Učinak ekstrakta Cistanche Tubulosa na mušku reproduktivnu funkciju kod dijabetičkih štakora izazvanih streptozotocinom-nikotinamidom-Ⅰ

1. Uvod

Dijabetes melitus (DM) je stanje u kojem su povećanenivoa glukozeu krvi zbog neefikasnosti pankreasa u proizvodnji dovoljno inzulina, ili nemogućnosti tijela da ga efikasno koristi. Prema WHO, broj ljudi sa dijabetesom porastao je sa 108 miliona u 1980. na 422 miliona u 2014. [1]. Postoje četiri glavne kategorije: preddijabetes (faza prije dijabetesa), tip 1 (gdje gušterača ne proizvodi inzulin), tip 2 (tijelo ne koristi inzulin) i gestacijski dijabetes (koji se javlja tokom trudnoće). Oksidativni stres nastaje zbog neravnoteže između proizvodnje reaktivnih vrsta kisika (ROS) i antioksidansa [2] što konačno dovodi do dijabetičkog stanja. Komplikacije dijabetesa uključuju zatajenje bubrega, oštećenje živaca, sljepoću, moždani udar, srčani udar, smrt fetusa i neplodnost. [1]. Studije pokazuju da su jezgra sperme, deoksiribonukleinska kiselina (DNK) i mitohondrije značajno oštećeni kod muških dijabetičara [3]. Oksidativni stres tokom transporta sperme će promeniti proces muškog reproduktivnog sistema [4,5].

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Proces spermatogeneze kontroliše osovina hipotalamus-hipofiza-gonada (HPG). Hormon koji oslobađa gonadotropin (GnRH) koji proizvodi hipotalamus stimuliše proizvodnju luteinizirajućeg hormona (LH) i folikulostimulirajućeg hormona (FSH). Leydigove ćelije nalaze se u blizini seminifernog tubula iproizvode testosteronpod kontrolom LH. FSH pokreće proizvodnju antigen-vezujućeg proteina (ABP) koji pomaže u prolasku muškog hormona. Dakle, neplodnost i drugi problemi uglavnom nastaju zbog poremećaja koji se javljaju u HPG osi. Primjena kombinacije streptozotocin-nikotinamid izaziva dijabetes kod eksperimentalnih štakora. Streptozotocin je kemijski spoj toksičan za stanice pankreasa koje proizvode inzulin, a nikotinamid je vitamin topiv u vodi koji štiti stanice od potpunog oštećenja [6].

Cistanche tubulosa je pustinjska biljna vrsta poznata i kao "Rou Cong-Rong" [7]. To je ne-klorofilna parazitska biljka koja raste uglavnom na korijenu stabla Calotropis procera i široko je rasprostranjena u sušnoj zemlji Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolija, Iran i Indija. Uobičajeni naziv Cistanche tubulosa je "pustinjski zumbul". Široko je prihvaćen u kineskoj tradicionalnoj medicini i dobio je naziv "Ginseng of Desert". Široko se koristi u medicinskom polju za liječenje morbidne leukoreje, obilne metroragije, kroničnih bubrežnih bolesti, zatvora, impotencije i neplodnosti. Hemijski sastojciCistanche tubulosa se sastoje od neisparljivih feniletanoidnih glikozida(PHG), iridoidi, lignani, hlapljiva ulja, alditoli, oligosaharidi i polisaharidi [8]. Studije to pokazujuechinacosideiz ove biljke štiti oštećeni fibroblast regulacijom nivoa ROS [9]. Ovo jedinjenje proizvodi antioksidativne, vazorelaksacijske i antiinflamatorne aktivnosti zajedno sa neuroprotekcijom i prevencijom osteoporoze [10,11].

