Učinak ekstrakta Cistanche Tubulosa na mušku reproduktivnu funkciju kod dijabetičkih štakora izazvanih streptozotocinom-nikotinamidom

Ključne riječi:dijabetes; neplodnost;Cistanche tubulosaekstrakt(CTE);echinacoside(ECH);protuupalnoaktivnost;antioksidansaktivnost;steroidogenezaefekti

Za više informacija o prednostima praha ekstrakta cistanche

1. Uvod

Dijabetes melitus (DM) je stanje u kojem dolazi do povećanog nivoa glukoze u krvineefikasnosti gušterače u proizvodnji dovoljno inzulina, ili nesposobnosti tijela da ga koristiefektivno. Prema podacima SZO, broj ljudi sa dijabetesom porastao je sa 108 miliona 1980na 422 miliona u 2014. [1]. Postoje četiri glavne kategorije: preddijabetes (faza prije dijabetesa), tip 1(gdje gušterača ne proizvodi inzulin), tip 2 (tijelo ne koristi inzulin) i gestacijskidijabetes (koji se javlja tokom trudnoće). Oksidativni stres nastaje zbog neravnoteže izmeđuproizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) i antioksidanata [2] konačno dovodi do dijabetičkog stanja.Komplikacije dijabetesa uključuju zatajenje bubrega, oštećenje živaca, sljepoću, moždani udar, srcenapad, smrt fetusa i neplodnost. [1]. Istraživanja pokazuju da jezgra sperme, deoksiribonukleinska kiselina (DNK),i mitohondrije su značajno oštećene kod muških dijabetičara [3]. Oksidativni stres tokomtransport sperme će promijeniti proces muškog reproduktivnog sistema [4,5]. 

Proces spermatogeneze kontroliše hipotalamus-hipofiza-gonada (HPG)osa. Hormon koji oslobađa gonadotropin (GnRH) koji proizvodi hipotalamus stimulišeproizvodnja luteinizirajućeg hormona (LH) i folikulostimulirajućeg hormona (FSH). Pronađene su Leydigove ćelijeu blizini seminifernog tubula i proizvode testosteron pod kontrolom LH. FSH okidačiproizvodnju proteina koji veže antigen (ABP) koji pomaže u prolasku muškog hormona. Dakle, neplodnosta drugi problemi uglavnom nastaju zbog poremećaja koji se javljaju u osovini HPG. Administracija ofkombinacija streptozotocin-nikotinamid izaziva dijabetes kod eksperimentalnih štakora. Streptozotocinje hemijski spoj otrovan za proizvodnju inzulina ćelije u pankreasu i nikotinamid je avitamin rastvorljiv u vodi koji štiti ćelije od potpunog oštećenja [6]. Cistanche tubulosaje pustinjska biljna vrsta poznata i kao "Rou Cong-Rong" [7]. To jeneklorofilna parazitska biljka koja raste uglavnom na korijenuCalotropis proceradrvo i ješiroko rasprostranjen u sušnoj zemlji Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolija, Iran i Indija. UobičajenoimeCistanche tubulosaje "Desert Hyacinth". Široko je prihvaćen u kineskoj tradicionalnoj medicinii dobio je naziv "Ginseng of Desert". Široko se koristi u medicinskom polju zaliječenje morbidne leukoreje, obilne metroragije, kroničnih bubrežnih bolesti, zatvora, impotencije ineplodnost. Hemijski sastojciCistanche tubulosasastoje se od neisparljivih feniletanoidnih glikozida(PHG), iridoidi, lignani, hlapljiva ulja, alditoli, oligosaharidi i polisaharidi [8]. Studijepokazuju da ehinakozid iz ove biljke štiti oštećene fibroblaste regulacijom nivoa ROS [9]. Ovo jedinjenje proizvodi antioksidativne, vazorelaksacijske i protuupalne aktivnosti zajedno saneuroprotekcija i prevencija osteoporoze [10,11]. Ova studija je imala za cilj da istraži efekatCistanche tubulosaekstraktkoji sadrži ECH nareproduktivna disfunkcija dijabetičkog štakora izazvanog streptozotocinom-nikotinamidom.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali

