Ehinakozid stimuliše proliferaciju ćelija i sprečava ćelijsku apoptozu u MODE-K ćelijama epitela creva povećanjem regulacije transformacije ekspresije faktora rasta- 1

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo i Caigan Du

Abstract

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) se široko koristi kao laksativ u biljnoj medicini za liječenje sindroma iritabilnog crijeva ili zatvora, iechinacoside iz cistanche(ECH) je jedan od glavnih bioaktivnih sastojaka ove biljke. Naš cilj je bio istražiti učinak ECH na rast i smrt epitelnih stanica crijeva. MODE-K, linija crijevnih epitelnih stanica, korištena je kao in vitro model crijeva. Proliferacija ćelija je merena metil tiazol tetrazolijumom (MTT) testom. Apoptoza ćelija određena je bojenjem Aneksinom-V. Ovdje smo pokazali da je u kultiviranim MODE-K ćelijama ECH značajno stimulirao proliferaciju stanica i poboljšao preživljavanje stanica smanjenjem apoptoze u prisustvu H2O2 ili mješavine proinflamatornih citokina, dok je transformirao faktor rasta (TGF)- 1 ekspresija je bila povećana na način ovisan o dozi. Obaranje ekspresije TGF- 1 poremetilo je i proliferativnu i citoprotektivnu aktivnost ECH, što je dalje potvrđeno neutralizacijom aktivnosti TGF- 1 upotrebom anti-TGF- 1 antitijela. Ovi podaci sugeriraju da ECH kao jedan od bioaktivnih sastojaka u biljnoj C. deserticola i drugima može poboljšati popravak tkiva sluznice stimulirajući proliferaciju crijevnih epitelnih stanica i sprječavajući smrt stanica putem regulacije TGF-a.

Ključne riječi: Cistanche deserticola, crijevni epitel, ćelijska proliferacija, ćelijska apoptoza, transformirajući faktor rasta (TGF)-

Uvod

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) je uobičajeno poznat kao Rou Cong Rong u kineskoj biljnoj medicini, a postao je nova kultura u Kini zbog svoje medicinske upotrebe (1). Zabilježena je njegova klinička korist u liječenju mnogih zdravstvenih problema uključujući kronični zatvor (2, 3), a njegovi korisni efekti povezani su s laksativnom aktivnošću u crijevima; pojačava vlaženje stolice, pospješujući rad crijeva kod pacijenata (4, 5), kao i kod životinjskih modela (6, 7). Naša nedavna studija pokazuje da oralna primjena vodenog ekstrakta C. deserticola značajno smanjuje broj upalnih hiperplazija u crijevima miševa sklonih kolorektalnom karcinomu (8).

Echinacoside iz cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50 posto ukupnog PhG) izolirano iz C. deserticola (9) i korišteno je kao biomarker za kontrolu kvalitete laksativnog lijeka koji sadrži C. deserticola Ronggui Tongbian Capsule (10) ili za kontrolu kvaliteta proizvodnje uzgojene C. deserticola (11). Pokazalo se da je ECH citoprotektivan i na životinjskom modelu Parkinsonove bolesti (12, 13) i modelu povrede pluća (14) iu kultivisanim ćelijama feohromocitoma (PC12) (15, 16); i pokazalo se da pojačava ćelijsku diobu ljudskih fibroblastičnih ćelija (MRC-5) (17). U ovoj studiji ispitan je učinak ECH kao glavnog bioaktivnog sastojka C. deserticola na proliferaciju stanica i preživljavanje u kultiviranim epitelnim stanicama crijeva kako bi se razumjelo farmakološko djelovanje biljnog lijeka koji sadrži C. deserticola u liječenju crijevnih poremećaja. .

Materijali i metode

Ćelijska kultura

MODE-K je ćelijska linija crijevnog epitela izvedena iz C3H/HeJ miševa (18) koju je ljubazno obezbijedio dr. Theodore Steiner (Vancouver Coastal Health Research Institute, Vancouver, Kanada). MODE-K ćelije su uzgajane u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle's mediju (DMEM), dopunjenom sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) na 37 stepeni pod 5 posto CO2 u atmosferi vazduha.

ehinakozid iz cistanche (ECH) priprema

ECH (echinacoside iz cistanche) je dalje prečišćen iz komercijalnog ekstrakta C. tubulosa (koji sadrži više ili jednako 70 posto ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina) ponovljenom ekstrakcijom etanola, nakon čega slijedi sušenje u hemijskoj haubi. Preostala supstanca je dalje osušena liofilizacijom. ECH u krajnjem proizvodu je potvrđen tečnom hromatografijom visokih performansi (slika 1).

