Dvostruki modulatorni efekti diosmina na procese formiranja kamena u bubregu kalcijum oksalata: kristalizacija, rast, agregacija, adhezija kristalnih ćelija, internalizacija u bubrežne tubularne ćelije i invazija kroz ekstracelularni matriks
Mar 16, 2022
za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Posjetite Thongboonkerda,*
aJedinica za medicinsku proteomiku, Ured za istraživanje i razvoj, Medicinski fakultet, bolnica Siriraj, Univerzitet Mahidol, Bangkok 10700, Tajland
bOdsjek za medicinsku tehnologiju, Škola srodnih zdravstvenih nauka, Univerzitet Phayao, Phayao 56000, Tajland
cJedinica izvrsnosti u integrativnoj molekularnoj biomedicini, Škola srodnih zdravstvenih nauka, Univerzitet Phayao, Phayao 56000, Tajland
Ključne riječi: bioaktivno jedinjenje, flavonoid, inhibitor, modulator, nefrolitijaza, promotor, urolitijaza
SAŽETAK
Diosminje prirodni flavonski glikozid (bioflavonoid) koji se nalazi u voću i biljkama s nekoliko farmakoloških aktivnosti. Široko se koristi kao dodatak ishrani ili kao terapeutsko sredstvo kod raznih bolesti/poremećaja. Iako se preporučuje, dokaz o njegovim zaštitnim mehanizmima protivbubregkamena bolest (nefrolitijaza/urolitijaza), posebno kalcijum oksalat (CaOx) monohidrat (COM) koji je najčešći tip, ostala je nejasna. U ovoj studiji smo stoga sistematski evaluirali efektediosmin(na 2,5–160 nM) na različitim stadijumimabubregprocesi formiranja kamena, uključujući kristalizaciju COM, rast kristala, agregaciju, adheziju kristalnih ćelija, internalizaciju u bubrežne tubularne ćelije i invaziju kroz ekstracelularni matriks (ECM). Rezultati su to pokazalidiosminimao dozno zavisne modulatorne efekte na sve pomenute COM procese kamenca u bubregu.Diosminznačajno povećao broj i masu COM kristala tokom kristalizacije, ali smanjio veličinu i rast kristala. Dokdiosminpromovira agregaciju kristala, inhibira adheziju kristalnih ćelija i internalizaciju u bubrežne tubularne ćelije. Konačno, diosmin je promovirao invaziju kristala kroz ECM. Naši podaci pružaju dokaze koji pokazuju i inhibirajuće i promotivne efekte diosmina na COMbubregprocesi stvaranja kamena. Na osnovu ovih dvostrukih modulacijskih aktivnosti diosmina, njegova uloga protiv urolitijaze je upitna i treba biti oprezan za njegovu upotrebu ububregkamena bolest.
1. Uvod
Diosmin(3′,5,7-trihidroksi-4′-metoksiflavon-7-ramnoglukozid) je prirodni bioflavonoid koji se obično nalazi u raznim biljkama i voću, uglavnom Citrus spp. [1,2]. Može se sintetizirati ili dobiti iz drugog flavonoida, hesperidina [1,2]. Diosmin sam ili u kombinaciji s hesperidinom se široko koristi kao flebotropni lijek za liječenje venskih i limfnih poremećaja kao što su kronična venska insuficijencija i hemoroidi [3,4]. Osim toga, diosmin pokazuje nekoliko drugih bioloških i farmakoloških aktivnosti, uključujući antioksidativna i protuupalna djelovanja [5,6], antimutagena i anti-neoplastična svojstva [7,8], antibiotske efekte [9], antihiperglikemijska svojstva [ 10], te zaštitno djelovanje od višeorganskih oštećenja, tj.
kardiovaskularni [11], retinalni [12],bubreg, ozljede jetre i mozga [13].
Bubregkamena bolest (ili nefrolitijaza/urolitijaza) uzrokovana je čvrstim kamencima koji se razvijaju i talože unutar bubrega i pogađa ljude u svim područjima svijeta s visokom stopom recidiva [14–17]. Od svih različitih uzročnih kristala, kalcijum oksalat (CaOx), posebno monohidratni oblik (COM), je najpatogenija i najčešća kristalna komponenta koja se nalazi u stvaraocima kamenca (pacijenata sa bubrežnim kamencima) [18]. Mehanički, COM kristali imaju najsnažniju adhezivnu sposobnost i najviše citotoksičnih efekata na bubrežne tubularne epitelne ćelije [19,20]. Tokom patogeneze kamena, i Randallov model plaka i intratubularna hipoteza imaju zajedničke karakteristike procesa formiranja COM kamena, uključujući kristalizaciju COM, rast, agregaciju, zadržavanje površinskom adhezijom na bubrežnim tubularnim stanicama ili bubrežnoj zdjelici, internalizaciju u stanice i invaziju u bubrežni intersticij kroz ekstracelularni matriks (ECM) [21,22].
U posljednje vrijeme, mnoge studije su se fokusirale na otkrivanje lijekova pomoću ljekovitih biljaka/voća i njihovih bioaktivnih spojeva s ciljem prevencije stvaranja novih i/ili ponavljanih kamenaca. Brojni raniji izvještaji su pokazali da neka bioaktivna jedinjenja, posebno fenolna jedinjenja (polifenol, flavonoid, flavon glikozid, itd.) ekstrahovani iz više lekovitih biljaka/voća, imaju preventivno dejstvo na patogene mehanizmebubregkamena bolest i in vitro i in vivo [23–25]. Među ovim korisnim supstancama, nekoliko izvještaja sugerira da diosmin može spriječiti taloženje kristala CaOx unutar tkiva bubrega na životinjskim modelima [26,27]. Međutim, njegova precizna modulaciona uloga (inhibicija ili promocija) i mehanizmi (faze ili procesi formiranja kamenca) u formiranju COM bubrežnih kamenaca nisu istraženi. Ova studija je stoga sistematski evaluirala efektediosmin(na 2,5–160 nM) na različitim stadijumimabubregprocesi formiranja kamena, uključujući kristalizaciju, rast kristala, agregaciju, adheziju kristalnih ćelija, internalizaciju u bubrežne tubularne ćelije i invaziju kroz ECM.