ECH i CTE su kupljeni od Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Tajvan). Naprednokrajnji proizvodi glikacije (AGE) kupljeni su od Biovision-a (San Francisco, CA, SAD). LC-540i TM3 ćelijske linije su kupljene od Instituta za istraživanje i razvoj prehrambene industrije(Hsinchu, Tajvan). Pet sedmica stari Sprague-Dawley (SD) mužjaci pacova kupljeni su odNacionalni centar za laboratorijske životinje (Tajpej, Tajvan). Feed Lab Diet® kupljeno od PMI-jaNutrition International, Inc. (Tajpej, Tajvan). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) je dobijeniz Sigme (St. Louis, MO, SAD). metanol i 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselinakiseline (HEPES) su takođe kupljene od Sigme. Dulbecco modificirani Eagle medium/F12 itripsin-EDTA su dobijeni od GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid (MTT), dihloro-dihidro-fluorescein diacetat (DCFH-DA), dimetilsulfoksid (DMSO) i nitroplavi tetrazolijum (NBT) kupljeni su od Sigme. Enzimska glukozakompleti su nabavljeni iz Kyokutoseiyakua, Tokio, Japan. Nabavljeni su kompleti ELISA za inzuliniz Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Upsala, Švedska). T-PER ekstrakcija proteina iz tkivaReagens je nabavljen od Thermo Scientififica (Chicago, IL, USA). Anti-human/miš/pacov nuklearnafaktor-kappa B NF-κB poliklonska antitijela su kupljena od Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, Kalifornija, SAD. Anti-miš/pacov receptor za napredne krajnje proizvode glikacije (RAGE) poliklonskiantitijela, poliklonska antitijela protiv čovjeka/miša/pacova StAR i anti-humana/miša/pacovaMonoklonska antitijela citokroma P450 17A1 kupljena su od Gene Texa (Irvine, Kalifornija, SAD).Poliklonska antitela protiv čoveka/miša/pacova CYP11A1 dobijena su putem ćelijske signalizacijeTehnologija (Beverly, PA, SAD). Easy-Blue reagens kupljen je od Invitrogena, Thermo FisherScientific (Carlsbad, CA, SAD). Agaroza i DNK marker 100 bp dobijeni su od Promega,Corporation (Madison, WI, SAD). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit je kupljen od QIAGEN-a,Hilden, Njemačka.

5 posto CO2 inkubator (CO2 inkubator, Napco 5410, Tajvan). Ćelijska linija TM3 uzgajana je u Dulbecco-umodifikovani Eagle medijum (DMEM) sa dodatkom glukoze (4,5 g/L), natrijum piruvata (0,5 mM),L-glutamin (2,5 mM), natrijum bikarbonat (1,2 g/L), 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselinakiselina (HEPES, 15 mM) i fetalni teleći serum (FCS, 10 posto) ili konjski serum (5 posto) na 37◦C u 5 postoCO2 inkubator.

Određivanje vitalnosti ćelije ehinakozida (ECH): 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid (MTT) reagens je korišćen za ispitivanje vitalnosti ćelija. Koncentracija ćelijeje prilagođen na 2× 105ćelije / mL u 96-pločici sa jažicom. Zatim, 20µL ECH (razrijeđen u 2 posto medija)je dodan i inkubiran 24 h na 37◦C u 5 posto CO2 inkubator. Kasnije, 100µL MTT reagensa je biododano i inkubirano 4 h na 37◦C u mračnim uslovima. Apsorbancija je izmjerena na 570 nm(ELISA čitač, Dynatech MR5000, Kloten, Švajcarska).Relativna vitalnost ćelije (procenti)=[(Auzorak na 570 nm− Ablanko na 570 nm)]/[(Akontrola na 570− Aprazno na 570)] × 100.

