Utjecaj crijevne barijere i crijevne mikrobiote Cistanche feniletanol glikozida na micealkoholnu bolest jetre
Mar 18, 2024
sažetak:
Cilj:Model mišaalkoholno oboljenje jetre(ALD) je ustanovila Lieber-Decarli alkoholna tečna hrana i efektiCistanche feniletanoidni glikozidi(CPhGs) o crijevnoj barijeri i sastavu crijevne mikrobiote kod ALD miševa.
Metoda: 36 ženki miševa C57BL/6N su nasumično podijeljene normalna grupa, CPhGs normalna grupa, grupa modela i CPhGs niske, srednje i visoke doze grupe (175 mg·kg-1, 350 mg·kg{{6 }}i 700 mg·kg-1), sa 6 miševa. Uspostavljanje ALD modela miša koristeći Lieber-Decarli alkoholnu tečnu hranu. Grupi koja je primala CPhGs i normalnoj grupi CPhGs je davan CPhGs by gavaža dnevno u odgovarajućim dozama. Automatski biohemijski analizator je detektovao nivoe ALT, AST, TG i TC u serumu. SerumTNF-, IL-1, LPS, LBP, D-LA, DAO i LBP jetre detektovani su ELISA testom. Nivoi TG i TC u uzorcima homogenata jetre detektovani su kolorimetrijom. Tkivo jetre je obojeno uljnom crvenom O i HE bojenjem. Tkiva crijeva su obojena HE i AB-PAS bojenjem i Muc2 imunohistohemijom. Prikupljen je crijevni sadržaj normalne grupe, normalne grupe CPhG, grupe modela i grupe visokih doza CPhG, a mikrobiota crijeva je sekvencionirana.
Rezultat: ALD model je uspješno uspostavljen. U poređenju sa normalnom grupom, nivoi serumskih ALT, AST i TG, te nivoi jetrenih TG i TC u grupi modela su značajno povećani (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01).
zaključak: CPhG mogu smanjiti ozljedu crijevne barijere uzrokovanu ALD, koji možeigraju zaštitnu ulogu regulišući brojnost i strukturu Akkermansia i Allobaculumai utiče na homeostazu sluznog sloja crijevne mukozne barijere.
Ključne riječi:CPhGs; alkoholno oboljenje jetre; crijevna barijera; mikrobiota crijeva
PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 40% EHINAKOZIDA I 16% AKTEOZIDA ZA
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Alkohol je postao jedan od važnih faktora rizika zahronične bolesti širom sveta."Globalni izvještaj o alkoholu i zdravlju 2018" koji je objavila Svjetska zdravstvena organizacija pokazuje da je oko 3 miliona ljudi umrlo zbog prekomjerne upotrebe alkohola širom svijeta u 2016. godini, što čini 5,3% od ukupnog broja [1]. U našoj zemlji bolesti jetre uzrokovane alkoholom iz godine u godinu su sve veće i drugi su po veličini uzrok ciroze jetre [2], koja je postala ozbiljan javnozdravstveni problem. Mehanizmi nastanka i progresije alkoholne bolesti jetre (ALD) su složeni i brojni, uglavnom mehanizam oštećenja jetre metabolita etanola acetaldehida i reaktivnih vrsta kiseonika [3]. Među njima, uloga "osovine crijeva-jetra" u napredovanju ALD je bila. Privukla je značajnu pažnju [4-5]. Jetra je glavno mjesto za oksidativni metabolizam alkohola. Dugotrajno teška konzumacija može direktno oštetiti jetru, što dovodi do pojave ALD [6]. Steatoza jetre je rana reakcija nakon konzumiranja alkohola. Mikrobiota ljudskog crijeva (GM) procjenjuje se na 10 triliona [7]. Mikroekološka ravnoteža sastavljena od crijevne flore, virusa, gljivica i metabolita.