Kliknite zaCistanche tubulosa doza za funkciju bubrega
2. Materijali i metode
2.1. Diosmin preparat
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokio, Japan) je otopljen sa 100 posto dimetil sulfoksidom (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) i radni alikvoti su napravljeni u konačnim koncentracijama od 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 nM za ispitivanje njegovih efekata na COM kristale. Osim toga, 100 posto DMSO je korišten kao negativna kontrola u svim eksperimentima.
2.2. Ćelijska kultura
MDCK renalna tubularna epitelna ćelijska linija izvedena iz distalnog tubularnog segmenta nefrona (ATCC; Manassas, VA) razmnožena je u Eagleovom minimalnom esencijalnom mediju (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) dopunjenom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 60 U/ml penicilina G (Sigma-Aldrich) i 60 ug/ml streptomicina (Sigma-Aldrich). Ćelije su održavane u vlažnom inkubatoru sa 5 posto CO2 na 37 ◦C.
2.3. COM analiza kristalizacije
COM kristalizacija je izvedena kao što je prethodno opisano [28,29]. Ukratko, 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H2O u puferu za kristalizaciju (koji sadrži 10 mM Tris-HCl i 90 mM NaCl) (pH 7,4) dodano je u svaku jažicu ploče 24- (Corning Inc.; Corning, NY). Jednaka zapremina (4 ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ilidiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ili 160 nM) je pomiješan sa CaCl2. Konačno, zatim je dodano 500 ul 1,0 mM Na2C2O4 u puferu za kristalizaciju da bi se konačne koncentracije CaCl2 i Na2C2O4 doveli do 5 mM odnosno 0,5 mM. Smeša je inkubirana na 25 ◦C 1 h, a zatim ispitana. Slike kristala su nasumično snimljene iz najmanje 15 polja velike snage (HPF) pod Nikon Eclipse Ti-S invertovanim fazno-kontrastnim svetlosnim mikroskopom (Nikon; Tokio, Japan). Veličina i broj kristala mereni su od najmanje 15 HPF za svaki uzorak korišćenjem NIS Element D softvera verzije 4.11 (Nikon). Kristalna masa je izračunata iz najmanje 100 kristala u 15 HPF-ova koristeći sljedeću formulu: Kristalna masa (µm2/HPF)=Prosječna veličina kristala u svakom polju (µm2) × Broj kristala u svakom polju (/HPF) ( 1)
2.4. COM test rasta kristala
Analiza rasta kristala izvedena je kao što je prethodno opisano [30,31].
Ukratko, jednaka zapremina (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H2O i 1,0 mM Na2C2O4 u puferu za kristalizaciju je pomešana (1:1) (v/v) u svakoj jažici { {12}}bunarska ploča. Smeša je inkubirana na 25 ◦C 1 h da bi se omogućila potpuna kristalizacija. U ovoj tački (T0), jednaka zapremina (4 ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ilidiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 ili 160 nM) je dodat u svaku jažicu i smeša je dalje inkubirana 60 min (T60). Na T0 i T60, slike kristala su nasumično snimljene sa najmanje 15 HPF-a pod Nikon Eclipse Ti-S svetlosnim mikroskopom sa invertovanim faznim kontrastom. Veličine kristala na T0 i T60 mjerene su korištenjem softvera NIS Element D verzije 4.11 (Nikon), dok je rast kristala (predstavljen Δ veličinom kristala) izračunat iz najmanje 100 kristala u 15 HPF koristeći sljedeću formulu: Δ veličina kristala (µm2)=Veličina kristala na T60 − Veličina kristala na T0 (2)
2.5. COM analiza agregacije kristala
Test agregacije kristala je izveden kao što je prethodno opisano [32,33]. COM kristali su generirani kako je gore spomenuto u testu rasta kristala, ali sa većom zapreminom u 50-ml konusnoj cijevi (Corning Inc.), a zatim sakupljeni centrifugiranjem na 2000 g tokom 5 minuta. Supernatant je odbačen, dok su COM kristali isprani tri puta metanolom. Nakon još jednog centrifugiranja na 2000 g tokom 5 minuta, metanol je odbačen i kristali su sušeni na vazduhu preko noći na 25 ◦C. COM kristali (1000 µg suhe težine) su resuspendirani u 1 ml pufera za kristalizaciju u svakoj jažici 6-ploče (Corning Inc.). Jednaka zapremina (4 ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ilidiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ili 160 nM) je dodan u COM kristalnu suspenziju u svaku jažicu. Ploča je neprekidno mućkana u inkubatoru za mućkanje (Zhicheng; Šangaj, Kina) na 150 rpm i 25 ◦C tokom 1 h. Nakon toga, formiranje COM kristalnog agregata (definirano kao "sklop od tri ili više pojedinačnih COM kristala koji su čvrsto spojeni zajedno" [32]) je ispitano i snimljeno pod Nikon Eclipse Ti-S svjetlosnim mikroskopom s invertiranim fazno-kontrastnim svjetlosnim mikroskopom. Broj COM kristalnih agregata je prebrojan iz najmanje 15 nasumičnih HPF-ova po jažici.
2.6. COM test adhezije kristalnih ćelija
Test adhezije kristalnih ćelija izveden je kao što je prethodno opisano [34,35]. Ukratko, COM kristali su generirani kako je gore navedeno u 50-ml konusnoj epruveti, a zatim sakupljeni centrifugiranjem na 2000 g tokom 5 minuta. Supernatant je odbačen, dok su COM kristali isprani tri puta metanolom. Nakon još jednog centrifugiranja na 2000 g tokom 5 minuta, metanol je odbačen i kristali su sušeni na vazduhu preko noći na 25 ◦C. Kristali su dekontaminirani UV zračenjem 30 min prije intervencije na ćelijama.
MDCK ćelije (u gustini od 2 × 105 ćelija/jažici) su zasijane i uzgajane u svakoj jažici 6- ploče (Corning Inc.) tokom 48 h da bi se dobio konfluentni monosloj. Medij za kulturu je zatim osvježen prije dodavanja kristala COM (100 µg kristala suhe težine po ml medija za kulturu). Jednaka zapremina (4 ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ilidiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ili 160 nM) je dodan u svaku jažicu. Ćelije su dalje inkubirane u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2 na 37 ◦C tokom 1 h. Nakon toga, ćelije su snažno isprane sa PBS pet puta i snimljene pod Nikon Eclipse Ti-S invertovanim fazno-kontrastnim svetlosnim mikroskopom. Broj preostalih COM kristala prilijepljenih na površinu bubrežnih tubularnih ćelija izbrojan je iz najmanje 15 nasumičnih polja po jažici.