Smanjenje ekspresije transformirajućeg faktora rasta (TGF)- 1

Ekspresija TGF- 1 u MODE-K ćelijama je srušena stabilnom ekspresijom shRNA specifično prema TGF- 1 transkriptu (19). Ukratko, oligonukleotidne sekvence za stvaranje shRNA ciljane mišje TGF- 1 mRNA (5′-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3′) i nespecifične kontrole (šifrovane) (5′-AAT CGC ATA GCG TAT GCC GTT-3′) su prethodno opisani (19, 20), a sintetizirala ih je Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA). Svaka sekvenca je ligirana u pHEX-siRNA vektor (21). Vektori su transficirani u MODE-K ćelije koristeći Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA) prema protokolu proizvođača. I ćelije transficirane anti-TGF- 1 shRNA (MODE-Ktgfb) i kodirane shRNA transficirane (MODE-Kscr) ćelije su uzgajane u prisustvu Zeocina (do 500 ug/mL) (Invitrogen-Gibco) i odabrane sortiranjem ćelija pomoću protočne citometrije za protein zelene fluorescencije (GFP). Više od 95 posto transficiranih ćelija pokazalo je jaku zelenu fluorescenciju u protočnoj citometriji ili mikroskopiji.

Metiltiazol tetrazolijum (MTT) test

MTT test je korišten za mjerenje ćelijske proliferacije ili održivosti u kulturama. Ćelije su zasijane pri 2500 po jažici u 96-mikropločama, i svako stanje je testirano najmanje u četiri primjerka. Ukratko, 10 μL od 0,5 mg/mL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromida (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Kanada) su dodani u svaku jažicu i inkubirani na 37 stepeni 4 h. Kristali formazana u živim ćelijama su zatim otopljeni u 100 μL/jažici dimetil sulfoksida (DMSO, Sigma-Aldrich Canada). Apsorbancija boje u svakoj jažici je kvantifikovana kao jedinice apsorpcije (AU) na talasnoj dužini od 560 nm korišćenjem ELx808 Ultra Microplate Reader-a (BioTek, Winooski, VT, SAD). Procenat promjene proliferacije ćelija u kulturama tretiranim lijekovima u odnosu na kontrolu koja nije tretirana lijekovima izračunat je na sljedeći način: postotak=(lijekom tretiran − kontrola) / kontrola × 100 posto. Brzina rasta je izračunata na sljedeći način: Brzina rasta (AU/dan)=(AUend − AUbegin) / vrijeme (dan), gdje je vrijeme predstavljalo period ispitivanja, AUend je predstavljalo jedinice apsorpcije na kraju ispitivanja , a AU počinje predstavljaju jedinice apsorpcije na početku ispitivanja.

Fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS) analiza apoptoze

FACS analiza sa Annexin-V-phycoerythrin (Anexin-V-PE) i 7-amino-aktinomicinom D (7-AAD) bojenjem je korištena za određivanje apoptoze ćelije (Annexin-V pozitivan: rana apoptoza 7-AAD: kasna apoptoza/nekrotična) prema protokolu proizvođača (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD). Dakle, u FACS grafu, vitalne ćelije su bile u donjem lijevom kvadrantu, kasne apoptotičke ćelije u gornjem lijevom kvadrantu (7-samo AAD pozitivne), apoptotičke ćelije u gornjem desnom kvadrantu (i Aneksin-V i {{ 10}}AAD pozitivne), i rane apoptotičke ćelije u donjem desnom kvadrantu (samo Aneksin-V pozitivne). Ukratko, nakon tretmana, ćelije su puštene kratkom inkubacijom sa tripsin-EDTA rastvorom (Sigma Aldrich Canada) i zatim inkubirane sa Annexin-V-PE u 1 × puferu za vezivanje tokom 15 minuta. Nakon što su isprane sa PBS, ćelije su obojene sa 7-AAD. Intenzitet fluorescencije apoptotičkih ćelija meren je protočnom citometrijom i analiziran u poređenju sa pozadinskim kontrolama korišćenjem softvera CELLQUEST (BD Biosciences) ili FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, SAD).

Semikvantitativna reverzna transkripcija-lančana reakcija polimeraze (RT-PCR)

Nivoi mRNA TGF{{0}} su semikvantitativno određeni u poređenju sa gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenazom (GAPDH) kao interna kontrola korištenjem RT-PCR kompleta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) kao što je prethodno opisano (19). I TGF- 1 i GAPDH transkripti u istom cDNK preparatu su amplificirani PCR-om sa 35 ciklusa od 94 stepena u trajanju od 1 min, 57 stepena u trajanju od 1 min i 15 s i 72 stepena u trajanju od 1 min i 30 s nakon početnog korak denaturacije na 94 stepena u trajanju od 1 min. Dodan je završni korak proširenja na 72 stepena u trajanju od 10 minuta. Specifični parovi prajmera za TGF- 1 i GAPDH izvedeni su iz prethodnog izveštaja (19) (mTGF- 1: sense, 5′-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC, i anti-sense, 5 ′- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: smisao, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G, i antisens, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Dobijeni PCR proizvod (25 μL) je podvrgnut elektroforezi na 1% agaroznom gelu u Tris-acetat-EDTA (TAE) puferu koji sadrži 0,5 ug/mL etidijum bromida i vizualiziran pod UV svjetlom. Nivoi ekspresije TGF- 1 su semikvantitativno upoređeni sa onima GAPDH.