Ravnoteža, odnosno mikroekologija crijeva, usko je povezana s napredovanjem ALD kroz "os crijeva-jetra", ali relevantni mehanizmi su još uvijek nejasni [8-9]. Crijevna barijera i flora dominiraju "osom crijeva-jetra", a GM disregulacija i prekomjerna ekspresija inflamatornih faktora igraju važnu ulogu u nastanku i razvoju ALD [10-11].
Studije su otkrile da se teška GM disregulacija i prekomjerna ekspresija inflamatornih faktora javljaju tokom pojave i razvoja ALD [12]. Dugotrajni hronični unos ili kratkotrajni unos velikih količina alkohola će promijeniti crijevnu permeabilnost, uzrokujući da crijevni LPS uđe u cirkulaciju portala, izazivajući upalni odgovor i pogoršavajući oštećenje jetre [12-13].
Cistanche, kao karakterističan kineski medicinski materijal u Xinjiangu, zabilježen je u Wu Puovoj Materia Medica iz dinastija Wei i Jin, "Compendium of Materia Medica" iz dinastije Song i "Compendium of Materia Medica" iz dinastije Ming [14]. ]. Moderna farmakološka istraživanja su otkrila da Cistanche feniletanoidni glikozidi (CPhG) igraju važnu ulogu u anti-inflamaciji i anti-hepatičnoj fibrozi [15-16]. Međutim, trenutno nedostaju istraživanja o tome mogu li CPhG regulirati funkciju crijevne barijere ili crijevnu floru kod ALD i imati hepatoprotektivni učinak.
Ova studija je koristila Lieber-Decarli alkoholnu tečnu hranu za uspostavljanje kratkoročnog mišjeg modela alkoholne ozljede jetre Nacionalnog instituta za zloupotrebu alkohola i alkoholizma (NIAAA) [17] kako bi se istražio učinak CPhG-a na crijevnu mikroekologiju ALD. Uticaj. Posebna pažnja posvećena je učincima CPhG na funkciju crijevne barijere i homeostazu crijevne mikrobiote kod miševa ALD modela. Ovo pomaže da se otkrije hepatoprotektivni mehanizam CPhG-a iz perspektive crijevne mikroekologije i pruža eksperimentalnu referencu za razvoj lijekova.
1. Materijali
1.1 Životinje
SPF grade C57BL/6N ženke miševa, 17~20 g, kupljene su od Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., broj certifikata SCXK (Peking) 2021-0006. Životinje su uzgajane i eksperimenti su sprovedeni u SPF okruženju Centra za eksperimente na životinjama Medicinskog univerziteta Xinjiang (SYXK (novo) 2022-0003). strog
Poštujte dobrobit životinja i etičke zahtjeve Komiteta za eksperimentalnu etiku životinja Medicinskog univerziteta Xinjiang (IACUC-20220127-4).
1.2 Reagensi
Apsolutni etanol, izopropil alkohol (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, serijski brojevi 20230201 i 20190103, respektivno); Lieber-Decarli kontrolna tečna hrana, Lieber-Decarli alkoholna tečna hrana (Daitz Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd., brojevi serije za 710027 i 710260);
Paraformaldehidni fiksativ, Carnoyev fiksator i fiksator za elektronski mikroskop (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., brojevi serije CR2208028, CR2305094 i CR2210001); LBP komplet za enzimski imunosorbentni test (ELISA), komplet za TNF-ELISA, IL-1
ELISA komplet, D-LA ELISA komplet, DAO ELISA komplet, TG kolorimetrijski test i TC kolorimetrijski test kit (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd., brojevi serije su CV072V649815, CV112VX05028, CV106T8F74)
GY010XN08244, GY03P04Z5104 i GY02DHB82603); LPS ELISA komplet (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd., serijski broj U3126I069T); ALT set za analizu, AST komplet za analizu, komplet za TG test i komplet za TC (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. Co., Ltd., brojevi serije su 140122014, 140223002, 141722001 i 1417); HE otopina za bojenje, zasićena otopina za bojenje Oil Red O, otopina za bojenje AB-PAS; Muc2 primarno antitijelo, kozje anti-mišje sekundarno antitijelo (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., brojevi serije su G1005, G1015, G1049, GB11344 i GB23301 respektivno).
