju od 10 minuta, supernatant je filtriran i steriliziran kao gore. Konačna koncentracija je bila 300 mg/ml na osnovu originalnog biljnog materijala. Ekstrakti su čuvani na -20 stepeni do 1 nedelje do upotrebe.
Ćelijske kulture i mjerenje citotoksičnosti
NCI-H69 SCLC ćelije su uzgajane na 37 stepeni u atmosferi koja sadrži 5 procenata CO2 kao suspenziju u medijumu bez seruma AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY). Ćelijska linija otporna na više lijekova (H69VP) odabrana u etopozid [16] također je uzgajana u AIM-V i pokazala je unakrsnu rezistenciju na etopozid (9- puta), doksorubicin (20- puta) i vinkristin (10-fold) (podaci nisu prikazani). Ove ćelije imaju višestruke mehanizme rezistencije na lekove, uključujući promene u topoizomerazi II i ekspresiju membranskih pumpi, MDR1 i MRP. BEAS-2 normalne epitelne ćelije pluća [22] su uzgajane u DMEM-F12 sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma.
Za ispitivanje citotoksičnosti, ekstrakti su dodani kako je naznačeno u logaritamski rastuće ćelije u 1-ml kulturama koje sadrže 6000 ćelija/ml. Nakon 4 dana kontinuiranog izlaganja, ćelije su prebrojane u Coulter Z-1 brojaču. Brojevi su potvrđeni mikroskopski hemocitometrom nakon bojenja tripan plavim. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka i ponovljeni najmanje tri puta. Vrijednosti IC50, definirane kao koncentracija ekstrakta koja je smanjila broj ćelija 4. dana za 50 posto, izračunate su u poređenju sa kontrolama rastvarača. Srednje vrijednosti su izračunate i upoređene pomoću ANOVA za tri ćelijske linije za taj ekstrakt.
Testovi ćelijske smrti
Mehanizam citotoksičnosti istražen je kinetikom ćelijske fragmentacije DNK (Boehringer-Mannheim kit, Indianapolis, Ind.). Ukratko, 5·105 ćelija/ml je inkubirano 16 h na 37 stepeni u atmosferi koja sadrži 5 procenata CO2 u medijumu AIM-V koji sadrži 10 lM BudR. Ćelije su isprane i resuspendirane u količini od 105/ml u mediju bez BudR, a 200 ll ove kulture je inkubirano sa biljnim ekstraktom na 2·IC50 u naznačenom vremenu, nakon čega je uklonjeno 100 ll medijuma za kulturu radi kvantifikacije DNK. fragmenti pomoću ELISA. Ovo je mjera nekroze ćelije. Fragmenti DNK unutar ćelija, nastali apoptozom, mjereni su nakon ćelijske lize u albuminu goveđeg seruma (BSA)/Tween 20 na 21 stepen tokom 30 minuta. Nakon centrifugiranja, lizat je korišten za ELISA.
ELISA je izvedena u mikrotitarskoj ploči sa okruglim dnom obloženom anti-DNK antitelom (monoklonska mišja anti-humana DNK, klon MCA-33) preko noći na 4 stepena. Nakon blokiranja sa BSA, 100 ll rastvora obeleženog DNK fragmenta je dodato u obložene jažice, nakon čega je usledila inkubacija od 90 minuta na 21 stepen. DNK je fiksiran i denaturiran mikrotalasnim zračenjem na 500 W tokom 5 minuta. Dodan je mišji anti-BudR (mišji monoklonalni BMG 6HB) konjugiran sa peroksidazom i, nakon inkubacije u mraku od 120 minuta na 21 stepen, reakcija je zaustavljena dodatkom 500 l koncentrovane H2SO4. Rezultirajuća boja je kvantificirana apsorbancijom na 450 nm. Uzorci tretirani ekstraktom upoređeni su sa netretiranim kontrolama kao pozadinu.
Apoptoza je potvrđena TUNEL analizom. Logaritamski rastuće ćelije su bile izložene biljnom ekstraktu na 1·IC50 tokom 3 h. Zatim su dva puta isprani u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) koji sadrži 1 procenat BSA i resuspendovani u PBS/BSA na 5·105 ćelija/ml. U 500 ll ćelija dodano je 100 ll 4% paraformaldehida i ćelije su fiksirane na 21 stepen 1 h. Nakon ispiranja u PBS, ćelije su resuspendirane u 100 l hladnog pufera za permeabilizaciju (0,1 posto Triton X-100, 0,1 posto natrijum citrata) 2 minute na 4 stepena. Ćelije su dva puta isprane u PBS-u, a zatim resuspendirane u 50 l TUNEL mješavine koja je sadržavala terminalnu deoksiribonukleotid-idil transferazu (TdT) i fluorescein-dUTP (Boehringer-Mannheim komplet). Nakon inkubacije u mraku na 37 stepeni tokom 1 h, ćelije su obojene propidijum jodidom i analizirane protočnom citometrijom.
