Ehinakozid štiti od 6-Mitohondrijalne disfunkcije izazvane hidroksidopaminom i upalnih odgovora u PC12 ćelijama putem smanjenja proizvodnje ROS-a

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 i Guan-Hua Du1,2

Parkinsonova bolest (PD) je neurodegenerativni poremećaj karakteriziran progresivnim gubitkom dopaminergičkih (DA) neurona u supstanciji nigra. Mitohondrijska disfunkcija i upalni odgovori uključeni su u mehanizam oštećenja ćelija u PD. 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), analog dopamina, posebno oštećuje dopaminergičke neurone.Echinacoside(ECH) je feniletanoidni glikozid izoliran iz stabljikeCistanche salsa, pokazujući niz neuroprotektivnih efekata u prethodnim studijama. Ova studija je trebala istražiti njegov učinak na neurotoksičnost izazvanu 6-OHDA i moguće mehanizme u PC12 ćelijama. Rezultati su pokazali da 6-OHDA smanjuje vitalnost ćelija, smanjuje oksidaciono-redukcionu aktivnost, smanjuje potencijal mitohondrijalne membrane i inducira apoptozu posredovanu mitohondrijama u poređenju sa netretiranim PC12 ćelijama. Kako god,echinacosidetretman je značajno ublažio ove promjene izazvane 6-OHDA. Osim toga,echinacosidetakođer može značajno ublažiti upalne odgovore izazvane 6-OHDA. Dalja istraživanja su to pokazalaechinacosidemože smanjiti 6-OHDA-indukovanu ROS proizvodnju u PC12 ćelijama. Ovi rezultati sugeriraju da je osnovni mehanizam zaechinacosideprotiv neurotoksičnosti izazvane 6-OHDA može uključiti smanjenje mitohondrijalne disfunkcije i upalnih odgovora smanjenjem proizvodnje ROS.

1. Uvod

Parkinsonova bolest (PD)je neurodegenerativni poremećaj karakteriziran polagano progresivnom degeneracijom dopaminskih neurona u substantia nigra pars compacta [1]. Iako su neuropatološka obilježja PD dobro opisana, etiologija je još uvijek nedefinirana. Značajno, nekoliko zapažanja sugerira da je mitohondrijska disfunkcija uključena u patogenezu PD i degeneraciju dopaminergičkih neurona [2, 3]. Mitohondrije sadrže mnogo redoks enzima, a prirodna neefikasnost oksidativne fosforilacije stvara reaktivne vrste kiseonika (ROS) [4]. Nedavno, sve veći dokazi iz studija na ljudima i životinjama sugeriraju da je neuroinflamacija također važan faktor gubitka neurona u PD [5].

6-Hydroxydopamin (6-OHDA) je specifičan za dopaminergičke neurone u intrastriatalnim modelima glodara iu nekim ćelijama [6–11]. PC12 ćelija je postala popularan model ćelije za istraživanje PD jer ova ćelijska linija poseduje mnoge karakteristike DAergičnih neurona. Korišćen je kao in vitro model za proučavanje PD i za određivanje efekta zaštitnih i terapijskih sredstava. Ehinakozid (Slika 1) je feniletanoidni glikozid izolovan i pročišćen iz stabljikeCistanche salsa[12], parazitska biljka porijeklom iz sjeverozapadne Kine, koja se koristi kao pokušaj temeljnih mehanizama ehinakozida protiv 6-OHDA-induciranog oštećenja ćelija PC12.

2. Materijali i metode

2.1. Materijali. Ehinakozid je nabavljen od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (Peking, Kina). RPMI-1640 i fetalni goveđi serum su dobijeni od Gibco-a

(Grand Island, NY, SAD). 6-OHDA, MTT, 2,7-dihlorodihidrofluorescein diacetat, propidijum jodid (PI) i resazurin su kupljeni od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). ATP bioluminiscentni set za analizu je nabavljen od Promega (Madison, SAD). 5,5,6,6 -Tetrahloro-1,1,3,3 -tetraetil benzimidazolil karbocijanin jodid (JC-1) komplet za analizu dobijen je od Beyotime Instituta za biotehnologiju (Haimen, Jiangsu, Kina). Cytochrome C ELISA komplet i fluorogeni supstrat Ac-DVD-AMC dobijeni su od Invitrogen-a (Carlsbad, CA, USA). IL-1 i IL-6 ELISA kompleti su nabavljeni od kompanije Boster Bio-engineer Limited (Wuhan, Kina). Spectramax M5 čitač mikroploča je kupljen od kompanije Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA).