Analiza sadržaja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS):

Broj ćelije je prilagođen2 × 105ćelije/mLu 12-ploči sa bunarima koja sadrži 2 procenta FBS. Zatim, 50µL/mL ECH, RES i AGEdodani su na ploču i inkubirani na 37◦C 24 h. Nakon 24 h, 20 ,70 -dihlorofluorescein-diacetat(DCFH-DA) je dodan i inkubiran na 37◦C 30 min. Nakon centrifugiranja (400× g, 5 min),

i AGE su dodani i inkubirani na 37◦C u 5 posto CO2 inkubator 24h. Posle 400µL od T-PERsu dodani, ostrugani sa ćelija i centrifugirani na 125,000× g 20 min (4◦C). Supernatantje prikupljen i pohranjen na−80 ◦C (−80 ◦C zamrzivač, Nuaire, Plymouth, MN, SAD) za dalju analizu.

Za kvantifikaciju proteina korišten je komplet bicinhoninske kiseline (BCA). Zatim, 10µL standardnog rastvora ćelijai 200µL BCA reagensa je dodan u 8-ploče sa jažicom i inkubiran na 37◦C u 5 posto CO2 inkubatorza 30 min. Apsorbancija je izmjerena na 562 nm. Urađena je analiza identifikacije proteinaelektroforezom natrijum dodecil sulfata (SDS)-poliakrilamidnog gela (SDS-PAGE). Uzorci su bilipripremljeno dodavanjem proteinskog lizata u pufer za punjenje proteina i izvršena je Western blot analizaza otkrivanje specifičnih proteina.

2.2.2. In vivo analiza

Dizajn životinjskog modela: Šezdeset 4-nedjeljnih mužjaka Sprague-Dawley (SD) pacova kupljeno je odNacionalni centar za laboratorijske životinje (Tajpej, Tajvan). Svaki pacov je pojedinačno smješten u dezinficijensukavezi od nerđajućeg čelika na kontrolisanoj temperaturi (23± 1 ◦C) i vlažnost (40–60 posto) sa 12 hsvjetlo/12 h tamno ciklus. Hrana i voda su davani ad libitum. Svaki pacov je pripitomljen u prvomsedmicu i data je laboratorijska dijeta za glodare 5001 kao glavna ishrana. Sve procedure su slijedile standardinstitucionalnog komiteta za njegu i upotrebu životinja (IACUC odobrenje br. 101026) NacionalneTaiwan Ocean University, Tajvan. Nakon pripitomljavanja, pacovi su podijeljeni u dvije grupe: kontrolnugrupa (Con) koja je hranjena laboratorijskom dijetom 5001 i grupa dijabetičara koja je hranjena dijetom s visokim udjelom masti(HFD, 40 posto) za cijeli eksperiment. Nakon hranjenja HFD-om 4 sedmice, dijabetičarska grupapacovima je ubrizgan streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) da izazove dijabetes melitus (DM). Unutar15 min ubrizgavanja STZ, ubrizgan je nikotinamid (230 mg/kg tjelesne težine). Sedmicu nakon injekcije,Proveden je oralni test tolerancije glukoze (OGTT) kako bi se utvrdila uspješna indukcija dijabetičaraMellitus (DM). Nakon toga životinje su podijeljene u šest grupa: kontrolna (hranjena laboratorijskom prehranom5001); DM grupa (DM plus 45 posto HFD); DMR grupa (DM plus rosiglitazon: 0,571 mg/kg TM) plus 45 posto HFD;DME1 grupa (DM plus CTE: 80 mg/kg TM) plus 45 posto HFD; DME2 grupa (DM plus CTE: 160 mg/kg TM)plus 45 posto HFD; i DME4 grupa (DM plus CTE: 320 mg/kg TM) plus 45 posto HFD. Rosiglitazon (RSG) je biouzeti kao pozitivnu kontrolu. Upotrebljene su tri doze CTE (80, 160 i 320 mg/kg) premapreporuka Tajvanske uprave za hranu i lijekove (TFDA) zdrava hrana je funkcionalnasmjernice za evaluaciju. Tretmani su davani do kraja eksperimenta. Svi eksperimentalni pacovižrtvovani su nakon 6 sedmica. Krv je sakupljena od pacova centrifugirana na 3000 o/min15 minuta u 4◦C. Supernatant je ispitan za sljedeću analizu:Ukupna glukoza, trigliceridi i holesterol