Cistanche za funkciju bubrega
2.7. COM analiza internalizacije kristala
Fluorescentno označeni COM kristali su generisani kako je prethodno opisano [36,37]. Sastav/koncentracija hemikalija korištenih za kristalizaciju bila je ista kao što je gore spomenuto za obične (neobilježene) kristale, ali je 0.1 µg/ml fluorescein izotiocijanat (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) bio dodati u rastvor CaCl2⋅2H2O prije miješanja sa Na2C2O4. Naredni koraci (kristalizacija i sakupljanje) izvedeni su kao što je gore navedeno, ali u mraku.
Da bi se procijenila internalizacija kristala u bubrežne tubularne epitelne ćelije, MDCK ćelije (u gustini od 2 × 105 ćelija/jažici) su zasijane i uzgajane u svakoj jažici 6- ploče (Corning Inc.) tokom 48 sati da bi se dobilo konfluentni monosloj. Monosloj ćelije je inkubiran sa FITC-obilježenim COM kristalima (1000 µg kristala/ml medija) u vlažnom inkubatoru sa 5 posto CO2 na 37 ◦C tokom 1 h. Nakon toga, ćelije su isprane sa PBS i inkubirane sa rastvorom tripsin-EDTA da bi se eliminisali neinternalizovani (i adherentni i ne-adherentni) kristali. Procenat ćelija sa internalizovanim kristalima kvantifikovan je od ukupno 10.000 dobijenih događaja pomoću protočnog citometra (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Ćelije inkubirane sa običnim (neobilježenim) COM kristalima korištene su za postavljanje šuma i praga za pozitivan fluorescentni signal. Ćelije sa pozitivnim fluorescentnim signalima su zatim prebrojane i korištene za izračunavanje takvog procenta.
2.8. Invazija COM kristala kroz ECM test
COM kristali su pripremljeni kako je gore opisano za testove agregacije kristala i adhezije kristalnih ćelija. Analiza invazije kristala je izvedena prema protokolu koji je prethodno uspostavljen [38,39]. Ukratko, ukupno 20 µg COM kristala obloženih puferom za kristalizaciju (slijepa kontrola), DMSO (negativna kontrola), albuminom (Sigma-Aldrich) (pozitivna kontrola) ilidiosmin(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 ili 160 nM) su dodani u 200 ul MEM. Nakon toga, 200 ul 0,3 pM Lys-plazminogena (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) u PBS je pomiješano i inkubirano sa kristalno-proteinskim kompleksom na 37 ◦C tokom 1 h. Nevezani plazminogen je odbačen centrifugiranjem na 2000 g tokom 5 minuta i pelet je jednom ispran sa PBS. Nakon toga, 100 ul 0,15 pM urokinaznog aktivatora plazminogena (uPA) (Fitzgerald Industries International) u PBS-u je pomiješano sa kompleksom kristal-protein-plazminogen/plazmin. Smjesa je zatim dodata na vrh matriks gela unutar ECM migracijske komore i inkubirana na 37 ◦C. Nakon 24-h inkubacije, otopina koja je ostala na gornjem dijelu migracione komore uklonjena je gazom ili maramicom. Invadirani COM kristali unutar matričnog gela su zatim snimljeni pomoću svjetlosnog mikroskopa s diferencijalnim interferentnim kontrastom (DIC) modom (Nikon H600L). Udaljenost invazije kristala je izmerena i usrednjena iz najmanje 15 polja male snage (LPF) unutar iste komore korišćenjem softvera NIS Element D verzije 4.11 (Nikon).
2.9. Statistička analiza
Svi gore navedeni eksperimenti su urađeni u tri primjerka (tri nezavisna eksperimenta), a kvantitativni podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Višestruka poređenja su izvršena korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) sa Tukeyjevim post-hoc testom. Proveden je Pearsonov korelacijski test kako bi se utvrdila veza između varijabli. Sve statističke analize su rađene korišćenjem SPSS softvera (verzija 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). P vrijednost manja od 0.05 smatra se statistički značajnom.
3. Rezultati
3.1. Utjecaj diosmina na kristalizaciju COM
Kristalizacija je jedan od bitnih ranih korakabubregprocesi stvaranja kamena svih vrsta. Nakon 1-h kristalizacije sa ili bezdiosminpri različitim koncentracijama (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ili 160 nM), izmjerena je veličina i broj COM kristala i izračunata je kristalna masa. Pufer za kristalizaciju i diluent DMSO služili su kao slepa i negativna kontrola, respektivno. Podaci su pokazali da sve doze (2,5-160 nM) disomina značajno smanjuju veličinu kristala, ali povećavaju broj kristala na način ovisan o dozi u poređenju sa slijepim i negativnim kontrolama (sl. 1A-1C). U skladu s kristalnim brojem, kristalna masa se povećala ovisno o dozi (slika 1D). Sve u svemu, ovi podaci ukazuju da diosmin potiče kristalizaciju COM (neokristali).
3.2. Utjecaj diosmina na rast COM kristala
Modulirajući efekat oddiosminrast COM kristala je procijenjen mjerenjem promjene veličine kristala (Δ veličina kristala) nakon 60- min dalje inkubacije nakon završetka početnog koraka kristalizacije, kada su neokristali bili odsutni. Rezultati su pokazali da sve doze (2,5–160 nM) disomina značajno smanjuju veličinu Δ kristala na način ovisan o dozi u poređenju sa slijepim i negativnim kontrolama (slika 2). Ovi nalazi ukazuju da diosmin inhibira rast COM kristala.
3.3. Utjecaj diosmina na agregaciju COM kristala
Osim rasta kristala, agregacija pojedinačnih kristala koji se čvrsto prianjaju jedan je drugi važan korak tokombubregpatogeneza kamena. Visok stepen agregacije kristala može u konačnici dovesti do povećanja kamenca i opstrukcije malog lumena bubrežnih tubulara. U poređenju sa praznim i negativnim kontrolama,diosminna 10-160nM dozno-zavisno povećan broj COM kristalnih agregata (slika 3). Ovi rezultati pokazuju da diosmin potiče agregaciju COM kristala.