2.2. Ćelijska kultura i tretman. PC12 ćelije su uzgajane u RPMI-1640 sa dodatkom 10 posto konjskog seruma i 5 posto fetalnog goveđeg seruma. Uslovi su održavani na 37∘C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2 [19]. Ćelije su postavljene u 96-ploče sa jažicom pri gustini od 2 × 105 ćelija/mL. Nakon 80 posto konfluencije, ćelije su prethodno inkubirane sa različitim koncentracijama ehinakozida u RPMI-1640 mediju bez seruma 1 h. Zatim je u jažice dodan 6-OHDA u konačnoj koncentraciji od 100 M i inkubiran još nakon tretmana, morfološke promjene su uočene pod mikroskopom. Vijabilnost ćelija je procenjena MTT testom [19]. Ukratko, nakon tretmana, MTT u konačnoj koncentraciji od 0,5 mg/mL je dodan u svaku jažicu i inkubiran 4 h na 37∘C.

2.3. Morfološke promjene i analiza vitalnosti PC12 ćelija. Nakon tretmana, morfološke promjene su uočene pod mikroskopom. Vijabilnost ćelija je procenjena MTT testom [19]. Ukratko, nakon tretmana, MTT u konačnoj koncentraciji od 0.5 mg/mL je dodat u svaku jažicu i inkubiran 4 h na 37∘C. Zatim je supernatant uklonjen i produkt formazana je otopljen u 100 L dimetil sulfoksida uz mešanje tokom 15 minuta na mikrotitarskoj šejkeru i očitana je apsorpcija na 570 nm korišćenjem Spectramax M5 čitača mikroploče. Komplementarna i alternativna medicina zasnovana na dokazima

2.4. Intracelularni ATP Level Assay. Nivo ćelijskog ATP-a je mjeren ATP bioluminiscentnim kompletom za analizu prema uputama proizvođača. Luminescencija je praćena na čitaču mikroploče u luminiscencijskom modu nakon dodavanja 100 L luciferina i luciferaze [20].

2.5. Measurement of Mitochondria Oxidation-Reduction Activity by Resazurin. Nakon tretmana, u jažice je dodan resazurin u konačnoj koncentraciji od 5 M i ispitan je intenzitet fluorescencije pri ekscitaciji od 530 nm i emisiji od 590 nm [21].

2.6. Mjerenje potencijala mitohondrijske membrane od strane JC-1. Potencijal mitohondrijalne membrane je mjeren korištenjem JC-1 kompleta za analizu prema uputstvima proizvođača. Nakon tretmana, podloga za kulturu je uklonjena i napunjena rastvorom JC-1 15 minuta na 37∘C u mraku. Intenzitet fluorescencije crvenog/zelenog odnosa određen je pri ekscitaciji od 490 nm i emisiji od 530 nm (zeleni fluorescentni monomeri) i 590 nm (crveni fluorescentni agregati), respektivno [22].

2.7. Kvantifikacija oslobađanja citokroma C. Nivoi citosolnog citokroma C mjereni su korištenjem ELISA kompleta prema uputama proizvođača [23]. Ukratko, nakon tretmana, ćelije su lizirane i centrifugirane na 1000 g tokom 15 minuta, a zatim je supernatant sakupljen kao citoplazmatska frakcija i korišten za mjerenje oslobađanja citokroma C.

2.8. Određivanje aktivnosti kaspaze-3. Aktivnost kaspaze-3 izvedena je prema referencama sa modifikacijom [24]. Kratko, nakon tretmana, pufer za lizu je dodat u svaku jažicu, a zatim je uslijedilo centrifugiranje na 12 000 g tokom 10 min. Aktivnost kaspaze-3 testirana je u rezultirajućim supernatantima mjerenjem proteolitičkog cijepanja fluorogenog supstrata Ac-DVD-AMC sa talasnom dužinom ekscitacije od 380 nm i talasnom dužinom emisije od 460 nm.

2.9. Test protočne citometrije u PC12 ćelijama. Nakon tretmana, ćelije su tripsinizirane, isprane dva puta sa PBS, centrifugirane na 1000 r/min 5 minuta, a zatim fiksirane sa 70 posto etanola preko noći na 4∘C. Ćelije su centrifugirane i isprane dva puta sa PBS, resuspendirane u PBS (koji sadrži 50 g/mL RNAseA), obojene sa PI u konačnoj koncentraciji od 10 M 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku i očitane u protočnom citometru na 488 nm ekscitacija [10].