Odlučnost:

Određivanje glukoze je biloprovode se pomoću glukoznih enzimskih kompleta. Zatim, 20µL uzoraka krvne plazme je dodan ureagense i održavana na 37◦C 5 min. Ukupni trigliceridi i koncentracija ukupnog holesterola su biliodređuju korištenjem enzimskih kompleta za trigliceride i kolesterol. Zatim, 10µL krvne plazme sudodali reagensima i eksperiment je proveden prema uputama proizvođača.Apsorbancija je izmjerena na 510 nm.Ukupna glukoza/trigliceridi/holesterol u plazmi (mg/dL)=(Auzorak− APrazno)/(Astandard− APrazno) × 200. Uzorak: Apsorpcija uzoraka krvi, APrazno: Vrijednost apsorpcije kompleta bez uzorka, Standard: Vrijednost apsorpcije standardnog reagensa, 200: standardni reagensi u koncentraciji od200 mg/dL.Procjena inzulina, leptina i homeostatskog modela – određivanje inzulinske rezistencije (HOMA-IR):Nivo inzulina je određen inzulinskim ELISA kompletima. Evo, 25µL krvne plazme je dodan ureagensa i apsorbancija je izmjerena na 450 nm. Ukupni sadržaj leptina određen je korištenjemkomplet za imunološki test leptinskog enzima. Zatim, 100µAnalizirani su L plazme i apsorbancijaje izmjeren na 450 nm pomoću ELISA čitača. Cijeli eksperiment je proveden premauputstva proizvođača. Vrijednost HOMA-IR određena je iz modela homeostazejednadžba procjene=Koncentracija insulina u plazmi natašte (mU/mL)× glukoze u plazmi nataštekoncentracije (mmol/L)/22,5.Peroksidacija lipida u plazmi: Ovdje je 0.5 mL krvne plazme pomiješano sa 1 mL reagensa (15 posto,w/v trihloroctene kiseline u {{0}}.25 N hlorovodonične kiseline (HCl) i 0,375 posto,w/v tiobarbiturna kiselina u0.25 N HCl) i stavljen u vodeno kupatilo (Vodeno kupatilo, BUCHI 461, Zürich, Švajcarska) na 100◦C za15 min. Nakon hlađenja, dodat je 1 mL n-butanola, snažno protresen i centrifugiran na 1500× g za 10 min. Supernatant je sakupljen i apsorbancija je izmjerena na 532 nm [12]. Koncentracija malondialdehida (MDA) (nM/mL)=[(A uzorakna 532 nm− Ablanko na 532 nm)/ (Standardnona 532 nm− Ablanko na 532 nm)] × 5. Određivanje nivoa testosterona i luteinizirajućeg hormona (LH) u plazmi: testosteronELISA komplet je korišten za mjerenje nivoa testosterona u krvnoj plazmi. RIA komplet je naviknutodrediti koncentraciju LH. Zatim, 50µDodan je L plazme i zasnovani su proračunio koncentraciji hormona LH-RP-3 (standard). Dalji koraci su sprovedeni premaprema uputama proizvođača.Određivanje faktora nekroze tumora (TNF)- i koncentracija interleukina-6 (IL-6):Uhvaćeno antitijelo je razrijeđeno 250 puta u puferu za oblaganje, dodano na ploču s 96-jažicom (100µL/bunar),i zadržan na 4◦C za preko noći. Supernatant je aspiriran i ispran petnaest puta uz ispiranjepufer (1 put PBS, 0.05 posto Tween 20). Nakon inkubacije (1 h) sa 200µg razblaživača za analizu, ćelije su bileoprano 5 puta puferom za pranje i 100µL TNF- standardni rastvor ili testni uzorcidodaju u svaku jažicu i inkubiraju 2 h. Nakon pranja, 100µDodano je L IL-6 otkrivenih antitijelai inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi. Supernatant je aspiriran i ispran 5 puta. onda,480 µDodano je L enzima avidin-peroksidaze hrena (HRP) i inkubirano 30 minuta na sobnojtemperaturu. Supernatant je aspiriran i ispran pet puta puferom za ispiranje. Zatim, 100µL rastvora supstrata su dodani i inkubirani 15 min na sobnoj temperaturi. Kasnije, 50µL stoprastvor (1M fosforna kiselina) je dodat u svaku jažicu i apsorbancija je izmerena na 450 nm.Analiza parametara sperme i testisaUzimanje uzoraka sperme: Uzimanje uzoraka sperme obavljeno je premametoda ranije objavljena u [13]. Sperma je sakupljena iz supernatanta i korištena zadalje analize.Broj spermatozoida, pokretljivost spermatozoida i abnormalne sperme: broj spermatozoida je bioizračunato pomoću hemocitometra i otopine tripan plavog. Zatim, 100µL spermatozoida su bilipomiješan s otopinom tripan plavog i broj spermatozoida, pokretljivost i abnormalne sperme su biliizračunato pomoću hemocitometra i mikroskopa [14]. Nitro plavi Tetrazolium NBT Redukcija i lipidna peroksidacija sperme i testisa: Lipidperoksidacija i redukcija NBT analizirane su prema istom postupku analize plazme.

Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) i katalaze: superoksid dismutaza(SOD) aktivnost je analizirana korištenjem RANSEL kompleta. Ovdje 0.05 mL homogenata testisasu dodani u 1,7 mL reakcione otopine (0.05 mM ksantin, 0,025 mM 2-(4-jodofenil)-{{0}}(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolijum hlorid (INT)). Nakon miješanja, 0,25 mL ksantin oksidaze (80 U/L)je dodan i reagovao na sobnoj temperaturi 30 s na sobnoj temperaturi. Upijanje je biloizmjereno na 505 nm. Koncentracija proteina u homogenatu testisa određena je metodomBio-Rad DC komplet za analizu proteina i njegova specifična aktivnost (U/mg proteina) je izračunata. Katalaza(CAT) aktivnost je određena prema prethodno objavljenoj metodi [15]. H&E (hematoksilin i eozin) bojenjeTestis je natopljen u 10 posto formalina 24 sata i pohranjen na 4◦C. Isekao maramice umikro veličine i pričvršćena na tobogan. Nakon fiksacije (95 posto metanola plus 5 posto sirćetne kiseline), stakalca su bilapotopljeni u hematoksilin na 3 min, isprani tekućom vodom 5 min, a zatim ih natopljeni50 posto, 70 posto i 90 posto alkohola za jedan minut. Nakon toga, stakalca su obojena eozinom 10 s inatopljen 100 posto alkoholom jednu minutu dok ne izbledi. Konačno, pločica je natopljena ksilenom za jednuminuta. Kasnije je pločica osušena na zraku i zapečaćena. Obojena epruveta je stavljena u obrnuti fazni kontrastmikroskop (mikroskop s invertiranom razlikom faza, Olympus CK-2, Tokio, Japan) za posmatranjemorfologiju.Analiza hipotalamusaMišji KISS1, receptor povezan sa G-proteinom (GPR) 54, supresor signalizacije citokina 3 (SOCS-3)i sirtuin 1 (SIRT1)sekvence gena su identificirane iz NCBI (Nacionalnog centra za biotehnologiju).Informacijska) baza podataka gena i specifičan prajmer je dizajniran korištenjem Primera 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, Kalifornija, SAD). Prajmeri korišteni u eksperimentu navedeni su u tabeli1.