Ova studija je imala za cilj da istraži efekatEkstrakt Cistanche tubulosakoji sadrže ECH na reproduktivnu disfunkciju dijabetičkog štakora izazvanog streptozotocinom-nikotinamidom.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali

ECH i CTE su kupljeni od Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tajvan). Napredni krajnji proizvodi glikacije (AGE) kupljeni su od Biovision-a (San Francisco, CA, SAD). LC-540 i TM3 ćelijske linije su kupljene od Instituta za istraživanje i razvoj prehrambene industrije (Hsinchu, Tajvan). Pet sedmica stari Sprague-Dawley (SD) mužjaci pacova kupljeni su od Nacionalnog laboratorijskog centra za životinje (Taipei, Tajvan). Feed Lab Diet® je kupljen od PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Tajvan). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) je dobijen od Sigme (St. Louis, MO, SAD). Metanol i 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina (HEPES) su takođe kupljeni od Sigme. Dulbecco-ov modifikovani Eagle medijum/F12 i tripsin-EDTA dobijeni su od GIBCO-a (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijum bromid (MTT), dihloro-dihidro-fluorescein diacetat (DCFH-DA), dimetil sulfoksid (DMSO) i nitroplavi tetrazolijum (NBT) kupljeni su od Sigme. Enzimski setovi glukoze su nabavljeni iz Kyokutoseiyakua, Tokio, Japan. Insulin ELISA setovi su kupljeni od Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Upsala, Švedska). T-PER reagens za ekstrakciju proteina tkiva nabavljen je od Thermo Scientifica (Čikago, IL, SAD). Anti-humani/miš/pacov nuklearni faktor-kappa B NF-κB poliklonska antitijela su kupljena od Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD. Anti-miš/pacov receptor za napredne krajnje proizvode glikacije (RAGE) poliklonska antitijela, anti-human/miš/pacov StAR poliklonska antitijela i anti-human/miš/pacov citokrom P450 17A1 monoklonska antitijela su kupljena od Gene Tex (Irvine, Kalifornija, SAD). Poliklonska antitela protiv čoveka/miša/pacova CYP11A1 su dobijena od Cell Signaling Technology (Beverly, PA, SAD). Easy-Blue reagens je kupljen od Invitrogena, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agaroza i DNK marker 100 bp dobijeni su od Promega, Corporation (Madison, WI, SAD). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit je kupljen od QIAGEN-a, Hilden, Njemačka.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metode

2.2.1. In vitro analiza

LC{0}} i TM3 ćelijska kultura: LC-540 ćelijske linije su uzgajane na 37 ◦C u mediju Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) sa dodatkom natrijum bikarbonata (1,5 g/L), L-glutamin (2 mM), neesencijalne aminokiseline (0.1 mM), natrijum piruvat (1.0 mM) i fetalni goveđi serum (FBS) (10%) u 5% CO2 inkubator (CO2 inkubator, Napco 5410, Tajvan). TM3 ćelijska linija je kultivisana u Dulbeccovom modifikovanom mediju Eagle (DMEM) sa dodatkom glukoze (4,5 g/L), natrijum piruvata (0,5 mM), L-glutamina (2,5 mM), natrijum bikarbonata (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina (HEPES, 15 mM) i fetalni teleći serum (FCS, 10%) ili konjski serum (5%) na 37 ◦C u 5% CO2 inkubator.

Određivanje vitalnosti ćelijeehinakozid (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijum bromid (MTT) reagens je korišten za ispitivanje vitalnosti ćelija. Koncentracija ćelija je podešena na 2 × 105 ćelija/mL u pločici sa 96-jažicom. Zatim je dodato 20 µL ECH (razblaženog u 2% medijuma) i inkubirano 24 h na 37 ◦C u inkubatoru sa 5% CO2. Kasnije je dodato 100 µL MTT reagensa i inkubirano 4 h na 37 ◦C u tamnim uslovima. Apsorbanca je izmjerena na 570 nm (ELISA čitač, Dynatech MR5000, Kloten, Švicarska).

Relativna vijabilnost ćelije (%)=[(Uzorak na 570 nm − Prazan na 570 nm)]/[(Kontrola na 570 − Prazan na 570)] × 100.