Western blot

Ćelijski nivoi TGF- 1 su ispitani western blotingom kao što je prethodno opisano (19). TGF- 1 proteinske trake u blot-u su identifikovane sa monoklonskim anti– TGF- 1 (A75-3) (BD Biosciences). Isti blot je ponovo ispitan upotrebom anti-aktin IgG (Sigma-Aldrich Canada) za potvrdu napunjenog proteina u svakom uzorku.

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) Nivoi izlučenog TGF- 1 u supernatantima kulture određivani su ELISA-om. MODE-K ćelije (1,8 × 105 ćelija/jažici u 0,5 mL DMEM medija) u 24-pločama u tri primjerka su uzgajane preko noći, nakon čega je uslijedila inkubacija u odsustvu ili prisustvu ECH(echinacoside iz cistanche). Supernatanti kulture su sakupljeni nakon 24 h tretmana, a količina otpuštanja TGF- 1 određena je korištenjem TGF 1 Emax® ImmunoAssay sistema prema protokolu proizvođača (Promega, Madison, WI, SAD).

Statističke analize

Jednosmjerna ili dvosmjerna analiza varijanse (ANOVA) korištena je kao prikladno za poređenje između grupa. Podaci su prikupljeni od 3 do 4 pojedinačna eksperimenta u svakoj studiji za statističku analizu. P-vrijednost manja ili jednaka 0.05 se smatra značajnom.

Rezultati

Stimulacija ćelijske proliferacije u MODE-K ćelijskim kulturama

Proliferacija ćelija je neophodna za popravku tkiva. Efekat ECH(echinacoside iz cistanche)na proliferaciju ćelija ispitivana je u kultivisanim MODE-K ćelijama. Kao što je prikazano na slici 2A, dodavanje ECH-a je stimulisalo proliferaciju ćelija, mereno povećanjem vitalnosti ćelije korišćenjem MTT testa, na način ovisan o dozi. U poređenju sa brojem ćelija u kulturama koje nisu tretirane lekovima, broj ćelija u kulturama tretiranim ECH povećan je za 25,6 procenata ± 14,82 procenata u kulturama sa 6,26 ug/mL ECH, 33,6 procenata ± 14.{14}} procenata sa 25 ug/mL ECH, 64,4 posto ± 9.0 posto sa 50 ug/mL ECH, i 99,4 posto ± 11,7 posto sa 100 ug/ mL ECH nakon 48-h inkubacije (P < 0.0{{50}}01).="" da="" bi="" se="" dodatno="" potvrdilo="" ovo="" zapažanje,="" ispitan="" je="" uticaj="" ech="" na="" mode-k="" krivu="" rasta="" ćelija="" u="" vremenskom="" periodu="" od="" {{30}}="" dana.="" kao="" što="" je="" prikazano="" na="" slici="" 2b,="" dodavanje="" optimizovanog="" 10="" ug/ml="" ech-a="" značajno="" je="" povećalo="" broj="" živih="" ćelija="" nakon="" vremena="" inkubacije="" u="" poređenju="" sa="" onima="" u="" kulturama="" koje="" nisu="" tretirane="" lekovima="" (bazalna="" kontrola),="" na="" šta="" ukazuje="" povećanje="" au="" za="" kulture="" sa="" ech="" od="" 0.3{{70}}="" ±="" 0.02="" na="" početku="" tretmana="" ech="" (0-vremenska="" tačka)="" do="" 1,49="" ±="" 0,08="" nakon="" 2="" dana="" inkubacije="" i="" 2,20="" ±="" 0,11="" nakon="" 4="" dana="" inkubacije,="" dok="" je="" za="" kulture="" koje="" nisu="" tretirane="" lijekovima="" (samo="" medij)="" povećanje="" od="" 0,24="" ±="" 0,01="" na="" početku="" na="" 1,22="" ±="" 0,12="" nakon="" 21="" dana="" i="" ±="" 0,12="" nakon="" 21="" dana="" nakon="" 4="" dana="" (srednja="" u="" odnosu="" na="" ech,="" p="">< 0,0001).="" stope="" rasta="" u="" ove="" dvije="" kulture,="" izračunate="" na="" osnovu="" krivulje="" rasta="" (slika="" 2b),="" pokazuju="" da="" je="" ech="" značajno="" povećao="" stope="" rasta="" u="" kulturama="" oba="" dana="" 2="" (0,56="" u="" kulturama="" tretiranim="" ech="" naspram="" 0,35="" u="" kontrolama="" koje="" nisu="" tretirane="" lijekom)="" i="" dan="" 3="" (0,43="" u="" kulturama="" tretiranim="" ech="" prema="" 0,22="" u="" kontrolama="" koje="" nisu="" tretirane="" lijekom)="" (slika="" 2c).="" uzeti="" zajedno,="" ovi="" podaci="" ukazuju="" da="" ech="" stimuliše="" proliferaciju="" ćelija="" u="" kultivisanim="" epitelnim="" ćelijama="">