Ekstrakcija ribonukleinske kiseline (RNA) iz hipotalamusa. Ekstrakcija RNK izhipotalamus mozga izveden je korištenjem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. DobijenomRNA su kvantitativno mjerene reverznom transkripcijom (RT) i lančanom reakcijom polimeraze(PCR). DNK komplimenta dobijena RT analizom pohranjena je u−20 ◦C za kasniju upotrebu.Ekstrahirana DNK je podvrgnuta analizi lančane reakcije polimerazom (PCR) upotrebom Taq polimeraze.Zatim, 5~10µL PCR proizvoda je uzeto i analizirano elektroforezom na 1,5% agarukoloid. Slika je snimljena UVP BioDoc-It sistemom za snimanje. Reverzno transkribirano komplementarnouzeta je deoksiribonukleinska kiselina (cDNK) i PCR je urađen korištenjem IQ SYBR Green SupermixKit. Kasnije je analiziran sa softverom optičkog sistema iQTM 5. Proteini su ekstrahovani korišćenjem areagens za ekstrakciju proteina (T-PER). Zatim je u 400 dodato 20 mg homogenata testisaµL T-PER i centrifugiran (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Njemačka) na 4◦C (125,000× g) 20 min. Sljedeća metoda bila je slična "identifikaciji i kvantifikaciji".analiza proteina" u in vitro analizi.2.3. Statistička analizaEksperimentalni rezultati su izraženi kao srednja vrijednost± standardna devijacija (srednja vrijednost± SD) ipodaci su analizirani korišćenjem Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 softvera, IBM, Armonk,Njujork, Njujork, Sjedinjene Američke Države. Razlike između grupa analizirane su jednosmjernom analizomvarijansa (ANOVA). Višestruka poređenja različitih grupa analizirana su Duncanovim testom navrijednost odp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Rezultati

3.1. In vitro analiza

3.1.1. Poređenje antioksidativnih aktivnosti ECH, CTE i RES

Dugotrajni visoki oksidativni stres i kronične upale glavni su uzroci dijabetičarakomplikacije [16]. CTE sadrže različite feniletanoidne glikozide kao što je ehinakozid(ECH) i akteozid, s potencijalom za antioksidativno djelovanje [17]. Čišćenje DPPH radikalaProveden je test za procjenu antioksidativne aktivnosti ECH. Trolox i resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilben, RES) uzete su kao standard i pozitivna kontrola. Kao što je prikazanona slici1, ECH je pokazao bolju aktivnost uklanjanja radikala i aktivnost je bila značajno većanego kod pozitivne kontrole (RES).

3.1.2. Viabilnost ćelija ECH na LC-540 i TM3 Leydig ćelijamaMTT test je urađen za procjenu vijabilnosti ćelija različitih koncentracija ECH.LC-540 Leydigove ćelije i TM3 Leydigove ćelije pokazale su više od 80 posto održivosti nakon tretmana saECH (Slika2). U poređenju s drugim koncentracijama, 100-µM koncentracija (razblaženja od 100µM u 2 posto FBS) ECH-a pokazao je bolju vitalnost ćelija u TM3 Leydigovim ćelijama. Rezultat je pokazao da jepovećana koncentracija ECH ne doprinosi nekoj značajnoj toksičnosti za ćelije.