1.3 Droge
Ekstrakt Cistanchea je kupljen odXinjiang Hotan Dichen Pharmaceutical and Biological Co., Ltd. (ehinaceazid veći ili jednak 40%, verbaskozid veći ili jednak 16%, feniletanoid glikozid veći ili jednak 85%, serijski broj 20230103).
1.4 Instrumenti
BS-240VET automatski biohemijski analizator (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); HT7800 transmisioni elektronski mikroskop (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., Japan).
2. Metoda
2.1 Grupisanje i uspostavljanje životinjskog modela
36 miševa je nasumično podijeljeno u normalnu grupu, grupu za normalnu primjenu, grupu modela i grupe niske, srednje i visoke doze CPhGs (175 mg·kg-1, 350mg·kg-1 i 700 mg·kg{{ 6}}), svaka Grupa od 6. Svim miševima je prvo dato Lieber-Decarli kontrolnu tečnu hranu i prilagođeno je hraniti se 3 dana. normalno
Kontrolna grupa i grupa sa normalnom dozom hranjene su Lieber-Decarli kontrolnom tekućom hranom; grupa modela i grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama CPhG hranjene su LieberDecarli alkoholnom tečnom hranom. Počevši od 4. dana eksperimenta, grupa modela i grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama CPhGs postepeno su povećavale koncentraciju alkohola u hrani sa 0% na 5%, i održavale koncentraciju alkohola od 5% do na kraju eksperimenta, i pritisnuti 9 sati prije prikupljanja materijala. 0.2 mL·10 g-1 je primijenjeno u želudac sa 30% etanolom.
Sva hrana je sada pripremljena i korištena, a svježa hrana se mijenja svaki dan od 17:00 do 19:00. Posmatrajte miševe kako jedu, aktivnost i mentalno stanje svaki dan. Kada se miševi u grupi modela pojave u pijanom stanju poput bezvoljnosti, smanjene aktivnosti i smanjenog unosa hrane, to ukazuje da je modeliranje uspješno [17]. Kada su grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama CPhG i grupa sa normalnom primenom počele da hrane alkoholnom hranom, rastvor CPhGs odgovarajuće koncentracije davan je svaki dan ukupno 14 dana, a normalni fiziološki rastvor je davan za ostatak.
2.2 Opšte napomene
Jedenje, aktivnost, mentalno stanje i izlučivanje miševa su posmatrani svaki dan; tokom modeliranja i primjene lijeka zabilježena je smrtnost i težina miševa. Koeficijent organa=masa organa/(masa tijela/100)×100%.
2.3 Odabir pokusnih životinja
Nakon 12 sati uskraćivanja hrane i vode, miševi su anestezirani, očne jabučice su im uklonjene i krv je uzeta prije žrtvovanja. Tkivo jetre iz najvećeg režnja fiksirano je u otopini paraformaldehida. Jejunalno tkivo je brzo odvojeno na ledu i fiksirano u fiksatoru za elektronski mikroskop; Odvojeno je 3 cm tkiva jejunala i debelog crijeva (bez ispiranja sadržaja) i fiksirano u Carnoyov fiksativ. Još 3 cm tkiva jejunuma i debelog crijeva (sadržaj ispran fiziološkom otopinom) fiksirano je u otopini paraformaldehida. Sadržaj svih intestinalnih segmenata je sakupljen u sterilne krioakule bez enzima, brzo zamrznut u tečnom azotu, a zatim prebačen u frižider na -80 stepeni radi skladištenja.