Slika 2. Stimulacija rasta ćelija u kultivisanim intestinalnim epitelnim ćelijama pomoću ECH. MODE-K ćelije (2,500 ćelije/bažirić) su zasijane u 96-ploče sa bunarima preko noći, nakon čega je uslijedila inkubacija u prisustvu ili odsustvu ECH. Broj živih ćelija u kulturama meren je MTT testom. A) Kulture su tretirane različitim koncentracijama ECH tokom 48 h. Povećanje (posto) broja ćelija u kulturama tretiranim ECH izračunato je na osnovu kultura koje nisu tretirane lijekom kao bazalne reference. P < 0,0001="" (jednosmjerna="" anova).="" b)="" kulture="" su="" tretirane="" sa="" 10="" ug/ml="" ech="" tokom="" 4="" dana.="" krive="" rasta="" kultura="" tretiranih="" ech="" u="" odnosu="" na="" kulture="" koje="" nisu="" tretirane="" lijekovima="" (samo="" medij)="" određene="" su="" jedinicama="" apsorpcije="" (au)="" na="" 560="" nm="" u="" mtt="" testu.="" p="">< 0,0001="" (srednja="" u="" odnosu="" na="" ech,="" dvosmjerna="" anova).="" podaci="" su="" predstavljeni="" kao="" srednja="" vrijednost="" ±="" standardna="" derivacija="" (sd)="" nezavisnih="" eksperimenata.="" c)="" stopa="" rasta="" (au="" promjena/dan)="" izračunata="" je="" na="" osnovu="" rasta="">e, srednji broj svakog dana.

Zaštita MODE-K ćelija od apoptoze

Zaštita ćelija od apoptoze je mehanizam prevencije daljeg oštećenja tkiva. Citoprotektivna aktivnost ECH(echinacoside iz cistanche)je ispitivan u kultivisanim MODE-K ćelijama stimulisanim vodonik peroksidom (H2O2) ili mešavinom proinflamatornih citokina (TNF- i IFN-). H2O2 je reaktivna kisikova vrsta koja nastaje oksidativnim metabolizmom i predstavlja scenarij oksidativnog stresa, dok su TNF- i IFN- istaknuti citokini proizvedeni od strane aktiviranih imunoloških stanica koje odražavaju situaciju pod imunološki posredovanom upalom. Kao što je prikazano na slici 3, dodatak ECH (50 ug/mL) značajno je smanjio apoptozu uključujući njen bazalni nivo u kulturama tretiranim s H2O2, što je dokazano smanjenjem apoptoze sa bazalnih nivoa od 5,3{{47 }} posto ± 1,24 posto u kulturama koje nisu tretirane lijekovima do 3,76 posto ± 1.01 posto u kulturama tretiranim ECH, od 26,93 posto ± 1.86 posto u kulturama koje nisu tretirane lijekovima na 14,08 posto ± 1,30 posto u kulturama tretiranim ECH u prisustvu 0,3 μM H2O2, i od 38,90 posto ± 1,76 posto u kulturama koje nisu tretirane lijekovima do 19,88 posto ± 1,02 posto u kulturama tretiranim ECH u prisustvu 0,6 μM H2O2 (0P , srednja/neliječena u odnosu na ECH-liječena). Sličan citoprotektivni efekat ECH uočen je u kulturama stimulisanim mešavinom citokina (slika 4); apoptoza (51,5 procenata ± 6,30 procenata) u kulturama bez dodatka ECH (kontrole koje nisu tretirane medijumom/nelekovima) bila je značajno veća od one (38,50 procenata ± 5,60 procenata) u kulturama tretiranim ECH (P=0.0204, mediju/neliječeni u odnosu na ECH-tretirani), što sugerira da je ECH zaštitio MODE-K ćelije od proinflamatorne apoptoze izazvane citokinom. Uzeti zajedno, ECH ima citoprotektivnu aktivnost protiv apoptoze ćelije izazvane oksidacijom H2O2, kao i citotoksičnost proinflamatornih citokina.

Povećana regulacija ekspresije TGF-a u kultivisanim MODE-K ćelijama

Dokazi u literaturi upućuju na to da TGF- 1 igra važnu ulogu u ozljedama i obnavljanju tkiva (22, 23) i u oporavku gastrointestinalnog trakta od kolitisa ili upalne bolesti crijeva (24). Da bi se ispitalo da li TGF- 1 igra ulogu u proliferaciji ćelija izazvanoj ECH i citoprotekciji u kultivisanim intestinalnim epitelnim ćelijama kao što je gore prikazano, efekat ECH(echinacoside iz cistanche)ispitivana je ekspresija TGF{{0}} u kultivisanim MODE-K ćelijama. Nivoi transkripta TGF- 1 su ispitivani semikvantitativnim RT-PCR, dok su nivoi njegovih proteina određeni western blottingom (ukupni ćelijski nivoi) ili ELISA (nivoi izlučenog proteina). Kao što je prikazano na slici 5A, dozno-zavisna regulacija nivoa TGF- 1 mRNA uočena je u kulturama tretiranim sa ECH i 24 i 48 h nakon dodavanja ECH. Sličan trend povećanja nivoa TGF{{10}} proteina u ćelijama demonstriran je Western blotting analizom (slika 5B). Nakon 24-h inkubacije u 0,5 mL podloge za kulturu koja je sadržavala različite koncentracije ECH, izlučeni nivoi TGF- 1 su također povećani na način neovisno o dozi; od 186,4 ± 18,39 pg/mL u kulturama koje nisu tretirane lijekovima (bazni nivoi) na 186,4 ± 18,39 pg/mL u kulturama sa 25 ug/mL ECH, 263,4 ± 14,14 pg/mL sa 50 ug/mL sa 50 ug/mL i ±6 ECH, 4 ± 4 15,56 pg/mL sa 100 ug/mL ECH (P < 0,0001).="" svi="" ovi="" podaci="" jasno="" ukazuju="" da="" ech="" povećava="" proizvodnju="" tgf-="" 1="" u="" epitelnim="" ćelijama="" crijeva="" u="">