Test redukcije nitroplavog tetrazolija (NBT) i 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) test: Broj ćelija je podešen na 1×1{{10}}6 ćelija/ mL. Zatim je dodato 50 mg/mL ECH, resveratrola (RES) i krajnjih proizvoda napredne glikacije (AGEs) (kontrola) i zajedno kultivisano 18 h na 37 ◦C. Zatim je dodato 0,3 mL rastvora NBT (0,1 mg/mL NBT, 5% FBS i 3% dimetil sulfoksid (DMSO) rastvoren u 10 mL DMEM) i inkubirano na 37 ◦C u 5% CO2 tokom 1 h. Nakon centrifugiranja (na 800 × g tokom 3 min) supernatant je uklonjen i dodano je 200 µL DMSO i mućkano 5 min u ultrazvučnom oscilatoru (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Tajvan). Apsorbancija je izmjerena na 630 nm. Za DPPH radikalni test, Trolox (u 95% alkohola) je uzet kao standard. Zatim je 75 µL 0,5 mM rastvora DPPH pomešano sa 25 µL uzoraka i ostavljeno da reaguje na sobnoj temperaturi na tamnom mestu 30 minuta. Smjesa je protresena i apsorbancija je izmjerena na 517 nm.

Analiza sadržaja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS): Broj ćelija je podešen na 2 × 105 ćelija/mL u 12- pločici sa bunarima koja sadrži 2% FBS. Zatim je na ploču dodato 50 µL/mL ECH, RES i AGE i inkubirano na 37 ◦C tokom 24 h. Nakon 24 h, dodat je 20,70 -dihlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) i inkubiran na 37 ◦C 30 min. Nakon centrifugiranja (400 × g, 5 min), supernatant je uklonjen i ćelije su dva puta isprane sa fosfatnim puferom (PBS). Nakon toga, ćelije su suspendovane u 1 mL PBS-a i nivoi ROS-a su određivani korišćenjem protočnog citometra (Flow Cytometer, Becton Dickinson, Kalifornija, SAD).

Identifikacija i kvantitativna analiza proteina: Proteini su ekstrahovani korišćenjem reagensa za ekstrakciju proteina (T-PER). Gustoća ćelija je podešena na 2 × 105 ćelija/mL u pločici 12-jažice i 50 µL/mL ECH, RES i receptora za antagonist naprednog krajnjeg produkta glikacije (RAGE), a AGE su dodani i inkubirani na 37 ◦C u inkubatoru sa 5% CO2 tokom 24 h. Nakon toga je dodano 400 µL T-PER, sastrugano sa ćelija i centrifugirano na 125,000× g tokom 20 minuta (4 ◦C). Supernatant je sakupljen i pohranjen na -80 ◦C (-80 ◦C zamrzivač, Nuaire, Plymouth, MN, SAD) za dalju analizu. Za kvantifikaciju proteina korišten je komplet bicinhoninske kiseline (BCA). Zatim je 10 µL standardnog rastvora ćelija i 200 µL BCA reagensa dodato na 8- ploče sa bunarima i inkubirano na 37 ◦C u inkubatoru sa 5% CO2 tokom 30 minuta. Apsorbancija je izmjerena na 562 nm. Analiza identifikacije proteina izvršena je elektroforezom natrijum dodecil sulfat (SDS)-poliakrilamid gel (SDS-PAGE). Uzorci su pripremljeni dodavanjem proteinskog lizata u pufer za punjenje proteina i obavljena je Western blot analiza da bi se otkrili specifični proteini.