Cistanche za funkciju bubrega
3.4. Utjecaj diosmina na adheziju COM kristalnih ćelija
Zadržavanje uzročnih kristala je jedan od ključnih koraka zabubregformiranje kamena i može biti izazvan adhezijom kristalnih ćelija koja sprečava izbacivanje kristala zajedno sa odlivom urina. Tako smo procijenili modulacionu aktivnostdiosminna adheziju COM kristalnih ćelija. Podaci su otkrili da diosmin na 5–160 nM značajno smanjuje adhezivnu sposobnost COM kristala na bubrežnim tubularnim stanicama na način ovisan o dozi u poređenju sa slijepim i negativnim kontrolama (slika 4). Ovi podaci ukazuju da diosmin inhibira adheziju COM kristalnih ćelija.
3.5. Utjecaj diosmina na internalizaciju COM kristala u bubrežne tubularne ćelije
Nakon adhezije, neki COM kristali se mogu internalizirati u bubrežne tubularne ćelije i uzrokovati nekoliko sljedećih ćelijskih odgovora [37,40]. Internalizacija kristala je procijenjena korištenjem FITC-obilježenih COM kristala i kvantificirana protočnom citometrijom. Obični COM kristali (bez označavanja) korišteni su za oduzimanje tehničke buke i osiguravanje da je intenzitet fluorescencije od FITC signala. U poređenju sa slijepim i negativnim kontrolama, postotak ćelija sa internaliziranim kristalima značajno je smanjen zadiosminna 10–160 nM na način ovisan o dozi (slika 5). Nalazi ukazuju da disomin inhibira internalizaciju COM kristala u bubrežne tubularne ćelije.
3.6. Učinak diosmina na invaziju COM kristala kroz ECM
Invazija kristala kroz ECM je patogeni/destruktivni proces tokombubregpatogeneza kamena koja može izazvati različite upalne odgovore i kaskade, čime se pogoršavaju mehanizmi bolesti. Ispitivali smo ovaj fenomen koristeći uspostavljeni protokol baziran na plazminogen-plazmin aktivnosti kristalno-proteinskog kompleksa [38,39]. Rezultati su pokazali da sve doze disomina (2,5-160nM) značajno povećavaju invaziju COM kristala kroz ECM na način ovisan o dozi (slika 6). Zanimljivo,diosminna 160nM bi mogao podstaći invaziju COM kristala uporedivu sa albuminom, koji je poznati moćni promoter za invaziju COM kristala [41] (slika 6). Ovi rezultati pokazuju da diosmin snažno potiče invaziju COM kristala kroz ECM.
Slika 1. Efekat oddiosmino COM kristalizaciji. Test kristalizacije je izveden sa jednakom zapreminom (4ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ili diosmina (2,5-160nM). (A): Morfologija kristala u svakom stanju nakon 1-h kristalizacije. Originalno povećanje je bilo 400× za sve panele. (B): Veličina kristala. (C): Kristalni broj. (D): Kristalna masa (vidi Formulu 1 u "Materijali i metode") je analizirana iz najmanje 100 kristala u 15 HPF-ova. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ±SEM podataka izvedenih iz 3 nezavisna eksperimenta. *=str< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Slika 2. Efekat oddiosminna rast COM kristala. Analiza rasta kristala izvedena je nakon što je kristalizacija završena (da bi se spriječila neokristalizacija) sa jednakom zapreminom (4ul) kristalizacijskog pufera (slijepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ili diosmina (2,5–160nM). (A): Morfologija kristala u svakom stanju na T0 i T60. Originalno povećanje je bilo 400 × za sve panele. (B)-(J): Histogrami veličina kristala mjereni iz pojedinačnih kristala na T0 i T60 u svakoj grupi. (K): Δ Veličina kristala (vidi Formulu 2 u "Materijali i metode") je analizirana iz najmanje 100 kristala u 15 HPF-ova. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ± SEM podataka izvedenih iz 3 nezavisna eksperimenta. *= p < 0,05="" u="" odnosu="" na="" praznu="" kontrolu;="" #="p">< 0,05="" u="" odnosu="" na="">
Slika 3. Efekat oddiosminna COM kristalnoj agregaciji. Test agregacije kristala je izveden sa jednakom zapreminom (4ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ili diosmina (2,5-160nM). (A): Mikrofotografije agregiranih COM kristala (označenih tačkastim krugovima). Originalno povećanje je bilo 400 × za sve panele. (B): Broj kristalnih agregata je prebrojan iz najmanje 15 nasumičnih HPF-ova u svakoj jažici. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ± SEM podataka izvedenih iz 3 nezavisna eksperimenta. *=str< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Slika 4. Efekat oddiosminna adheziju COM kristalnih ćelija. Test adhezije kristalnih ćelija izveden je sa jednakom zapreminom (4ul) pufera za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ili diosmina (2,5–160nM). (A): Mikrofotografije preostalih kristala koji su čvrsto prianjali na monosloj ćelije nakon uklanjanja nevezanih kristala snažnim ispiranjem sa PBS. Originalno povećanje je bilo 200 × za sve panele. (B): Broj zalijepljenih kristala je prebrojan iz najmanje 15 nasumičnih polja u svakoj jažici. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ±SEM podataka izvedenih iz 3 nezavisna eksperimenta. *= str<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Slika 5. Efekat oddiosminna internalizaciju COM kristala u bubrežne tubularne ćelije. Analiza internalizacije kristala izvedena je korištenjem FITC-obilježenih COM kristala (FITC-COM), dok su obični (neobilježeni) COM kristali korišteni za oduzimanje pozadine/šuma. Test je izveden sa jednakom zapreminom (4ul) pufera za kristalizaciju (slijepa kontrola), DMSO (negativna kontrola) ili diosmina (2,5–160nM). (A): Protočna citometrijska tačkasta analiza veličine (y-osa) i intenziteta FITC-fluorescencije (x-osa) ćelija nakon uklanjanja neinternaliziranih kristala sa 0,1 posto tripsina/2,5 mM EDTA. (B): Procenat ćelija sa internalizovanim FITC-označenim COM kristalima. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ± SEM podataka izvedenih iz 3 nezavisna eksperimenta. *= str<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Slika 6. Efekat oddiosmino invaziji COM kristala kroz ECM. Invazija kristala kroz ECM test je izvedena korišćenjem COM kristala obloženih puferom za kristalizaciju (slepa kontrola), DMSO (negativna kontrola), albuminom (pozitivna kontrola) ili diosminom (2,5–160nM). (A): Mikrofotografije COM kristala koji su napali ili migrirali kroz ECM migracionu komoru. Originalno povećanje je bilo 100 × za sve panele. (B): Udaljenost invazije kristala je izmjerena iz najmanje 15 nasumičnih LPF-ova u svakoj komori. Svaka traka predstavlja srednju vrijednost ±SEM podataka izvedenih iz 3 nezavisna eksperimenta. *= str<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskusija
Bolest bubrežnih kamenaca je uzrokovana stvaranjem kamenca u bubregububregi pelvokalicealni sistem. Uobičajeni procesi formiranja kamenca u bubregu uključuju kristalizaciju COM, rast, agregaciju, zadržavanje adhezijom kristalnih ćelija i invaziju kroz bubrežni intersticij bogat ECM [21,22]. Postoji nekoliko pokušaja da se ova bolest spriječi korištenjem raznih lijekova i/ili dodataka ishrani. Mnogi redovi nedavnih dokaza navode da flavonoidi, flavonski glikozidi i druga jedinjenja ekstrahovana iz citrusnog voća mogu imati preventivne efekte na bolest bubrežnih kamenaca i druge poremećaje [23-25]. među ovima,diosmin, prirodni flavonski glikozid i derivat hesperidina koji se nalazi uglavnom u agrumima [1,2], sugerirano je da igra preventivnu ulogu protiv ozljeda i oštećenjabubregtkiva [13,42]. Štaviše, njegova uloga protiv urolitijaze je prijavljena u nekoliko prethodnih studija na životinjskim modelima [26,27]. Ipak, korisni efekti i osnovni mehanizmi diosmina u prevenciji bubrežnih kamenaca ostali su nejasni. Stoga smo ispitali modulacijsku aktivnost diosmina na COM kristalima. Sistematske analize su rađene na različitim fazama COM-abubregformiranje kamena, uključujući kristalizaciju, rast kristala, agregaciju, adheziju kristalnih ćelija, internalizaciju u bubrežne tubularne ćelije i invaziju kroz ECM.
Nakon oralnog uzimanjadiosmin, njegov nivo u plazmi kod ljudi je u rasponu od {{0}}.5 do 200 ng/ml (ili 0,8–300 nM) [43,44]. Maksimalna koncentracija u plazmi (Cmax) je približno 50 ng/ml (ili 85 nM) [43,44]. Stoga su doze diosmina korištene u našoj sadašnjoj studiji (2,5–160 nM) bile u farmakološki relevantnom rasponu za njegovu farmakokinetiku. Budući da je DMSO korišten kao razrjeđivač za potpuno otapanje diosmina prema preporuci, DMSO je korišten kao negativna kontrola u ovoj studiji uz slijepu kontrolu kako bi se osiguralo da nema efekata samog razblaživača koji bi mogli ometati interpretaciju podataka. U svim testovima, podaci su pokazali da nisu uočeni značajni efekti DMSO i svi kvantitativni podaci dobijeni iz negativne kontrole bili su uporedivi sa onima iz slijepe kontrole.
COM analiza kristalizacije otkrila je da su sve koncentracije oddiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 i 160 nM) može smanjiti veličinu COM kristala, ali, s druge strane, povećati broj kristala. Kako je kristalna masa konačni proizvod veličine i broja kristala i relevantnija je da odražava stepen kristalizacije COM, onda smo procijenili da li diosmin utječe na ovaj kristalni indeks. Podaci su pokazali da su sve koncentracije diosmina imale promotivni efekat na COM kristalnu masu, u skladu sa podacima o kristalnom broju. Nakon kristalizacije, COM kristali mogu dalje rasti do veće veličine za sljedeći korakbubregformiranje kamena.
Za razliku od kristalizacije, diosmin je u svim koncentracijama pokazivao inhibitorni učinak na rast COM kristala na način ovisan o dozi. Neka prethodna istraživanja su objavila da se rastvorljivost kristala CaOx može povećati derivatima hidroksiantrakinona sa glikozilacijom [45]. Dodatno, prisustvo šećera u takvim bioaktivnim jedinjenjima može se vezati sa slobodnim jonom kalcija, moguće zbog hidroksilnih grupa u molekularnoj strukturi, čime se inhibira stvaranje kristala CaOx [45,46]. Diosmin takođe može uticati na tranziciju rastvorenih kalcijumovih i oksalatnih jona u COM kristalne čestice u bubrežnoj tubularnoj tečnosti u procesu kristalizacije COM na osnovu ovog mehanizma.
Ipak, agregacija COM kristala je promovirana za 10-160nMdiosmin, što implicira sposobnost diosmina da djeluje kao povezivač ili adhezivni molekul za regrutovanje pojedinačnih kristala da se vežu zajedno kako bi formirali kristalne agregate. Ovo vezivanje također rezultira progresijom adhezivnih mostova između pojedinačnih kristala i može izazvati stvaranje velike strukture COM kristala, koji lako doprinose taloženju kamenih nidusa unutarbubreg[32].
Zadržavanje COM kristala kroz adheziju kristala na površini bubrežnih tubularnih ćelija je utvrđeno kao još jedan važan korak za formiranje bubrežnih kamenaca [47]. Naši podaci su otkrili da diosmin može smanjiti adhezivnu sposobnost COM kristala da se vežu za apikalne površine MDCK bubrežnih tubularnih stanica. Neka prethodna istraživanja su pokazala da glikozaminoglikani (polisaharidna jedinjenja) obloženi kristalima CaOx ili eksprimirani na bubrežnim tubularnim ćelijama mogu interferirati sa adhezivnom sposobnošću kristala CaOx na bubrežne tubularne ćelije [48]. Dodatno, ekspresija kristalnih receptora na bubrežnim tubularnim ćelijama je jedan od ključnih mehanizama koji određuju adheziju kristalnih ćelija [21]. Dok kristali CaOx izazivaju ozljedu apikalnih membrana, posebno mikroresica, neki polifenoli kao što je epigalokatehin galat (EGCG) mogu spriječiti adheziju kristalnih ćelija i ćelijsku ozljedu [49]. Štaviše, ranije je prijavljeno da flavonoidne supstance u raznim biljnim ekstraktima povećavaju pH nivo urina, što dovodi do inhibicije adhezije kristalnih ćelija [50,51]. možda,diosmintakođe može ublažiti takvu ćelijsku povredu izazvanu COM, čime se smanjuje adhezija kristalnih ćelija.