Gubitak stimulacije rasta i citoprotekcije ehinakozida genetskim uništavanjem ekspresije TGF- 1

Da razjasnimo da li je TGF- 1 doprinio stimulaciji rasta i smanjenju apoptoze u ECH(echinacoside iz cistanche)-tretirane ćelije, ekspresija TGF- 1 u MODE-K ćelijama je srušena stabilnom ekspresijom anti-TGF- 1 shRNA, čime je stvorena nova ćelijska linija MODE-Ktgfb. Ekspresija TGF- 1 proteina je u velikoj meri smanjena u MODE-Ktgfb ćelijama u poređenju sa onom u MODE-Kscr ćelijama koje su stabilno eksprimirale kodiranu shRNA (slika 6A). Kao što je prikazano na slici 6B, proliferativna stimulacija ECH bila je značajno poremećena u MODE-Ktgfb ćelijama; slično proliferativnom odgovoru na ECH u roditeljskim MODE-K ćelijama (Slika 2), broj živih ćelija je povećan u MODE-Kscr ćelijama nakon ECH stimulacije, 28,3% ± 12,4% porasta u kulturama sa 25 ug/mL ECH, Povećanje od 54,2 posto ± 6,8 posto sa 5{{30}} ug/mL ECH, i povećanje od 122,7 posto ± 20,8 posto u kulturama sa 100 ug/mL ECH. Nasuprot tome, broj ćelija je smanjen u prisustvu ECH u MODE Ktgfb ćelijskim kulturama, 12,0 posto ± 5,0 posto smanjenje u kulturama sa 25 ug/mL ECH, 18,3 posto ± 4,1 posto smanjenje sa 50 ug/mL ECH, i 30,4 posto ± 3,3 posto smanjeno je sa 100 ug/mL ECH. Statistička analiza sa dvosmjernom ANOVA-om ukazala je na značajnu razliku proliferativnog odgovora na ECH između ove dvije grupe (P < 0,0001).="" ovi="" podaci="" sugeriraju="" da="" gubitak="" ekspresije="" tgf-="" 1="" u="" epitelnim="" stanicama="" crijeva="" narušava="" stimulaciju="" rasta="">

Da se dalje ispita da li je ekspresija TGF- 1 regulisana naviše u ECH(echinacoside iz cistanche)-tretirane ćelije rezultirale su smanjenjem apoptoze, anti-apoptotička aktivnost ECH je ispitana u MODE-Ktgfb ćelijama naspram MODE-Kscr ćelija. Kao što je prikazano na slici 6C, u poređenju sa MODE-Kscr ćelijskim kulturama, nivoi apoptoze su bili viši u MODE-Ktgfb ćelijskim kulturama u odsustvu citokina (11,2 procenta ± 0.42 procenta u MODE-Ktgfb vs. 9,6 posto ± 0,99 posto u MODE-Kscr) iu prisustvu citokina (20,95 posto ± 0.07 posto u MODE- Ktgfb naspram 15,4 posto ± 1,56 posto u MODE-Kscr) (P=0.0{{60}}13), što sugerira da je TGF- 1 anti -apoptotički faktor u MODE K ćelijama. Dodavanje ECH (50 ug/mL) MODE-Kscr ćelijskim kulturama značajno je smanjilo bazalne nivoe apoptoze (9,6 posto ± 0,99 posto kod neliječenih u odnosu na 8,3 posto ± 0,43 posto kod tretiranih ECH) i 30,2 posto smanjenja apoptoze je pronađeno u kulturama stimuliranim citokinima (15,4 posto ± 1,56 posto u neliječenim lijekovima naspram 10,75 posto ± 1,05 posto u tretiranim ECH). Međutim, u MODE-Ktgfb ćelijskim kulturama, ECH nije smanjio bazalne nivoe apoptoze (11,2 posto ± 0,42 posto kod neliječenih u odnosu na 12,0 posto ± 0,43 posto kod tretiranih ECH), i samo 16,71 posto smanjenja apoptoze, u poređenju sa 30,2 procenta u MODE-Kscr ćelijskim kulturama, uočeno je u kulturama stimulisanim citokinima (20,95 procenata ± 0,07 procenata kod netretiranih lekova naspram 17,45 procenata ± 0,35 procenata kod tretiranih ECH). Ovi podaci ukazuju na to da smanjenje ekspresije TGF- 1 u epitelnim stanicama crijeva pogoršava apoptozu i smanjuje citoprotektivnu aktivnost ECH.