2.2.2. In vivo analiza

Dizajn životinjskog modela: Šezdeset {{0}}sedmica starih mužjaka Sprague-Dawley (SD) pacova kupljeno je od Nacionalnog laboratorijskog centra za životinje (Taipei, Tajvan). Svaki pacov je bio smješten pojedinačno u dezinfekcijskim kavezima od nehrđajućeg čelika pod kontroliranom temperaturom (23 ± 1 ◦C) i vlažnošću (40-60%) uz ciklus od 12 h svjetla/12 h tame. Hrana i voda su davani ad libitum. Svaki pacov je pripitomljen u prvoj sedmici i dobio je laboratorijsku dijetu za glodare 5001 kao glavnu ishranu. Sve procedure su slijedile standard institucionalne komisije za negu i upotrebu životinja (IACUC odobrenje br. 101026) Nacionalnog tajvanskog okeanskog univerziteta, Tajvan. Nakon pripitomljavanja, pacovi su podijeljeni u dvije grupe: kontrolnu grupu (Con) koja je hranjena laboratorijskom dijetom 5001 i grupu dijabetičara koja je hranjena hranom s visokim udjelom masti (HFD, 40%) tokom cijelog eksperimenta. Nakon što su hranjeni HFD tokom 4 sedmice, pacovima dijabetičke grupe ubrizgan je streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) da izazove dijabetes melitus (DM). Unutar 15 minuta od ubrizgavanja STZ, ubrizgan je nikotinamid (230 mg/kg tjelesne težine). Sedmicu nakon injekcije, urađen je oralni test tolerancije glukoze (OGTT) kako bi se utvrdila uspješna indukcija dijabetes melitusa (DM). Nakon toga su životinje podijeljene u šest grupa: kontrolna (hranjena laboratorijskom dijetom 5001); DM grupa (DM + 45% HFD); DMR grupa (DM + rosiglitazon: 0,571 mg/kg TM) + 45% HFD; DME1 grupa (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; DME2 grupa (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; i DME4 grupa (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Kao pozitivna kontrola uzet je rosiglitazon (RSG). Tri doze CTE (80, 160 i 320 mg/kg) korištene su prema preporuci Tajvanske uprave za hranu i lijekove (TFDA) za funkcionalnu evaluaciju zdrave hrane. Tretmani su davani do kraja eksperimenta. Svi eksperimentalni pacovi su žrtvovani nakon 6 sedmica. Krv sakupljena od pacova centrifugirana je na 3000 rpm tokom 15 minuta na 4 ◦C. Supernatant je ispitan za sljedeću analizu:

Određivanje ukupne glukoze, triglicerida i holesterola: Određivanje glukoze je izvršeno pomoću glukoznih enzimskih kompleta. Zatim je reagensima dodato 20 µL uzoraka krvne plazme i držano na 37 ◦C 5 min. Ukupni trigliceridi i koncentracija ukupnog holesterola određivani su korišćenjem triglicerida i enzimskih kompleta za holesterol. Zatim je reagensima dodano 10 µL krvne plazme i eksperiment je proveden prema uputama proizvođača. Apsorbancija je izmjerena na 510 nm.

Ukupna glukoza/trigliceridi/holesterol u plazmi (mg/dL)=(uzorak − ABlank)/(standard − ABlank) × 200.

Uzorak: Apsorpcija uzoraka krvi, ABlank: Vrijednost apsorpcije kompleta bez uzorka, Astandard: Vrijednost apsorpcije standardnog reagensa, 200: standardni reagensi u koncentraciji od 200 mg/dL.

Procjena inzulina, leptina i homeostatskog modela – određivanje inzulinske rezistencije (HOMA-IR):Nivo inzulina je određen inzulinskim ELISA kompletima. Evo, 25µL krvne plazme je dodan ureagensa, a apsorbancija je izmjerena na 450 nm. Ukupni sadržaj leptina određen je korištenjem akomplet za imunološki test leptinskog enzima.Zatim, 100µL plazme je analizirana i apsorbancijaje izmjeren na 450 nm pomoću ELISA čitača. Cijeli eksperiment je proveden premauputstva proizvođača. Vrijednost HOMA-IR određena je iz modela homeostazejednadžba procjene=Koncentracija inzulina u plazmi natašte (mg/mL)× glukoze u plazmi nataštekoncentracije (mmol/L)/22,5.

Peroksidacija lipida u plazmi: Ovdje je {{0}}.5 mL krvne plazme pomiješano sa 1 mL reagensa (15%, w/v trihloroctene kiseline u 0.25 N hlorovodonične kiseline (HCl ) i 0.375%, w/v tiobarbiturne kiseline u 0,25 N HCl) i stavljen u vodeno kupatilo (Vodeno kupatilo, BUCHI 461, Cirih, Švajcarska) na 100 ◦C tokom 15 min. Nakon hlađenja, dodat je 1 mL n-butanola, snažno protresen i centrifugiran na 1500 × g 10 min. Supernatant je sakupljen i apsorbancija je izmjerena na 532 nm [12].