2.4 ELISA i kolorimetrijska detekcija indikatora homogenata seruma i tkiva jetre
Automatski biohemijski instrument je korišćen za detekciju nivoa ALT, AST, TG i TC u serumu; ELISA metoda je korištena za otkrivanje nivoa TNF-, IL-1, LPS, LBP, DAO i D-LA u serumu, te nivoa LBP u jetri. Radite prema uputama. Za homogenizaciju jetrenog tkiva uzmite 0.05~1.00 g svježeg tkiva jetre, dodajte izopropil alkohol na 2~8 stepeni u skladu s omjerom težine (g): zapremina (mL) { {9}}:9, samljeti do homogenizacije i centrifugirati na 20000g·min-1 15 min, uzeti supernatant i staviti ga na led radi testiranja i raditi prema uputstvima. Kolorimetrijska detekcija nivoa TG i TC u uzorcima homogenata tkiva jetre.
2.5 Bojenje HE i Oil Red O za otkrivanje patologije tkiva jetre
Za bojenje hematoksilin-eozinom (HE), fiksirano tkivo jetre je uklonjeno, parafinski rez, obojeno HE, te dehidrirano i montirano. Fiksno tkivo jetre je izvađeno, zamrznuto izrezano, isprano izopropil alkoholom, obojeno Oil Red O, zapečaćeno i posmatrano pod svjetlosnim mikroskopom.
2.6 Bojenje HE i AB-PSA za otkrivanje patološkog promatranja crijevnog tkiva
Tkivo jejunala je uklonjeno i fiksirano u otopini paraformaldehida za HE bojenje; Tkivo debelog crijeva je uklonjeno i fiksirano u Carnoy-ov fiksator za AB-PAS bojenje. Koraci imunohistohemije: dehidrirati parafinske sekcije, uzimanje antigena, blokirati endogenu peroksidazu, blokirati serum, dodati primarno antitijelo, dodati sekundarno antitijelo, neutralizirati ćelijska jezgra nakon razvoja boje, dehidrirati i montirati, te promatrati pod svjetlosnim mikroskopom. Tkivo jejunala je uklonjeno, izrezano na male komadiće 1 mm × 1 mm × 1 mm, fiksirano predmenstrualno, naknadno fiksirano, dehidrirano, ugrađeno, polimerizirano i ultratanko isječeno. Promjene mikroresica epitelnih ćelija jejunala u svakoj grupi promatrane su pod transmisijskim elektronskim mikroskopom.
2.7 Sekvenciranje i analiza crijevne flore 16S metodom
Sadržaj crijeva normalne grupe, normalne grupe za doziranje, grupe modela i grupe visoke doze CPhGs, na osnovu V3-V4 regije 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') i 806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT -3'), koristeći tehnologiju sekvenciranja visoke propusnosti 16S rDNA za sekvenciranje bakterijske zajednice. Eksperiment sekvencioniranja u ovoj studiji je završio Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. Podaci sekvencioniranja crijevne mikrobiote u ovoj studiji su postavljeni u Nacionalni centar za informacije o biotehnologiji pod brojem projekta PRJNA1006676.
Na osnovu rezultata analize varijanti sekvence amplikona (ASV), vrše se analiza alfa diverziteta, beta diverziteta, anotacija klasifikacije vrsta i analiza razlika. Među njima, Alfa indeks raznolikosti uglavnom uključuje Shannon indeks i Chao1 indeks, a statistički test koristi Wilcoxon test; PCoA
Analiza glavnih koordinata (PCoA) izvedena je pomoću Anosima za analizu razlika između grupa; LEfSe je korišten za analizu LEfSe) kako bi se dobile vrste sa značajnim razlikama između grupa. Bioinformatička analiza je izvršena pomoću alata Bioincloud Platform (https://www.bioincloud.tech) Microtech Alliance.
2.8 Statistička analiza
Svi podaci mjerenja su opisani kao igh̅± 𝑠. Za podatke koji zadovoljavaju normalnu distribuciju i zadovoljavaju test homogenosti varijanse, koristi se jednofaktorska analiza varijanse. U suprotnom, koristi se neparametarski test. Podaci se statistički analiziraju pomoću SPSS 24.0. P<0.05 means the difference is statistically significant.