Gubitak stimulacije rasta i citoprotekcije ECH(echinacoside iz cistanche)neutralizacijom aktivnosti TGF- 1 upotrebom antitijela

Za dodatnu potvrdu da bi TGF- 1 mogao biti potreban za stimulaciju rasta i citoprotekciju ECH(echinacoside iz cistanche)u epitelnim ćelijama crijeva kao što je gore opisano (slika 6), efekat neutralizirajućeg anti-TGF- 1 antitijela (klon 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, SAD) na ECH posredovan ćelijska proliferacija i preživljavanje ispitani su u MODE-K ćelijskim kulturama. Kao što je prikazano na slici 7A, dodavanje ECH (25 ug/mL) stimuliralo je povećanje broja ćelija za 44,3 posto ± 8,2 posto u kontrolama koje nisu tretirane antitijelima, ali u prisustvu anti-TGF- 1 antitijela , gubitak broja ćelija od 11,3 posto ± 9,10 posto je uočen u istim kulturama tretiranim ECH, što sugerira da je neutralizirajuća aktivnost TGF- 1 smanjila stimulaciju rasta ECH u epitelnim stanicama crijeva. Dalji eksperimenti su pokazali da anti-TGF- 1 antitijelo također neutralizira citoprotektivnu aktivnost ECH u MODE-K ćelijskim kulturama; dodatak ECH je smanjio apoptozu sa 4,37 posto ± 1,19 posto u kulturama koje nisu tretirane lijekovima na 1,72 posto ± {{0}}, 01 posto u kulturama tretiranim ECH nakon 24 sata inkubacije i sa 11,13 posto ± 1,12 posto u kulturama koje nisu tretirane lijekovima do 9,13 posto ± 0,02 posto u kulturama tretiranim ECH nakon 48 h inkubacije (nelijek/medij u odnosu na ECH, dvosmjerna ANOVA, P=0.0001). Međutim, u prisustvu anti-TGF- 1 antitijela apoptoza u kulturama tretiranim ECH (2,88 posto ± 0,01 posto nakon 24- h inkubacije; 12,58 posto ± 0,02 posto nakon 48- h inkubacije ) se nije značajno razlikovao od onih u kontrolnim kulturama (neliječenim) (dvosmjerna ANOVA, P=0.9427), što implicira da anti-TGF- 1 antitijelo ometa preživljavanje posredovano ECH u crijevima epitelne ćelije.

Diskusija

ECH(echinacoside iz cistanche)nije samo glavni PhG u ekstraktu biljnog Cistanche spp. ali iu mnogim drugim ljekovitim biljkama kao što je Echinacea spp. (25, 26). Prijavljeno je da ovo prirodno jedinjenje ima antioksidativnu aktivnost in vitro i in vivo (13, 27, 28). Međutim, mehanizam(i) njegovog djelovanja ostaje nepoznat. Naši rezultati iz ove studije po prvi put pokazuju u in vitro modelu da ECH stimuliše proliferaciju i preživljavanje epitelnih ćelija crijeva, što ovisi o TGF- 1.

Dodatak ECH(echinacoside iz cistanche)smanjuje apoptozu ćelija u MODE-K ćelijama tretiranim H2O2- ili proinflamatornom mešavinom citokina (TNF- i IFN-) (slike 3 i 4), kao i u drugim tipovima ćelija (16, 29), i Knokdown ekspresije TGF- 1 ili blokiranje njegove aktivnosti rezultira ukidanjem njegove anti-apoptotske aktivnosti (slike 6 i 7), što ukazuje da citoprotekcija ECH zavisi od proizvodnje TGF- 1 (slika 5). Naša prethodna studija je pokazala da TGF- 1 inducira anti-apoptotičku ekspresiju Bcl-2 i sprečava TNF posredovanu apoptozu u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama (19). Slični nalazi su prijavljeni i kod drugih tipova ćelija; dodatak TGF- 1 u kultivisanim endotelnim ćelijama plućne arterije povećava nivo Bcl-2 i sprečava apoptozu izazvanu deprivacijom seruma i blokadom receptora faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF) (30); iu kultivisanim neuralnim progenitorskim ćelijama (NPC), povećava (za približno 76 procenata) preživljavanje ćelija u odnosu na tretman H2O2, što je u korelaciji sa povećanom regulacijom ekspresije Bcl-2 (31). Iako efekat ECH na ekspresiju Bcl-2 u MODE-K ćelijama nije ispitan u ovoj studiji, korelacija Bcl-2 up-regulacije sa anti-apoptotičkom aktivnošću ECH je prijavljena u TNF-u. - –tretirane SHSY5Y neuronske ćelije (29) ili H2O2-tretirane PC12 ćelije (15). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da anti-apoptotička aktivnost ECH može biti posredovana TGF- 1 putem Bcl-2 puta.

