Ehinakozid usporava ćelijsko starenje ljudskih fibroblastičnih ćelija MRC-5

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Aktivni sastojak Cistanchea: Kako ehinakozid djeluje protiv starenja?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

U ovoj studiji istražen je učinak ehinakozida, jednog od feniletanoida izolovanih iz stabljika salse Cistanches, kineskog tradicionalnog biljnog lijeka, na MRC{0}} ćelije fibroblasta pluća ljudskog embrija. Aktivnost proliferacije ćelija je procenjena pomoću Alamar Blue, pokazujući da tretman ehinakozidom može usporiti starenje. Rezultati protočne citometrije pokazuju da ehinakozid može pokrenuti ćelije u G1 fazi da uđu u S fazu i G2 fazu, i može poboljšati degradaciju ROS. Rezultati ispitivanja komete pokazuju da bi ehinakozid mogao zaštititi ćelije od oštećenja DNK, dijelom razjašnjavajući mehanizam njegovog djelovanja. Svi gore navedeni rezultati sugeriraju da ehinakozid ima potencijalnu aktivnost protiv starenja.

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

1. Uvod

Normalne ćelije kultivisane in vitro razmnožavaju se za ograničeni broj udvostručenja populacije ('Hayflflick limit') i ulaze u fazu replikativnog starenja. Stareće ćelije prolaze kroz zaustavljanje rasta ćelija u G1 fazi i promjenu u morfologiji i metabolizmu, uključujući povećanje ćelije, povećanu biogenezu lizosoma i ekspresiju veće aktivnosti galaktozidaze pri pH 6 (galaktozidaza povezana sa starenjem, SA- - -Gal ) (Hayflflick i Moorhead 1961; Dimri 1995). Akumulacija senescentnih ćelija predviđa opadanje vezano za starenjetkiva/organfunkcije. Kako bi se pristupilo načinu odlaganja ili preokretanja starenja, napori da se otkriju aktivne supstance protiv starenja nikada nisu prestale.Echinacosideje jedan od feniletanoida izolovanih iz stabljikaCistanches salsa, kineski tradicionalni biljni lijek, koji ima potencijalno biološko djelovanje, i kao antiserum i kao antiserumprotiv umoraagent (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Takođe je prijavljeno da se in vitro ponaša kao moćnobesplatnoradikalanscavenger(Facino et al. 1995.) i eksponatineuroprotektivniaktivnostiin vitro i in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Ehinakozid može biti kandidat za supstancu protiv starenja, a aktivnost protiv starenja može biti jedno od njegovih bioloških svojstava. Stoga smo tretirali stari ljudski embrion fibroblastne ćelijske linije MRC-5 sa ehinakozidom, očekujući da može usporiti ili poništiti starenje.

2. Istraživanja i rezultati

Prvo smo dodali ehinakozid u medijum kulture da bismo proverili njegov uticaj na rast ćelija i ćelijske cikluse. Uočeno je da se vitalnost ćelija sa 48 h izloženosti ehinakozidu evidentno povećava u odnosu na kontrolu, kako se koncentracija povećava (slika 1A), što ukazuje da je ehinakozid pomogao da se stare ćelije razmnožavaju. Rezultat bojenja SA-Gal-om pokazao je da se nivo SA--Gal-a očigledno smanjio nakon tretmana ehinakozidom (podaci nisu prikazani), što sugerira da je dio senescentnih ćelija obrnut od starenja. Da bi se potvrdilo da li su stare ćelije zaista podstaknute na proliferaciju ehinakozidom, uvedena je srodna citometrija kako bi se provjerila promjena faze ćelijskog ciklusa u starim MRC-5 ćelijama nakon tretmana ehinakozidom. U našem istraživanju smo uočili da se povećanjem koncentracije ehinakozida postepeno smanjivao omjer ćelija u G1 periodu. Naprotiv, više ćelija je ušlo u S fazu i G2 fazu (slika 1B). Akumulacija heterohromatinskih žarišta povezanih sa starenjem (SAHF) je još jedan specifičan biomarker starenja ćelija (Shay i Wright 2001). Stareće ćelije su pokazivale punktirane DNK žarišta koja su vizualizovana Hoechstovim bojenjem (slika 1C). Nasuprot tome, činilo se da ćelije MRC{12}} tretirane ehinakozidom imaju manje SAHF.

Nivo reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) raste kako se ćelije približavaju Hayflflick granici (Hutter et al. 2002). Kontinuirani tretman ćelija sa subletalnim nivoima ROS ne samo da povećava nivo produkata oksidativnog oštećenja kao što je lipofuscin (Sitte et al. 2001) već takođe uzrokuje trajno zaustavljanje rasta praćeno aktivacijom p53- inhibitora rasta put (Toussaint et al. 2000). Stoga, na ćelijskom nivou, ROS igra ključnu ulogu u izazivanju starenja. FL fluorescentna boja DCFH-DA je korištena za mjerenje sadržaja ROS-a uz pomoć druge citometrije. Pokazalo se da je u odnosu na kontrolu, sadržaj ROS evidentno smanjen u ćelijama inkubiranim sa ehinakozidom (slika 2A). Ovi rezultati ukazuju na toechinacosidemože djelovati kao antioksidans, smanjujući proizvodnju ROS-a ili ubrzavajući uklanjanje ROS-a.