Koncentracija malondialdehida (MDA) (nM/mL)=[(Uzorak na 532 nm − Prazan na 532 nm)/ (Standard na 532 nm − Prazan na 532 nm)] × 5.

standard na 532 nm − prazno na 532 nm)] × 5. Određivanje nivoa testosterona u plazmi i luteinizirajućeg hormona (LH): ELISA komplet za testosteron je korišten za mjerenje nivoa testosterona u krvnoj plazmi. RIA komplet je korišten za određivanje koncentracije LH. Zatim je dodato 50 µL plazme i proračuni su zasnovani na koncentraciji hormona LH-RP-3 (standard). Daljnji koraci su provedeni prema uputama proizvođača.

Određivanje koncentracije faktora nekroze tumora (TNF) i interleukina-6 (IL-6): Uhvaćeno antitijelo je razrijeđeno 250 puta u puferu za oblaganje, dodano u 96- ploča sa jažicom (100 µL/bažirić) i držana na 4 ◦C preko noći. Supernatant je aspiriran i ispran pet puta puferom za ispiranje (1 put PBS, 0,05% Tween 20). Nakon inkubacije (1 h) sa 200 µg razblaživača za analizu, ćelije su isprane 5 puta puferom za ispiranje i 100 µL standardnog rastvora TNF-a ili testnih uzoraka je dodato u svaki bunar i inkubirano 2 h. Nakon ispiranja, dodano je 100 µL IL-6-detektovanih antitijela i inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi. Supernatant je aspiriran i ispran 5 puta. Zatim je dodano 480 µL enzima avidin-peroksidaze hrena (HRP) i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. Supernatant je aspiriran i ispran pet puta puferom za ispiranje. Zatim je dodano 100 µL rastvora supstrata i inkubirano 15 minuta na sobnoj temperaturi. Kasnije je u svaku jažicu dodato 50 µL stop rastvora (1M fosforna kiselina) i apsorbancija je izmerena na 450 nm.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POPRAVAK SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza parametara sperme i testisa

Sakupljanje uzoraka sperme: Uzimanje uzoraka sperme obavljeno je prema metodi koja je prethodno objavljena u [13]. Sperma je sakupljena iz supernatanta i korištena za dalju analizu.

Broj spermatozoida, pokretljivost spermatozoida i abnormalne sperme: Broj spermatozoida izračunat je pomoću hemocitometra i otopine tripan plavog. Zatim je 100 µL tečnosti sperme pomešano sa rastvorom tripan plavog i izračunati su broj spermatozoida, pokretljivost i abnormalne sperme pomoću hemocitometra i mikroskopa [14].

Nitro plavi tetrazolijum NBT redukcija i lipidna peroksidacija sperme i testisa: Peroksidacija lipida i redukcija NBT analizirane su prema istom postupku analize plazme.

Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) i katalaze: Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) analizirana je korištenjem RANSEL kompleta. Ovdje je {{0}}.05 mL homogenata testisa dodano je u 1,7 mL reakcione otopine (0.05 mM ksantina, 0,025 mM 2-({ {9}}jodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolijum hlorid (INT)). Nakon miješanja, dodano je 0,25 mL ksantin oksidaze (80 U/L) i reagovano na sobnoj temperaturi 30 s. Apsorbancija je izmjerena na 505 nm. Koncentracija proteina u homogenatu testisa određena je Bio-Rad DC kompletom za analizu proteina i izračunata je njegova specifična aktivnost (U/mg proteina). Aktivnost katalaze (CAT) određena je prema prethodno objavljenoj metodi [15].