Moguće je da je citoprotekcija ECH(echinacoside iz cistanche)može doprinijeti blagom povećanju broja živih ćelija smanjenjem spontane ćelijske smrti na kraju inkubacije, ali dodavanje ECH (100 ug/mL) skoro udvostručuje vitalne ćelije nakon 48-h tretmana (slika 2A) , što sugeriše da ECH zaista stimuliše proliferaciju ćelija što dalje potvrđuju podaci na slici 2, B i C. Sličan efekat ECH je prijavljen u ljudskim fibroblastnim ćelijama, MRC-5 (17): u MRC{ {6}} ćelijske kulture, ECH bi mogao usporiti ćelijsko starenje indukujući ćelijski ciklus iz G1 faze u S fazu i G2 fazu. Kao i anti-apoptotička aktivnost ECH, proliferativna aktivnost ECH zavisi od TGF- 1 (slike 6 i 7) za koji je dobro dokumentovano da je multifunkcionalni citokin (32, 33). TGF- može stimulirati proliferaciju stanica ili inducirati zaustavljanje rasta ovisno o tipu ćelije ili ekstracelularnom mikrookruženju; on aktivira višestruke signalne puteve uključujući Smads i non-Smads (npr. protein kinaze aktivirane mitogenom) (34, 35), ali koji put posreduje proliferaciju ćelija stimulisanu ECH/TGF u MODE-K ćelijama treba dalje istražiti.

Do danas se malo zna o ciljnom proteinu(ima) ECH(echinacoside iz cistanche)ili signalne putanje(e) koje reguliše. Jedna studija pokazuje da ECH tretman povećava ćelijske nivoe cikličkog gvanozin monofosfata (cGMP) u endotelnim ćelijama (36), a dodatak 8-Brom-cGMP umjereno povećava ekspresiju TGF- 1 u srčanim fibroblastima (37 ). Međutim, da li tretman ECH podiže cGMP i kojim ECH stimuliše ekspresiju TGF- 1 u kultivisanim intestinalnim epitelnim ćelijama treba dalje istražiti.

U zaključku, naša studija pokazuje da ECH(echinacoside iz cistanche)indukuje proizvodnju TGF- 1 koja posreduje u proliferaciji ćelija i preživljavanju ćelija u kultivisanim epitelnim ćelijama creva. TGF-signalizacija u crijevnom epitelu potrebna je za popravak ozljede sluznice ili zacjeljivanje kod miševa s kolitisom izazvanim dekstran sulfatom (38), što sugerira da ECH, možda biljni C. deserticola koji sadrži ECH ili drugi, može imati terapeutski potencijal za promicanje ozljede sluznice popravka kod pacijenata.

Priznanje

YJ je podržala stipendija diplomiranih studenata iz Kineskog vijeća za stipendije, Kina.

Reference

1 Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Zhu WC, Xu J. Cistanche deserticola Ma uzgaja se kao nova kultura u Kini. Genet Resour Crop Evol. 2009;56:137–142.

2 Jiang Y, Tu PF. Analiza hemijskih sastojaka u vrstama Cistanche. J Chromatogr A. 2009;1216:1970–1979.

3 Tu PF, Wang B, Deyama T, Zhang ZG, Lou ZC. [Analiza feniletanoidnih glikozida Herba Cistanchis pomoću RP-HPLC]. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997;32:294–300. (tekst na kineskom sa sažetkom na engleskom)

4 Huang X, Li Z. [Klinička efikasnost rastvora koji sadrži Cistanche u liječenju zatvora nakon moždanog udara]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integrated Trad West Med). 2002;22:622–623. (na kineskom)

5 Zhang B, Lu X, Zhang R, Li L, Li C. [Studija o laksativnom djelovanju Cistanche deserticola]. Zhong Yao Cai (J Chin Med Mater). 1992;15:33–35. (na kineskom)

6 Tu P, Li S, Li Z, Wang C, Lou Z. [Poređenje o vlaženju crijeva i laksaciji herba Cistanches]. Nat Prod Res Dev. 1997; 11:48–51. (tekst na kineskom sa sažetkom na engleskom)

7 Zhang B, Zhao X, Chen S, Liu L, Cheng H. [Laksativno djelovanje odvojenih dijelova herba Cistanche]. Zhongguo Zhongyiyao Xinxi Zazhi (Chin J Inform Trad Chin Med). 2003;10:31–32. (tekst na kineskom sa sažetkom na engleskom)

8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. Smanjenje upalne hiperplazije u crijevima kod miševa sklonih raku debelog crijeva pomoću vodenog ekstrakta Cistanche deserticola. Phytother Res. U štampi.

9 Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. Antizamorna aktivnost ekstrakta bogatog feniletanoidima iz Cistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313–315.

10 Jing M, Song S, Li J. [Studija o procesu ekstrakcije i pročišćavanja kapsula Ronggui Tongbian]. Moderna brada med. 2009;11: 18–20. (tekst na kineskom sa sažetkom na engleskom)

11 Wu Y, Shi HM, Bao Z, Wang MY, Tu PF, Li XB. Primjena molekularnih markera u predviđanju kvaliteta proizvodnje uzgojene Cistanche deserticola. Biol Pharm Bull. 2010;33:334–339.

12 Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektivni efekti ehinakozida u mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13 Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Neurotrofni i neurorescue efekti ehinakozida u subakutnom MPTP mišjem modelu Parkinsonove bolesti. Brain Res. 2010;1346:224–236.