Akumulirane reaktivne vrste kiseonika (ROS) uzrokuju značajno oštećenje makromolekula u ćelijama, uključujući proteine, DNK i telomere (Kovtun et al. 2007). Oksidativna oštećenja DNK izazivaju p53-zavisno zaustavljanje rasta G1, nakon ekspresije p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) i starenja ćelija u normalnim ljudskim fibroblastima. Koristili smo test kometa da izmerimo oštećenje DNK i njegovu popravku. Veličina fragmenata DNK i broj lomova određuju migraciju i obrazac viđene komete. Sadržaj repne DNK (proizvod dužine repa i sadržaja repne DNK) se povećava sa oštećenjem. Naši rezultati pokazuju da predtretman ehinakozidom može djelomično promovirati popravak oštećenja DNK, barem zaštititi stanice od lezija DNK uzrokovanih H2O2 (slika 2B). Na osnovu ovih činjenica zaključujemo da ehinakozid ima aktivnost protiv starenja barem u MRC{12}} ćelijama. Rezultati našeg istraživanja pokazuju da ehinakozid može smanjiti akumulaciju ROS-a, zaštititi ćelije od oštećenja DNK, promovirati MRC{13}} ćelije iz G1 faze u S i G2 faze, i na taj način poboljšati proliferaciju ćelija. Uopšteno govoreći, efekti ehinakozida na MRC{16}} ćelije mogu se podijeliti u dva aspekta: da promoviše proliferaciju ćelija i da smanji akumulaciju ROS. Iako je precizan mehanizam starenja stanica još uvijek nepoznat i mreža regulacije ćelijskog ciklusa ostaje kontroverzna, pokazali smo da ehinakozid može zaštititi stanice od oksidativnog oštećenja. Mi, dakle, o tome nagađamoechinacosidemože biti dobar kandidat za regulisanje starenja, iako je precizan osnovni mehanizam i dalje otvoreno pitanje i dalja istraživanja su u toku.

3. Eksperimentalno

3.1. Ćelijska kultura i tretman

Ljudski embrion plućne fibroblastične ćelijske linije MRC{{0}} (Institut za biohemiju i ćelijsku biologiju, SIBS, CAS) održavan je u modificiranom minimalnom esencijalnom mediju (Gibco/BRL) i dopunjen sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma. MRC-5 ćelije prolaze kroz replikativno starenje nakon višestrukih prolaza ćelija, što se procjenjuje usporavanjem metabolizma i prestankom diobe u roku od 7 dana. Sve kulture su zasijane pri gustini ćelija od 104/cm2 osim ako nije drugačije naznačeno i ostavljene su da se razmnožavaju, neometano, 7 dana. Različite koncentracije ehinakozida dodane su 48 sati prije ispitivanja sa rastvaračem kao kontrolom, osim ako nije drugačije navedeno. Koncentracija DMSO u kulturama bila je manja od 0,3 posto (v/v). Za tretman H2O2, ćelije su inducirane sa 250 M H2O2 tokom 12 h.

3.2. Test stope preživljavanja

Ćelije su kultivisane i tretirane ehinakozidom na pločama sa 96 jažica. Prije detekcije, 10 posto Alamar BlueTM je dodano mediju i inkubirano 4 h. Apsorpcija je mjerena spektrofotometrom.

3.3. Analiza protočnom citometrijom

Protočna citometrija je uvedena za mjerenje sadržaja DNK i intracelularnih nivoa ROS koristeći propidijum jodid i DCFH-DA respektivno. Ćelije su postavljene na gustinu od 105 ćelija/10 ml ćelijskog rastvora u posude prečnika 100 mm i dopunjene ehinakozidom tokom 48 sati nakon zasejavanja ćelija. Nakon 48 h tretmana, ćelije su sakupljene i isprane u PBS nakon centrifugiranja, zatim resuspendirane u PBS rastvoru sa 0,1 posto RNaze i 50 g/ml propidijum jodida ili medijuma za kulturu koji sadrži 10 M DCFH-DA tokom 30 minuta. Sadržaj DNK ili ROS je zatim određen sortiranjem ćelija aktiviranim FL fluorescencijom na Beckman Coulter Flow Cytometry sistemu. Podaci su analizirani softverom MultiCycle.

3.4. Bojenje po Hoechstu

Ćelije su kultivisane i tretirane ehinakozidom tokom 48 h na ploči sa 96 jažica. Medijum je uklonjen, ćelije su isprane sa PBS, zatim fiksirane sa 4% formaldehida u PBS tokom 20 minuta, nakon čega je jednom isprano PBS i obojeno Hoechst bojom 10 minuta. Slike su snimljene.

3.5. Jednoćelijska gel elektroforeza (test kometa)

Test kometa je sproveden kako je objavljeno (Olive i Banath 2006). Pojedinačne slike kometa analizirane su softverom CometScore. Priznanje: Ovaj rad je finansijski podržan od strane Nacionalnog programa osnovnih istraživanja (973 projekat) Kine (br. 2007CB507406), Kineske nacionalne fondacije za prirodne nauke (br. 30572341) i Fonda za medicinske nauke Tsinghua-Yue-Yuen (THY00080707). ).