H&E (hematoksilin i eozin) bojenje

Testis je natopljen u 10% formalina 24 h i čuvan na 4 ◦C. Tkiva su bila mikro veličine i pričvršćena za stakalce. Nakon fiksacije (95% metanol + 5% octene kiseline), stakalca su uronjena u hematoksilin na 3 min, isprana tekućom vodom 5 min, a zatim natopljena sa 50%, 70% i 90% alkohola za jedan minut. Nakon toga, stakalca su obojena eozinom 10 s i natopljena u 100% alkoholu jednu minutu dok ne izblijede. Konačno, pločica je natopljena ksilenom na jednu minutu. Kasnije je pločica osušena na zraku i zapečaćena. Obojena epruveta je stavljena u invertirani fazni kontrastni mikroskop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japan) da se posmatra morfologija.

Analiza hipotalamusa

Mišji KISS1, G-protein spojen receptor (GPR) 54, supresor citokinske signalizacije 3 (SOCS-3) i genske sekvence sirtuina 1(SIRT1) identificirani su iz NCBI (Nacionalni centar za informacije o biotehnologiji) genske baze podataka a poseban prajmer je dizajniran korišćenjem Primera 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, SAD.). Prajmeri korišteni u eksperimentu navedeni su u tabeli 1.

Ekstrakcija ribonukleinske kiseline (RNA) iz hipotalamusa. Ekstrakcija RNK iz hipotalamusa mozga izvedena je korištenjem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Dobijene mRNA su kvantitativno mjerene reverznom transkripcijom (RT) i lančanom reakcijom polimeraze (PCR). DNK komplimenta dobijena RT analizom pohranjena je na -20 ◦C za kasniju upotrebu. Ekstrahirana DNK je podvrgnuta analizi lančane reakcije polimerazom (PCR) upotrebom Taq polimeraze. Zatim je uzeto 5~10 µL PCR proizvoda i analizirano elektroforezom na 1,5% agar koloidu. Slika je snimljena UVP BioDoc-It sistemom za snimanje. Reverzno transkribovana komplementarna deoksiribonukleinska kiselina (cDNK) je uzeta i PCR je izveden korišćenjem IQ SYBR Green Supermix kompleta. Kasnije je analiziran sa softverom optičkog sistema iQTM 5. Proteini su ekstrahovani korišćenjem reagensa za ekstrakciju proteina (T-PER). Zatim je 20 mg homogenata testisa dodano u 400 µL T-PER i centrifugirano (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Njemačka) na 4 ◦C (125,000× g ) 20 min. Sljedeća metoda je bila slična "identifikacijskoj i kvantifikacijskoj analizi proteina" u in vitro analizi.

2.3. Statistička analiza

Eksperimentalni rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (Mean ± SD), a podaci su analizirani korištenjem Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.{1}} softvera, IBM, Armonk, New York, NY, SAD. Razlike između grupa analizirane su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA). Višestruka poređenja različitih grupa analizirana su Duncan-ovim testom na vrijednosti p < 0.05 kao značajnom nivou.

3. Rezultati

3.1. In vitro analiza

3.1.1. Poređenje antioksidativnih aktivnosti ECH, CTE i RES

Dugotrajno hVisok oksidativni stres i kronična upala glavni su uzroci dijabetesakomplikacije [16]. CTE sadrže različitefeniletanoidni glikozidi kao što je ehinakozid(ECH) i akteozid, s potencijalom za antioksidativno djelovanje [17]. Čišćenje DPPH radikalaProveden je test za procjenu antioksidativne aktivnosti ECH. Trolox i resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilben, RES) uzete su kao standard i pozitivna kontrola. Kao što je prikazanona slici1, ECH je pokazao bolju aktivnost uklanjanja radikala i aktivnost je bila značajno većanego kod pozitivne kontrole (RES).

3.1.2. Viabilnost ćelija ECH na LC-540 i TM3 Leydig ćelijama

MTT test je izveden za procjenu vitalnosti ćelija različitih koncentracija ECH. LC-540 Leydig ćelije i TM3 Leydig ćelije su pokazale više od 80% vitalnosti nakon tretmana sa ECH (Slika 2). U poređenju sa drugim koncentracijama, koncentracija 100- µM (razblaženja od 100 µM u 2% FBS) ECH je pokazala bolju vitalnost ćelija u TM3 Leydig ćelijama. Rezultat je pokazao da povećana koncentracija ECH ne doprinosi nekoj značajnoj toksičnosti za ćelije.