14 Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L, Zhao J. Zaštita ehinakozida od akutne ozljede pluća uzrokovane oleinskom kiselinom kod pacova. Free Radic Res. 2007;41:798–805.

15 Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L, Zheng X. Zaštitni efekti ehinakozida, jednog od feniletanoidnih glikozida, na H2O2- indukovanu citotoksičnost u PC12 ćelijama. Planta Med. 2009;75: 1499–1504.

16 Kuang R, Sun Y, Zheng X. Supresija dušikovog oksida impliciranog u zaštitnom efektu ehinakozida na H2O2-indukovane povrede PC12 ćelija. Nat Prod Commun. 2010;5:571–574.

17 Xie H, Zhu H, Cheng C, Liang Y, Wang Z. Echinacoside usporava ćelijsko starenje ljudskih fibroblastičnih ćelija MRC-5. Pharmazie. 2009;64:752–754.

18 Vidal K, Grosjean I, Evillard JP, Gespach C, Kaiserlian D. Imortalizacija intestinalnih epitelnih ćelija miša pomoću SV40- velikog T gena. Fenotipska i imunološka karakterizacija MODE-K stanične linije. J Immunol Methods. 1993;166:63–73.

19 Guan Q, Nguan CY, Du C. Ekspresija transformirajućeg faktora rasta-beta1 ograničava bubrežnu ishemiju-reperfuziju. Transplantacija. 2010;89:1320–1327.

20 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH, et al. TGF-beta1 siRNA potiskuje tubulointersticijsku fibrozu u bubregu zbog opstrukcije uretera. Exp Mol Pathol. 2006;81: 48–54.

21 Du C, Wang S, Diao H, Guan Q, Zhong R, Jevnikar AM. Povećanje otpornosti tubularnih epitelnih ćelija na apoptozu terapijom shRNA poboljšava ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu bubrega. Am J Transplant. 2006;6:2256–2267.

22 Douglas HE. TGF-ss u zacjeljivanju rana: pregled. J Njega rane. 2010;19:403–406.

23 Grande JP. Uloga transformirajućeg faktora rasta-beta u ozljedama i popravci tkiva. Proc Soc Exp Biol Med. 1997; 214:27–40.

24 Monteleone G, Boirivan M, Pallone F, MacDonald TT. TGF beta1 i Smad7 u regulaciji IBD. Mucosal Immunol. 2008;1 Dodatak 1:S50–S53.

25 Bauer R, Foster S. Analiza alkamida i derivata kafeinske kiseline iz Echinacea simulate i E. paradoxa korijena. Planta Med. 1991;57:447–449.

26 Perry NB, Burgess EJ, Glennie VL. Standardizacija ehinaceje: analitičke metode za fenolne spojeve i tipične razine u ljekovitim vrstama. J Agric Food Chem. 2001;53:849–857.

27 Pellati F, Benvenuti S, Magro L, Melegari M, Soragni F. Analiza fenolnih spojeva i aktivnosti uklanjanja radikala Echinacea spp. J Pharm Biomed Anal. 2004;35:289–301.

28 Wu Y, Li L, Wen T, Li YQ. Zaštitni efekti ehinakozida na hepatotoksičnost izazvanu tetrahloridom kod štakora. Toksikologija. 2007;232:50–56.

29 Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB, Wang YH. Ehinakozid spašava SHSY5Y neuronske ćelije od apoptoze izazvane TNFalpha. Eur J Pharmacol. 2004;505:11–18.

30 Lu Q. Transformirajući faktor rasta-beta1 štiti od apoptoze endotelnih ćelija plućne arterije preko ALK5. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008;295:L123–L133.

31 Park SM, Jung JS, Jang MS, Kang KS, Kang SK. Transformirajući faktor rasta-beta1 reguliše sudbinu kultiviranih neuronskih progenitorskih ćelija kičmene moždine. Cell Prolif. 2008;41:248–264.

32 Massague J. Kako ćelije čitaju TGF-beta signale. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1:169–178.

33 Rahimi RA, Leof EB. TGF-beta signalizacija: priča o dva odgovora. J Cell Biochem. 2007;102:593–608.

34 Moustakas A, Heldin CH. Ne-Smad TGF-beta signali. J Cell Sci. 2005;118:3573–3584.

35 Schmierer B, Hill CS. TGF beta-SMAD transdukcija signala: molekularna specifičnost i funkcionalna fleksibilnost. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8:970–982.

36 He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ, Tu PF. Ehinakozid izaziva relaksaciju zavisnu od endotela u prstenovima aorte štakora putem NO-cGMP puta. Planta Med. 2009;75:1400–1404.

37 Abdelaziz N, Colombo F, Mercier I, Calderone A. Dušikov oksid smanjuje ekspresiju transformirajućeg faktora rasta-beta3 mRNA u srčanim fibroblastima pacova putem destabilizacije. Hipertenzija. 2001;38:261–266.

38 Beck PL, Rosenberg IM, Xavier RJ, Koh T, Wong JF, Podolsky DK. Transformirajući faktor rasta-beta posreduje zacjeljivanje crijeva i osjetljivost na ozljede in vitro i in vivo kroz epitelne stanice. Am J Pathol. 2003;162:597–608.