Analiza ekspresije gena
Kulture (6 ml) logaritamski rastućih ćelija (5·105 ćelija/ml) su inkubirane u medijumu koji sadrži biljni ekstrakt na 1·IC50 na 37 stepeni u atmosferi koja sadrži 5 procenata CO2 tokom 3 h. Nakon dva puta ispiranja u PBS-u, ćelijske pelete su zamrznute na -70 stepeni preko noći. RNK je izolovana RNeasy Mini protokolom (Qiagen, Valencia, Kalifornija). Generalno, ova metoda je dala 0,5 LG RNA. Ova količina RNK je reverzno transkribirana u cDNK i označena biotinom-dUTP, te hibridizirana u denaturirane sonde do gena povezanih s apoptozom i ćelijskim ciklusom na filterima. Hibridizacija je otkrivena vezivanjem alkalne fosfataze-streptavidina za cDNK upotrebom hemiluminiscentnog supstrata, CDP-Star (SuperArray, Bethesda, Md.), nakon čega je uslijedilo izlaganje rendgenskom filmu, općenito 1-2 min.
Ciljevi kontrolnih gena na svakom filteru uključivali su b-aktin i GAP-DH kao pozitivne kontrole i pUC18 kao negativnu kontrolu. Sljedeći geni vezani za ćelijski ciklus i apoptozu bili su mete hibridizacije: bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, kaspaze 1–10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, svinja8, Rb, DR5, trag, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 i DR5. Intenzitethibridizacije je vizuelno ocijenjen u tandem duplikata na filteru u odnosu na pozitivne kontrole.
Rezultati
Naši početni eksperimenti testirali su citotoksičnost ekstrakata kineskih biljaka na SCLC ćelijama osetljivim na lekove i na lekove rezistentnim, kao i na normalnim epitelnim ćelijama pluća. Kao što je prikazano u Tabeli 1, četiri biljna ekstrakta su bila citotoksična u niskim koncentracijama. Ovi nalazi su slični onima nađenim za SPES i PC-SPES u drugim tumorskim ćelijskim linijama [8]. U svakom slučaju, vrijednosti IC50 za ćelije otporne na više lijekova (H69VP) nisu se razlikovale od onih za ćelije osjetljive na lijekove (H69). Također, vrijednosti IC50 za normalne epitelne ćelije pluća bile su značajno veće od onih za ćelijske linije tumora.
Zatim smo istražili mehanizam citotoksičnosti koristeći kinetiku fragmentacije DNK kao indikaciju apoptoze (fragmenti koji se polako formiraju unutar ćelija) ili nekroze (fragmenti koji se brzo formiraju i oslobađaju iz oštećenih ćelija). Ćelije su inkubirane u biljnom ekstraktu između 30 minuta i 8 sati, a zatim su fragmenti DNK procijenjeni ELISA-om u mediju kulture i ćelijskim lizatima. Slika 1 prikazuje reprezentativne podatke za ćelije H69 izložene četiri ekstrakta tokom 90 minuta. Sa tri ekstrakta (SPES, PC-SPES, OLEN), većina fragmenata DNK dolazi iz ćelija (lizati), što ukazuje na apoptozu. Međutim, sa GLYC-om, fragmenti su pušteni u medijum iz oštećenih ćelija, što ukazuje na nekrozu. Slični rezultati su dobijeni sa ćelijama H69VP (podaci nisu prikazani).
Ovi eksperimenti citotoksičnosti su praćeni TUNEL testovima DNK loma in situ. U poređenju sa netretiranim kontrolama (1–3 procenta apoptotičkih ćelija u četiri eksperimenta), SCLC ćelije tretirane SPES (58–85 procenata), PC-SPES (63–77 procenata) i OLEN (49–81 procenat) pokazale su TUNEL pozitivnost, dok ćelije tretirane GLYC nisu (1-2 procenta) (slika 2). Slični rezultati su dobijeni sa H69VP ćelijama (podaci nisu prikazani).