2.10. Mjerenje nivoa IL-1 i IL-6 pomoću ELISA testa. Medij kultiviranih PC12 ćelija je sakupljen nakon tretmana, a koncentracije IL-1 i IL-6 su izmjerene komercijalno dostupnim ELISA kompletima prema protokolu proizvođača.

2.11. Određivanje nivoa intracelularnog reaktivnog kiseonika. Nakon inkubacije sa 6-OHDA, ćelije su napunjene sa 10M H2DCFH-DA tokom 30 minuta na 37∘C u mraku. Intenzitet fluorescencije DCF-a mjeren je pri ekscitaciji

Komplementarna i alternativna medicina zasnovana na dokazima talasna dužina od 495 nm i talasna dužina emisije od 530 nm na čitaču mikroploče [25].

2.12. Statistička analiza. Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Statistička analiza rezultata obavljena je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA), a zatim -testom. Statistička značajnost je prihvaćena <>

3. Rezultati

3.1. Efekat ehinakozida na morfologiju i vitalnost ćelija u PC12 ćelijama oštećenim 6-OHDA. Kao što je prikazano na slici 2(A), vitalnost PC12 ćelija nije imala značajnu razliku pri koncentraciji od 0.1-10 M tretmana ehinakozidom za

24 č. Kao što je prikazano na slici 2(B), u roku od 24 sata od tretmana samo sa 6-OHDA, većina PC12 ćelija je pretrpjela morfološke promjene kao što su mjehurići membrane i skupljanje ćelija. Tretman ehinakozidom zaštitio je ćelije od 6-OHDA oštećenja. MTT analiza je pokazala da je tretman PC12 ćelija samo sa 6-OHDA rezultirao približno 25 posto smanjenjem preživljavanja ćelija u roku od 24 h, dok je zajednički tretman sa {{10}}.1 M, 1 M, i 10 M ehinakozida su pokazali smanjenje citotoksičnosti posredovane 6-OHDA (svi <0,01, slika="">

3.2. Utjecaj ehinakozida na disfunkciju mitohondrija izazvanu 6-OHDA u PC12 ćelijama. Nivoi ćelijskog ATP-a su značajno smanjeni nakon 24 h inkubacije sa 100M 6-OHDA, dok je zajednički tretman sa 1 Mand 10 M ehinakozida ublažio 6-OHDA-posredovano smanjenje ATP-a u smanjenju anaboličkih promjena u PC12 ćelijama . Rezultati su pokazali da istovremeni tretman sa 1 Mand 10 M ehinakozida može značajno ublažiti oštećenje oksidacijsko-redukcione aktivnosti mitohondrija izazvano 6-OHDA (i <0,05 i="" slika="">

Kao što je prikazano na slici 3(c), tretman sa 100 M od 6- OHDA tokom 24 sata je rezultirao značajnim smanjenjem potencijala mitohondrijske membrane u poređenju sa netretiranom grupom ( < {="" {11}}.01).="" međutim,="" smanjenje="" potencijala="" mitohondrijske="" membrane="" izazvano="" 6-ohda="" značajno="" je="" oslabljeno="" tretmanom="" sa="" 0,1="" m,="" 1="" m="" i="" 10="" m="" ehinakozida="" (svi=""><>

3.3. Apoptoza ehinakozida u PC12 ćelijama posredovana anti-mitohondrijama protiv neurotoksičnosti 6-OHDA. Rezultati su pokazali da je izloženost 6-OHDA rezultirala povećanjem citosolnog citokroma C za 167 posto u odnosu na neliječenu grupu (< 0.{{10}}1).="" ehinakozid="" u="" dozi="" od="" 0.1="" m,="" 1="" m="" i="" 10m="" bi="" mogao="" značajno="" smanjiti="" oslobađanje="" citokroma="" c="" u="" citosol="" izazvano="" 6-ohda="" (="">< 0,05,="">< 0,01="" i="">< 0,01,="" odnosno="" slika="">

Aktivnost kaspaze{{0}} povećana je za oko 3.3-puta u poređenju sa netretiranom grupom nakon 6-izlaganja OHDA (< 0.01="" ).="" nasuprot="" tome,="" tretman="" sa="" 1="" m="" i="" 10="" m="" ehinakozida="" pokazao="" je="" značajno="" smanjenje="" aktivnosti="" kaspaze-3="" u="" poređenju="" sa="" 6-ohda-tretiranim="" ćelijama,="" respektivno="" (i="">< 0,05="" i="" slika="" 4(="" b)).pi="" je="" propusnost="" membrane="" i="" općenito="" je="" isključen="" iz="" živih="" stanica.="" stoga="" se="" obično="" koristi="" za="" identifikaciju="" mrtvih="" ćelija="" u="" populaciji.="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" je="" stopa="" apoptoze="" značajno="" povećana="" nakon="" 24="" h="" inkubacije="" sa="" 100="" m="" 6-ohda,="" dok="" je="" zajednički="" tretman="" sa="" 1="" i="" 10="" m="" ehinakozidom="" značajno="" smanjio="" 6-ohda-indukovanu="" apoptozu="" (="">< 0,05,="">< 0,01,="" odnosno,="" slika="">