Pokazalo se da se internalizacija COM kristala javlja uglavnom endocitozom putem makropinocitoznog puta posredovanog aktinskim citoskeletom [40]. Prijavljeno je da flavonoidi kao što je kvercetin utiču na aktinski citoskelet potreban za makropinocitozu [52,53]. Naši nalazi su pokazali da diosmin značajno smanjuje sposobnost MDCK ćelija da internalizuju COM kristale. Takav inhibitorni efekat diosmina može biti povezan sa sklapanjem ili organizacijom aktinskog citoskeleta unutar ćelija koji direktno utiče na put makropinocitoze [54,55].
Nakon internalizacije, COM kristali su razgrađeni endolizosomima što je rezultiralo povećanjem slobodnih jona kalcijuma i oksalata u bubrežnom intersticijumu [37]. Takvo povećanje jona kalcijuma i oksalata može dovesti do neokristalizacije COM u bubrežnom intersticijumu [56,57]. Osim toga, prisustvo intersticijalnih COM kristala može biti uzrokovano defektima čvrstog spoja i paracelularnim adhezijskim barijerama, što rezultira povećanom paracelularnom permeabilnosti i translokacijom kristala [58–60]. Ovi kristali zatim mogu napasti bubrežni intersticij kroz ECM i nakon toga pokrenuti nekoliko upalnih odgovora i oštećenja tkiva [58–60]. U ovoj studiji smo uočili da je invazija COM kristala kroz ECM migracionu komoru izazvana svim koncentracijama diosmina. Diosmin bi se mogao vezati za površine COM kristala i stupiti u interakciju sa plazminogen-plazmin sistemom koji je pokretao migraciju kristala u ECM migracijskoj komori [38,39].
Cistanche za bubreg
Jerdiosmininduciranih i inhibirajućih i promotivnih efekata na različite različite procese formiranja COM kamena, stoga smo utvrdili njihov odnos pomoću Pearsonovog korelacionog testa. Korelaciona analiza je otkrila da je broj kristala u obrnutoj korelaciji sa veličinom kristala i rastom kristala (Δ veličina kristala) (sl. 7A i B). Veličina kristala je u snažnoj korelaciji sa rastom kristala (slika 7C), ali u obrnutoj korelaciji sa kristalnom masom (slika 7D). Konačno, kristalna masa je u snažnoj korelaciji sa brojem kristala i agregacijom kristala (sl. 7E i F). Iz korelacijske analize, podaci pokazuju da su broj kristala i kristalna masa relevantniji za odraz kristalizacije nego veličina kristala (sl. 7A, D i E). Pored toga, veličina neokristala tokom kristalizacije je povezana sa rastom prethodno formiranih kristala (slika 7C), dok je stepen kristalizacije (kao što se odražava brojem kristala i kristalnom masom) usko povezan sa stepenom agregacije kristala (slika 7E i F). Međutim, ove korelacije su najvjerovatnije specifične za efekte diosmina, dok efekti drugih modulatora mogu, ali i ne moraju imati iste korelacije. Na primjer, fibronektin smanjuje kristalnu masu i inhibira rast kristala, ali potiče agregaciju kristala [31]. Osim toga, intaktna održiva Escherichia coli povećava veličinu i masu kristala, ali nema utjecaja na broj kristala [33]. Ovi podaci pokazuju da korelacije između različitih COM kristalnih testova nisu univerzalne za sve modulatore.
Konačno, saželi smo rezultate dobijene iz različitih testova i integrisali ih sa patogenim mehanizmimabubregkamena bolest (vidi šeme na slici 8). Prema korelacionoj analizi, diosmin podstiče kristalizaciju (slika 8A). Između kristalizacije i rasta kristala,diosminodržava dobru ravnotežu potičući kristalizaciju, ali, s druge strane, inhibirajući rast kristala (slika 8B). Što se tiče svih efekata samo na COM kristale (bez uzimanja u obzir ćelija i ECM koji takođe intervenišu), promotivna aktivnost diosmina je istaknutija od njegove inhibicione aktivnosti na COM kristale jer potiče i kristalizaciju i agregaciju kristala, ali inhibira samo rast kristala ( Slika 8C). Iako se kristalizacija povećava, veličina kristala se smanjuje i povezana je sa inhibicijom rasta (slika 7C). Ovi podaci su u skladu sa rezultatima koje su objavili Kavanagh et al. [61–63], pokazujući da povećanje kristalizacije dovodi do opadanja prezasićenosti jona kalcijuma i oksalata u rastvoru, čime se smanjuje rast. Međutim, rast kristala nije jedini faktor koji određujebubregpatogeneza kamena [64], posebno kada je kristalna masa nadjačana i povezana je s povećanjem agregacije kristala (slika 7F) što može povećati šansu da se kristalni materijali zaglave u malim cjevastim segmentima (u intratubularnoj hipotezi), čime se povećava mogućnost stvaranja kamena. Štoviše, prethodna studija je pokazala podatke koji su u skladu s našim nalazima, što ukazuje da je povećanje broja kristala povezano s povećanjem agregacije kristala i povećanjem kamena [63].
Slika 7. Analiza korelacije. (A)–(F): Korelacije između COM kristalnog broja, veličine kristala, Δ veličine kristala, kristalne mase i broja kristalnih agregata analizirane su Pearsonovim korelacijskim testom.
Slika 8. Šeme koje sumiraju modulatorne efektediosminna COMbubregprocesi stvaranja kamena. (A): Efekti diosmina na kristalizaciju COM. (B): Efekti diosmina na kristalizaciju COM i rast kristala. (C): Efekti diosmina na kristalizaciju, rast i agregaciju COM. (D): Efekti diosmina na cjelokupne procese stvaranja kamenca u bubregu COM.