Analizirali smo transkripciju gena kao odgovor na biljne ekstrakte koristeći GeneArrays. Ovi nizovi imaju tandemski raspoređene gene povezane sa ćelijskim ciklusom i apoptozom. Ove eksperimente smo izveli dva puta sa sličnim rezultatima. Slika 3 prikazuje reprezentativne dijagrame nizaautora ćelija H69 izloženih etopozidu ili SPES. Naši rezultati za H69 ćelije su sažeti u Tabeli 2. Dok su netretirane kontrolne grupe imale uočljivu ekspresiju samo nekoliko proučavanih gena, ćelije tretirane konvencionalnim hemoterapijskim lekovima (etopozid i vinkristin) pokazale su snažne signale za određeni broj gena uključenih u ćelijski ciklus regulacija i apoptoza. Ćelije tretirane OLEN-om, SPES-om i PC-SPES-om pokazale su obrazac sličan onima dobijenim sa ova dva lijeka. Općenito, činilo se da ćelije tretirane GLYC-om ne pokazuju ovaj obrazac transkripcije, već su pokazivale snažnu ekspresiju gena za antiapoptozu, BCL-2.
Diskusija
Ove studije smo preduzeli iz dva razloga. Prvo, postoji drevna tradicija kineske biljne medicine koja se temelji na vlastitim teorijama i filozofiji [2], a mi smo željeli da počnemo da razumijemo efekte biljnih lijekova u zapadnim medicinskim terminima. Ove biljke se koriste kao mješavine, i iako je došlo do određenog napretka u njihovom razbijanju na pojedinačne hemijske sastojke[11], naše studije su se fokusirale na njih jer se koriste u tradicionalnoj praksi. Naša druga motivacija bila je da mnogi pacijenti s rakom koriste ove biljke zajedno s konvencionalnim tretmanima [6, 23], a razumijevanje ćelijskih efekata biljaka moglo bi pružiti važne informacije za kliničko donošenje odluka.
Podaci o citotoksičnosti (Tablica 1) pokazali su da su četiri biljna ekstrakta zaista bila citotoksična za ćelije tumora, više na osnovu doze nego za normalne epitelne ćelije pluća, što ukazuje na određenu tumorsku specifičnost i moguće povoljan terapeutski indeks. Sličnosti u IC50 između ćelija osetljivih na lekove i ćelija rezistentnih na više lekova ukazuju na to da na ove ekstrakte ne utiču mehanizmi rezistencije na lekove prikazani u H69VP ćelijama, uključujući prekomernu ekspresiju dva transportera leka, MDR1 i MRP.
Kinetika fragmentacije DNK pokazala je da su ekstrakti SPES, PC-SPES i OLEN proapoptotični, dok je GLYC bio pronerotičan (slika 1). Ovo je potvrđeno TUNEL bojenjem in situ (slika 2). Većina konvencionalnih hemoterapeutskih lekova je proapoptotička [3], a grupa gena za regulaciju apoptoze i ćelijskog ciklusa je pojačano regulisana u ćelijama kao odgovor na lekove [24]. Otkrili smo da je obrazac ekspresije nekih gena izraženih kao odgovor na tri pro app na biljne ekstrakte bio sličan onom uočenom u ovim ćelijama nakon izlaganja konvencionalnim hemoterapijskim lekovima (slika 3, tabela 2). Činilo se da je odgovor na sam GLYC drugačiji, barem u vremenskoj tački analiziranoj u ovim eksperimentima. Zanimljivo je da je GLYC dio PC SPES-a, koji je bio proapoptotičan, dok sam GLYC nije bio. Možda su druge komponente PC-SPES-a odgovorne za njegovu proapoptotičku aktivnost. Iako ovi rezultati ne pokazuju kako su biljni ekstrakti oštetili stanice, oni sugeriraju da stanice H69 reagiraju na oštećenje na molekularnom (transkripcija) i ćelijskom (apoptoza) razinama na način sličan njihovom odgovoru na kemoterapiju.
Naše studije ukazuju na potencijalnu korisnost ovih kineskih biljnih ekstrakata u liječenju SCLC, posebno bolesti otporne na lijekove.
PriznanjaZahvaljujemo L. Brownu na neprocjenjivoj pomoći sa kolegama iz citometrije i R. Lingemanu na pomoći oko protokola molekularne biologije. BEAS-2 ćelije je velikodušno opskrbio dr. I. Laird-Offringa, Univerzitet Južne Kalifornije, Norris Cancer Center. SPES i PC-SPES su poklon Dr. S. Chena, New York Medical College. Ovo istraživanje podržali su Pritzker Family Foundation i WM KeckFoundation.