3.1.3. Utjecaj ECH na proizvodnju superoksida izazvanu starenjem NBT testom u LC-540 i TM3 Leydigovim ćelijama

AGE izazivaju oksidativna oštećenja u tijelu zbog oksidacije glukoze i stvaranja slobodnih radikala kao što su O2-, hidroksilni radikali i karbonilne grupe [18]. Nakon stimulacije sa 50 ug/mL AGE, LC-540 (Slika 3a) i TM3 (Slika 3b) ćelije su tretirane sa ECH i RES (5 μM i 10 μM svaka). Rezultati su pokazali da je proizvodnja superoksid aniona povećana u kontrolnoj grupi (stimulirani AGE), ali je proizvodnja superoksid aniona smanjena nakon kontrolne grupe (stimulirani AGE), ali je proizvodnja superoksid aniona smanjena nakon proizvodnje superoksida i zaštićena ćelije od oksidativnog oštećenja. U slučaju LC-540 ćelija, 10 µM ECH je pokazao skoro sličnu aktivnost sa normalnom grupom. Proizvodnja superoksida u obje ćelije je smanjena s povećanjem koncentracije i ECH i RES.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Učinak ECH na proizvodnju H2O2 u LC-540 Leydigovim ćelijama stimuliranim starenjem

DCFH-DA test je izveden da bi se otkrilo prisustvo oksidativnih vrsta. Nakon ulaska u ćelije, fluorescentna boja DCFH-DA oksidira se intracelularnom H2O2 i formira dihlorofluorescein (DCF). Kao što je prikazano na slici 4, došlo je do značajnog povećanja intracelularne proizvodnje H2O2 u grupi stimulisanoj AGE (kontrola), dok je dodavanje 10 µM ECH i RES značajno smanjilo proizvodnju H2O2 u ćelijama. Primjena 10 µM ECH rezultirala je sa samo oko 47,1% proizvodnje H2O2, značajno niže nego u kontrolnoj grupi.

3.1.5. Utjecaj ECH na nivoe ekspresije RAGE i NF-κB proteina u LC-540 Leydigovim ćelijama stimuliranim AGE

Urađena je Western blot analiza kako bi se potvrdilo prisustvo RAGE u LC-540 Leydigovim ćelijama. Utjecaj ECH na nivoe ekspresije proteina RAGE (Slika 5a) i NF-κB (Slika 5b) u Leydigovim ćelijama stimuliranim AGEsom prikazan je na Slici 5. Rezultati su pokazali da koncentracija AGE od 50 µg/mL izaziva veće RAGE i NF- Ekspresija κB u LC-540 Leydigovim ćelijama i 10 µM koncentracija ECH i RES značajno su smanjile ekspresiju RAGE i NF-κB. Ekspresija NF-κB bila je značajno niža u RES i ECH nego u RAGE antagonistima. Dakle, rezultati su potvrdili da je ECH smanjio nivo upale smanjenjem nivoa RAGE i NF-κB.

3.1.6. Utjecaj ECH na put sinteze testosterona u Leydigovim ćelijama stimuliranim AGE-om LC-540.

Proces spermatogeneze i muške neplodnosti zavisi od prisustva testosterona. Kao što je prikazano na slici 6, ekspresija proteina StAR (slika 6a), CYP11A1 (slika 6b), CYP17A1 (slika 6c) i HSD17 3 (slika 6d) značajno je smanjena u LC stimuliranom AGE{{11 }} Leydigove ćelije (kontrolna grupa). Ekspresija StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD{16}} proteina je značajno povećana kada su dodani RAGE antagonist, RES i ECH. Povećana ekspresija StAR i CYP11A1 proteina uočena je u grupama koje su tretirane ECH i RES. Nivo ekspresije CYP17A1 bio je skoro sličan u RES i ECH grupama. Ekspresije HSD17 3 proteina u Leydigovim ćelijama tretiranim ECH bile su mnogo veće od onih u ćelijama tretiranim RES i RAGE antagonistom. Povećana ekspresija StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 proteina ukazuje na normalnu proizvodnju testosterona.