3.4. Protuupalni efekat ehinakozida u PC12 ćelijama izazvan 6-OHDA. Rezultati su pokazali da je 6-izloženost OHDA rezultirala povećanjem nivoa IL-1 u poređenju sa neliječenom grupom (< 0.05;="" slika="" 4(a)).="" međutim,="" 10="" m="" ehinakozida="" može="" značajno="" smanjiti="" oslobađanje="" il-1="" izazvano="" 6-ohda=""><0,05; slika="">

Nivo IL{{0}} je također značajno povećan u poređenju sa neliječenom grupom (< 0.01).="" međutim,="" zajednički="" tretman="" sa="" 0,1,="" 1="" i="" 10="" m="" ehinakozida="" značajno="" je="" smanjio="" oslobađanje="" il-6="" u="" poređenju="" sa="" ćelijama="" tretiranim="" 6-ohda="" (i=""><0,05 i="" slika="">

3.5. Utjecaj ECH na proizvodnju ROS izazvanu 6-OHDA u PC12 ćelijama. Ćelije tretirane sa 6-OHDA pokazale su značajno povećanje (oko 1.4- puta) intracelularnog ROS u poređenju sa netretiranim ćelijama (< 0.01).="" ovo="" povećanje="" je="" značajno="" oslabljeno="" kokubacijom="" sa="" 0.1,="" 1="" i="" 10="" m="" echinacoside="" (="">< 0.05,="">< 0.01,="" i="">< 0.01,="" respon.;="" slika="" 6)="">

4. Diskusija

Ehinakozid je jedan od glavnih sastojaka feniletanoidnih glikozida ekstrahiranih iz poznatog tradicionalnog ehinakozida koji ima antiapoptotička i neuroprotektivna svojstva kod neurodegenerativnih bolesti [18]. In vivo studija je objavila da je ehinakozid imao neuroprotektivne efekte i poboljšanje ponašanja na mišjem modelu dopaminergičkog oštećenja neurona izazvanog MPTP-om, dok je dalje istraživanje otkrilo da je ehinakozid inducirao smanjenje regulacije kaspaze-3 i kaspaze{4}} aktivacije u MPP plus -indukovana apoptoza neurona cerebelarne granule [16]. Druga in vivo studija je izvestila o neuroprotektivnim efektima ehinakozida na strijatalne dopaminergičke neurone oštećene 6-OHDA [17]. Međutim, stanični i molekularni mehanizmi koji leže u osnovi ovih djelovanja nisu u potpunosti shvaćeni, posebno zbog njihovog utjecaja na mitohondrijalnu funkciju i upalne odgovore. Tako je naša trenutna studija istraživala efekte ehinakozida na mitohondrijalnu funkciju i upalne odgovore kako bi se razjasnio njegov mehanizam protiv PD. Rezultati su prvo pokazali da ehinakozid značajno ublažava 6-OHDA-indukovanu neurotoksičnost u PC12 ćelijama kroz zaštitu mitohondrijalne funkcije i anti-inflamaciju.

Mitohondrijska disfunkcija je dugo bila implicirana u smrti nigrostriatalnih dopaminergičkih neurona kod Parkinsonove bolesti i njenih eksperimentalnih modela [26]. Mitohondrije su duboko uključene u proizvodnju reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) putem nosača elektrona respiratornog lanca kod neurodegenerativnih bolesti [27]. U toku normalnog metabolizma u biološkim sistemima proizvodi se veliki broj ROS, ali se njihova akumulacija izvan

potrebna količina može potencijalno oštetiti lipide, proteine ​​i nukleinske kiseline.

6-OHDA, analog kateholamina, uzrokuje specifičnu degeneraciju neurona supstancije nigra. Neurotoksičnost izazvana 6-OHDA je, dijelom, posljedica proizvodnje ROS [28–32].