3.1.3. Učinak ECH na proizvodnju superoksida izazvanu starenjem NBT testom u LC-540 i TM3Leydig Cell

AGE izazivaju oksidativna oštećenja u tijelu zbog oksidacije glukoze i stvaranjaslobodni radikali kao što je O2-, hidroksilni radikali i karbonilne grupe [18]. Nakon stimulacije sa50 µg/mL AGE, LC-540 (Slika3a) i TM3 (Slika3b) ćelije su tretirane sa ECH i RES(5 µM i 10µM svaki). Rezultati su pokazali da je povećana proizvodnja superoksid anionau kontrolnoj grupi (stimulirani AGE), ali je nakon toga smanjena proizvodnja superoksidnog anjonatretman sa ECH i RES. Sa slike3, podrazumijevalo se da ECH i OIE smanjuju nivoproizvodnje superoksida i štite stanice od oksidativnog oštećenja. U slučaju LC-540 ćelija,10 µM ECH je pokazao skoro sličnu aktivnost sa normalnom grupom. Proizvodnja superoksida u obastanica je smanjen s povećanjem koncentracije i ECH i RES.3.1.4. Učinak ECH na H2O2 Proizvodnja u LC-540 Leydig ćelijama stimulisanim AGEDCFH-DA test je izveden za otkrivanje prisustva oksidativnih vrsta. Nakon ulaska ućelije, FL fluorescentna boja DCFH-DA se oksidira unutarćelijskim H2O2 i formira dihlorofluorescein(DCF). Kao što je prikazano na slici4, došlo je do značajnog povećanja intracelularnog H2O2 proizvodnja uAGE stimulisana grupa (kontrolna) dok je dodatak 10µM ECH i OIE su značajno smanjeniH2O2 proizvodnju u ćelijama. Uprava od 10µM ECH je rezultirao sa samo oko 47,1 posto H2O2 proizvodnja, značajno niža nego u kontrolnoj grupi.

3.1.5. Učinak ECH na bijes i NF-κB Nivoi ekspresije proteina u LC-u stimulisanom starenjem-540Leydig Cells

Western blot analiza je izvršena da se potvrdi prisustvo RAGE u LC-540 Leydigućelije. Efekat ECH na bijes (Slika5a) i NF-κB (Slika5b) nivoi ekspresije proteinau Leydigovim ćelijama stimulisanim AGEsom prikazane su na slici5. Rezultati su pokazali da 50µg/mLkoncentracija AGE inducira veći RAGE i NF-κB ekspresija u LC-540 Leydigovim ćelijama i10 µM koncentracija ECH i RES značajno je smanjila ekspresiju RAGE i NF-κB. Izraz NF-κB je bio značajno niži u RES i ECH od RAGE antagonista. Dakle, rezultatipotvrdio da je ECH smanjio nivo upale smanjenjem nivoa RAGE i NF-κB.

.1.6. Utjecaj ECH na put sinteze testosterona u LC-540 Leydig ćelijama stimulisanim AGE.

Proces spermatogeneze i muške neplodnosti zavisi od prisustva testosterona.Kao što je prikazano na slici6, izrazi StAR (Slika6a), CYP11A1 (Slika6b), CYP17A1 (Slika6c), i HSD17 3 (Slika6d) proteini su značajno smanjeni u AGE-stimuliranom LC-540 Leydigućelije (kontrolna grupa). Izrazi StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 proteina su bilaznačajno povećan kada su dodani RAGE antagonist, RES i ECH. Povećanoekspresija StAR i CYP11A1 proteina je uočena u grupama koje su tretirane ECH i RES.Nivo ekspresije CYP17A1 bio je skoro sličan u RES i ECH grupama. IzraziHSD17 3 proteina u Leydigovim ćelijama tretiranim ECH bio je mnogo veći od proteina RES i RAGEćelije tretirane antagonistima. Povećana ekspresija StAR, CYP11A1, CYP17A1 i HSD17 3 proteinaukazuje na normalnu proizvodnju testosterona.

5ćelija/mL i tretman sa RES i ECH(10µM) je davan 24 h. -aktin je uzet kao interna kontrola. Normalna grupa (Nor)je tretiran medijumom, a kontrolna grupa (Con) je tretirana sa AGE (50µg/mL).

Rezultatisu prikazani kao srednji±SD (n = 3). Značajne razlike (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analiziran Duncanovim testom višestrukog dometa.