Reference
1. Boik J (1996) Rak i prirodna medicina: udžbenik osnovnih nauka i kliničkih istraživanja. Oregon Medical Press, Princeton, str. 221
2. Chan K (1995) Napredak u tradicionalnoj kineskoj medicini. Trends Pharmacol Sci 16:182–187
3. Chu E, DeVita V Jr (2001) Principi upravljanja rakom: kemoterapija. U: DeVita V Jr, Hellman S, Rosenberg SA (ur.) Rak: principi i prakse onkologije. Lippincott Williams i Wilkins, Philadelphia, str. 289–306
4. De la Taille A, Hayek OR, Buttyan R, Bagiella E, Burchart M, Katz AE (1999) Efekti fitoterapeutskog agensa, PC-SPES, na rak prostate. BJU Int 84:845–850
5. DiPaola RS, Zhang H, Lambert G, Meeker R, Licitra E, Rafi M, Spaulding H, Goodin S, Toledano M, Gallo M (1998) Klinička i biološka aktivnost estrogenske biljne kombinacije (PC-SPES) u prostati rak. New Engl J Med 339:785–791
6. Eisenberg DM, Davis RB, Ettner SL (1998) Trendovi u upotrebi alternativne medicine u SAD: 1990–1997: rezultati naknadnog nacionalnog istraživanja. JAMA 280:1569–1575
7. Fenwick GR, Lutomski J, Nieman C (1990) Glycyrrhiza glabra: sastav, upotreba i analiza. Food Chem 38:119–143
8. Halicka HD, Ardelt B, Juan G, Mittleman A, Chen S, Traganos F, Darzynkiewicz Z (1997) Apoptoza i efekti ćelijskog ciklusa izazvani ekstraktima kineskog biljnog preparata PC-SPES. Int J Oncol 11:437–448
9. Hsieh T, Chen SS, Wang X, Wu J (1997) Regulacija androgenog receptora i ekspresije antigena specifičnog za prostatu u ljudskim LNCaP ćelijama prostate koje reaguju na androgen pomoću etanolnih ekstrakata kineskog biljnog preparata PC-SPES. Biochem Mol Biol Int. 42:535–544
10. Hsieh T, Ng C, Chang, C, Chen SS, Mittleman, A, Wu J (1998) Indukcija apoptoze i niska regulacija BCL-6 u Mutu ćelijama tretiranim etanolnim ekstraktima kineskog biljnog dodatka PC-SPES. Int J Oncol 13:1199–1202
11. Huang KC (1999) Farmakologija kineskih biljaka, 2ndedn. CRC Press, Boca Raton
12. Kalemkerian GP, Worden FP (2000) Terapeutski napredak u SCLC. Expert Opin Invest Drugs 9:65–79
13. Kimura Y, Okuda H, Yokio K, Matsushita N (1997) Učinci baicaleina izoliranog iz Scutellaria baicalensis na proizvodnju interleukina 1b-i TNF-inducirano tkivni aktivator plazminogena i inhibitor aktivatora plazminogena-1 u kultiviranim endo stanicama pupčane vene . Phytother Res 11:363–367
14. Lin C (1996.) Opažanje o kombinovanoj upotrebi hemoterapije i tradicionalne kineske medicine za ublažavanje bola od raka. J Tradit Chin Med 16:267–269
15. Mattern J, Volm M (1995) Mehanizmi rezistencije kod raka pluća kod ljudi. Metastaze invazije 15:81–94
16. Minato K, Kanzawa F, Nishio K, Nakagawa K, Fujiwara Y, Saijo N (1990) Karakterizacija humane linije raka pluća malih ćelija otporne na etopozid. Cancer Chemother Pharmacol 26:313-327
17. Moyad MA, Pienta KJ, Montie JE (1999.) Upotreba PC-SPES, komercijalno dostupnog dodatka za rak prostate, kod pacijenata sa bolešću koja nije bila hormonska. Urology 54:319–324
18. Nishio K, Nakamura T, Koh Y, Suzuki H, Fukumoto N, Saijo N (1999) Rezistencija na lijekove kod raka pluća. Curr Opin Oncol 11:109–115
19. Pass H, Mitchell JB, Johnson DH, Turrisi AT, Minna J (2000) Rak pluća: principi i praksa. Lippincott, Philadelphia
20. Pfeifer BL, Pirani JF, Hamann SR, Klippel KF (2000) PC SPES: dodatak ishrani za liječenje hormonski refraktornog raka prostate. BJU Int. 85:481–485