Kada se uzmu u obzir interakcije sa bubrežnim tubularnim ćelijama i ECM, globalna slika dvostrukih efekatadiosminna COM formiranje bubrežnog kamenca postaje mnogo jasnije (slika 8D). Diosmin inhibira adheziju kristalnih ćelija, čime se smanjuje internalizacija kristala u ćelije. Ovo se može objasniti da manja veličina COM kristala ima manju adhezivnu sposobnost da veže bubrežne tubularne ćelije u poređenju sa većim, kao što je objavljeno u našoj nedavnoj studiji [34] i prethodnoj studiji druge grupe [65]. Manja adhezivna sposobnost manjih COM kristala je zbog njihove manje adhezivne sile za površinu ćelije i manjeg broja COM kristalnih receptora vezanih za njih, što je utvrđeno mikroskopijom atomske sile i analizom proteoma, respektivno [34]. Diosmin takođe inhibira internalizaciju kristala. Imajte na umu da je proces internalizacije mač sa dvije oštrice koji treba pažljivo tumačiti. Internalizacija ili endocitoza u jednom od odbrambenih mehanizama koje ćelije koriste za eliminaciju kristala endolizosomima. Međutim, degradacija intaktnih kristala stvara slobodne ione kalcija i oksalata koji se mogu kretati iz intracelularnog odjeljka u bubrežni intersticij, gdje mogu stvoriti neokristale [56,57]. S druge strane, diosmin potiče invaziju kristala kroz ECM, što je jedan od mehanizama važnih za patogenezu bubrežnih kamenaca (posebno u modelu Randallovog plaka) [58–60]. Sve u svemu, slika 8D sumira sve dvostruke modulatorne efekte diosmina na COMbubregprocesi stvaranja kamena. Treba napomenuti da se ravnoteža ovih promotivnih i inhibirajućih efekata ne može precizno izračunati (za razliku od matematičke jednačine). Osim toga, postoji nekoliko drugih endogenih i egzogenih faktora koji također mogu intervenirati u procesima stvaranja kamena. Konačno, diosmin također pokazuje nekoliko indirektnih učinaka na stvaranje bubrežnih kamenaca, uključujući njegova antioksidativna i protuupalna svojstva [5,6] koja treba uzeti u obzir. Stoga je konačni ishod ovih dvostrukih modulacijskih efekata oddiosminna COMbubregformiranje kamena treba dalje in vivo istraživanje i prospektivno istraživanje velike kohorte.
5. Zaključci
Ukratko, ovdje izvještavamo o dvostrukim efektima diosmina na modulaciju COM kristala na način ovisan o dozi. Dok inhibira rast kristala COM, adheziju kristalnih ćelija i internalizaciju u bubrežne tubularne ćelije,diosminpromovira COM kristalizaciju, agregaciju i invaziju kroz ECM. Stoga je njegova anti-urolitijazna uloga upitna i treba biti oprezan pri upotrebi kod bubrežnih kamenaca.
CrediT izjava o autorskom doprinosu
Supaporn Khamchun: Konceptualizacija, Metodologija, Softver, Validacija, Formalna analiza, Istraživanje, Kuriranje podataka, Pisanje – originalni nacrt, Vizualizacija, Sunisa Yoodee: Konceptualizacija, Metodologija, Softver, Validacija, Formalna analiza, Istraživanje, Kuriranje podataka, Pisanje – originalni nacrt, Vizualizacija, posjetite Thongboonkerd: konceptualizacija, metodologija, softver, validacija, resursi, pisanje – pregled i uređivanje, nadzor, administracija projekta, pribavljanje sredstava.
Izjava o sukobu interesa
Autori izjavljuju da NEMA sukoba interesa.
Priznanja
Zahvaljujemo na tehničkoj pomoći Kittiya Suwannakud. Ovaj rad je podržao Ured Nacionalnog savjeta za istraživanje nauke i inovacije u visokom obrazovanju (NXPO) preko PMU-B i Tajlandskog istraživačkog fonda (IRN60W0004). VT također podržava "Chalermphrakiat" Grant, Medicinski fakultet bolnice Siriraj.
Reference
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– tehnike izolacije, određivanje u biljnom materijalu i farmaceutskim formulacijama i klinička upotreba, Nat. Prod. Commun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolizam i farmakološke aktivnosti prirodnog jedinjenja diosmin koji koristi zdravlje, Funkcija hrane. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: procjena efekata na kvalitet života kod hronične venske insuficijencije, Angiologija 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikronizirana prečišćena frakcija flavonoida: pregled njene upotrebe kod kronične venske insuficijencije, venskih ulkusa i hemoroida, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflamatorna, antioksidativna i antiapoptotička aktivnost diosmina kod ulceroznog kolitisa izazvanog octenom kiselinom, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–{7}}.
[6] M. Berkoz, Diosmin suprimira proinflamatorne medijatore u makrofagima RAW264.7 izazvanim lipopolisaharidom putem NF-kappaB i MAPKs signalnih puteva, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin inducira apoptozu kroz modulaciju STAT-3 signalizacije u 7,12 dimetilbenz(a)antracenom induciranoj karcinogenezi štetnih bukalnih vrećica, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmin-indukovano starenje, apoptoza i autofagija u ćelijama raka dojke različitog statusa p53 i aktivnosti ERK, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Kombinacija prenamijenjenog lijeka diosmin sa amoksicilin-klavulanskom kiselinom uzrokuje sinergističko inhibiciju rasta mikobakterija, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Antihiperglikemijsko djelovanje diosmina, citrusnog flavonoida, inducira se preko endogenog beta-endorfina kod dijabetičkih štakora tipa I, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminpredtretman poboljšava srčanu funkciju i suzbija oksidativni stres u srcu štakora nakon ishemije/reperfuzije, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin štiti retinu pacova od ishemijske/reperfuzijske ozljede, J. Ocul. Pharm. Ther. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Zaštitni efekti hesperidina i diosmina protiv jetre, bubrega induciranih akrilamidom, i oksidativno oštećenje mozga kod pacova, Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Pravilo, Određivanje pravog teretabubregkamena bolest, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nefrolitijaza, Prim. Care 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renal stones, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Sastav kamena i vaskularne kalcifikacije kod pacijenata sa nefrolitijazom, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Analiza kamena, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Odgovor bubrežnih tubularnih ćelija na različite tipove i doze kristala kalcijum oksalata: integrativna analiza proteomske mreže i funkcionalna istraživanja, Proteomika 177 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Analiza proteinske mreže i funkcionalne studije citotoksičnosti inducirane kristalima kalcijum oksalata u stanicama epitela bubrežnih tubula, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolitijaza: molekularni mehanizam formiranja bubrežnog kamenca i kritična uloga koju imaju modulatori, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mehanizmi formiranja kamena, Clin. Rev. Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Zaštitne uloge flavonoida i biljnih ekstrakata bogatih flavonoidima protiv urolitijaze: pregled, Krit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dijetalne biljke za prevenciju i upravljanjebubregkamenje: pretklinički i klinički dokazi i molekularni mehanizmi, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, Mehanistički uvid polifenola u ublažavanju urolitijaze kalcijum oksalata, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Evaluacija zaštitnih efekata diosmina (a citrus flavonoid) u kemijski induciranoj urolitijazi kod eksperimentalnih pacova, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminsmanjuje taloženje kalcijum oksalata i degeneraciju tkiva kod nefrolitijaze kod pacova: stereološka studija, Korean J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Faktori koji određuju tipove i morfologiju kristala kalcijum oksalata: molarne koncentracije, puferovanje, pH, mešanje i temperatura, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomska analiza kristalno-inducirane citotoksičnosti kalcijum oksalat monohidrata u distalnim bubrežnim tubularnim stanicama, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Faktor elongacije Tu on Escherichia coli izolovan iz urina pacijenata sa bubrežnim kamencima pospešuje rast i agregaciju kristala kalcijum oksalata, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulacijski efekti fibronektina na kristalizaciju kalcijum oksalata, rast, agregaciju, adheziju na bubrežne tubularne ćelije i invaziju kroz ekstracelularni matriks, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definiranje i sistematske analize indeksa agregacije za procjenu stepena agregacije kristala kalcijum oksalata, Front. Chem. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum je odgovoran za promicanje efekata održive Escherichia coli na kristalizaciju kalcijum oksalata, rast kristala i agregaciju kristala, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Diferencijalno vezani proteini i adhezivne sposobnosti kristala kalcijum oksalat monohidrata različitih veličina, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Površinski protein toplotnog šoka 90 služi kao potencijalni receptor za kristal kalcijum oksalata na apikalnoj membrani bubrežnih tubularnih epitelnih ćelija, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Neradioaktivno označavanje kristala kalcijum oksalata za istraživanje interakcije i internalizacije kristalnih ćelija, Anal. Metode 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Kristali kalcijum oksalat monohidrata internalizovani u bubrežne tubularne ćelije razgrađuju se i rastvaraju endolizosomima, Chem. Biol. Interakcija. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Novi test za procjenu promotivnih efekata proteina na invaziju kristala kalcijum oksalata kroz ekstracelularni matriks na osnovu aktivnosti plazminogena/plazmina, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Kristali kalcijum oksalata povećali su lučenje enolaze-1 iz bubrežnih tubularnih ćelija koje su potom pojačale invaziju kristala i monocita kroz bubrežni intersticij, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Makropinocitoza je glavni mehanizam za endocitozu kristala kalcijum oksalata u bubrežne tubularne ćelije, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: baza podataka zabubregstone modulatorni proteini s eksperimentalnim dokazima, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabačak, Efekti diosmina na oštećenje jetre i bubrega izazvano aflatoksinom, Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Komparativna bioraspoloživost dvadiosminformulacije nakon oralne primjene zdravim dobrovoljcima, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Farmakokinetika flavanon glikozida nakon uzimanja pojedinačne doze svježe iscijeđenog soka od narandže u odnosu na komercijalno prerađen sok od narandže kod zdravih ljudi, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Sinteza glikozidnih derivata hidroksiantrakinona sa sposobnošću rastvaranja i inhibiranja formiranja kristala kalcijum oksalata. Potencijalna jedinjenja u terapiji bubrežnih kamenaca, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Studija kreme na bazi mio-inozitol heksafosfata za prevenciju distrofične kalcinoze kože, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomika interakcija kristalnih ćelija: model za istraživanje bubrežnih kamenaca, Ćelije 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Retencija kristala kod bubrežnih kamenaca: ključna uloga glikozaminoglikana hijalurona? J. Am. Soc. Nefrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Povreda mikrovilara u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama izazvana kristalom kalcijum oksalata i zaštitna uloga epigalokatehin{2}}galata, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Ukupni flavonoidi Desmodium styracifolium smanjuju stvaranje hidroksi- L-prolinom inducirana kalcijum oksalatna urolitijaza kod pacova, Urolitijaza 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Sistematska procjena uticaja pH urina na kristalizaciju kalcijum oksalata, adheziju kristalnih ćelija i internalizaciju u bubrežne tubularne ćelije, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Inhibitivni efekat na fagocitozu Candida albicans indukovanu prethodnom obradom kvercetinom putem interferencije aktinskog citoskeleta, J. Tradit. Brada. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, kvercetin inhibira migraciju makrofaga izazvanu LPS supresijom iNOS/FAK/paksilina puta i modulacijom citoskeleta, ćelijskih adheza . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Recikliranje membrane posredovano makropinocitozom pokreće migraciju neuralnog grebena isporukom F- aktin na lamelipodijum, Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, RapGEF GflB koji vezuje F-aktin je neophodan za efikasnu makropinocitozu u Dictyostelijumu, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalencija, patofiziološki mehanizmi i faktori koji utiču na urolitijazu, Int. Urol. Nefrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mehanizmi formiranja kamena u bubregu kod ljudi, Urolitijaza 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mitohondrijska disfunkcija ibubregkamena bolest, front. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Histološki aspekti modela formiranja kamena "fiksnih čestica": studije na životinjama, Urolitijaza 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Kako nastaje kamenje? Je li moguće objedinjavanje teorija o formiranju kamena? Arch. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Metode za proučavanje kristalizacije kalcijum oksalata i njihova primjena u istraživanju urolitijaze, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, rasprava 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kinetika kristalizacije kalcijum oksalata pri različitim koncentracijama ljudskog i veštačkog urina, sa konstantnim odnosom kalcijuma i oksalata, Urol. Res. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, kristalurija i agregacija: ključni sastojci za povećanje kamena, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverzni inženjering bubrega: modeliranje kristalizacije kalcijum oksalat monohidrata u nefronu, Med. Biol. inž. Račun. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Efekat intrakristalnog i površinski vezanog osteopontina na vezivanje kristala kalcijum oksalat dihidrata za ćelije Madin-Darby psećeg bubrega (MDCK) u ultrafiltriranom ljudskom urinu, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.