OHDA dovodi do smrti neurona utječući na funkciju mitohondrija, uključujući smanjenje proizvodnje ATP-a, poremećaj metabolizma ROS-a i indukciju apoptoze [10, 33, 34]. U ovoj studiji, naši rezultati su također pokazali da 6-OHDA oštećuje mitohondrijalnu oksidativno-redukcionu funkciju, smanjuje potencijal mitohondrijalne membrane, inducira apoptozu posredovanu mitohondrijima i povećava proizvodnju ROS-a u PC12 stanicama.

Resazurin je fluorescentni indikator koji je srednji samo između konačnih redukcija molekularnog kisika i citokrom oksidaze. Stoga, oksidativno-redukcioni potencijal resazurina omogućava respiratornom lancu da funkcionira skoro do kraja, što će pružiti precizniju i osjetljiviju indikaciju mitohondrijalne funkcije. JC-1 je sonda osjetljiva na membranski potencijal koja se lokalizira na unutrašnjoj membrani mitohondrija gdje formira ili monomere (zeleno) ili agregate (crveno) na osnovu potencijala mitohondrijalne membrane. Stoga su resazurin i JC-1 vrijedni analitički alati za ispitivanje mitohondrijalne funkcije [35]. Ova studija je pokazala da smanjenje mitohondrijalne oksidativno-redukcione aktivnosti i potencijal mitohondrijalne membrane mogu igrati važnu ulogu u 6-OHDA-indukovanoj dopaminergičkoj neurotoksičnosti. Naš rezultat je također pokazao mitohondrijsku oksidativno-redukcionu aktivnost i potencijal mitohondrijalne membrane. Ovi rezultati pokazuju da poboljšanje mitohondrijalne disfunkcije može biti bolji način za usporavanje progresivne dopaminergičke neurodegeneracije koja je obično povezana s PD.

Općenito je prihvaćeno da je ćelijska apoptoza izazvana 6- OHDA posredovana mitohondrijalnom disfunkcijom, koju karakterizira oslobađanje citokroma C i aktivacija kaspaze-3 [36]. Apoptotički stimulus pokreće oslobađanje citokroma C iz mitohondrija u citosol gdje on zatim aktivira kaspazu-3 i druge kaspaze nizvodno. U ovoj studiji, rezultati su pokazali da PC12 ćelije izložene 100 M 6-OHDA pojačavaju oslobađanje citokroma C, a kaspaza zavisno inhibira oslobađanje citokroma C i aktivacije kaspaze- 3. Ovi rezultati sugeriraju da bi ehinakozid mogao inhibirati apoptozu posredovanu mitohondrijama smanjenjem oslobađanja citokroma C iz mitohondrija u citosol i aktivaciju kaspaze{9}}.

Upala je neuropatološka karakteristika mozga Parkinsonove bolesti, kao i u eksperimentalnim modelima bolesti. Terapijske strategije usmjerene na smanjenje upale i inhibiranje proizvodnje ovih inflamatornih faktora mogu biti obećavajuća neuroprotektivna strategija za liječenje Parkinsonove bolesti i srodnih stanja [37]. Nekoliko studija sprovedenih u cerebrospinalnoj tečnosti i tokom postmortalne analize kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću otkrilo je povećane nivoe citokina, kao što su interleukin-1 (IL-1) i interleukin-6 (IL{{4} }), što ukazuje na aktivaciju aproinflamatornog odgovora[38, 39]. U ovoj studiji, rezultati su pokazali da je izlaganje 100 Mof6-OHDA izazvano oslobađanjem IL-1 i IL-6 u PC12 ćelijama. Međutim, liječenje ehinakozidom može ovisno o dozi inhibirati oslobađanje IL-1 i IL-6 izazvano 6-OHDA. Rezultati sugeriraju da je smanjenje upalnih odgovora također uključeno u mehanizme ehinakozida protiv neurotoksičnosti izazvane 6-OHDA.

Zaključno, rezultati ovog istraživanja su pokazali da je ehinakozid bio u stanju blokirati neurotoksičnost izazvanu 6-OHDA induciranom u PC12 stanicama, a mehanizmi mogu biti povezani sa zaštitom mitohondrija i anti-inflamacijom kroz smanjenje proizvodnje ROS. Informacije koje pruža ovaj rad bit će korisne za razjašnjavanje mehanizma ehinakozida za anti-PD. Zaključeno je da ehinakozid može biti obećavajuća terapijska opcija za prevenciju i liječenje PD.

Sukob interesa

Autori su izjavili da nema sukoba interesa

Priznanja

Ovaj rad su podržali grantovi Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (81473383) i Nacionalni glavni projekat nauke i tehnologije (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; i 2013ZX09102106).