Različiti antivirusni sistemi kvasca sprječavaju smrtonosnu patogenezu uzrokovanu LA Mycovirusom

Nedavne studije pokazuju da su antivirusni sistemi izuzetno očuvani od bakterija do sisara, pokazujući da se jedinstveni uvid u ove sisteme može steći proučavanjem mikrobnih organizama. Međutim, za razliku od bakterija, gdje infekcija fagom može biti smrtonosna, kod pupajućeg kvasca Saccharomyces cerevisiae nije poznata nikakva citotoksična virusna posljedica iako je kronično inficirana dvolančanom RNK mikovirusom zvanom LA. Ovo ostaje slučaj uprkos prethodnoj identifikaciji konzerviranih antivirusnih sistema koji ograničavaju replikaciju LA. Ovdje pokazujemo da ovi sistemi sarađuju kako bi spriječili bujnu replikaciju LA, što uzrokuje smrtnost u ćelijama koje se uzgajaju na visokim temperaturama. Koristeći ovo otkriće, koristimo ekran prekomjerne ekspresije za identifikaciju antivirusnih funkcija za homologe kvasca proteina koji veže poliA (PABPC1) i proteina Larp1 koji sadrži La-domen, koji su oba uključena u virusni urođeni imunitet kod ljudi. Koristeći pristup komplementarnog gubitka funkcije, identificiramo nove antivirusne funkcije za konzervirane RNA egzonukleaze REX2 i MYG1; regulatorni kompleksi hromatina SAGA i PAF1; i HSF1, glavni transkripcijski regulator odgovora na proteostatski stres. Kroz istraživanje ovih antivirusnih sistema, pokazujemo da je patogeneza LA povezana sa aktiviranim proteostatskim odgovorom na stres i akumulacijom citotoksičnih proteinskih agregata. Ovi nalazi identificiraju proteotoksični stres kao temeljni uzrok patogeneze LA i dalje unapređuju kvasac kao moćan model sistema za otkrivanje i karakterizaciju očuvanih antivirusnih sistema.

Svi laboratorijski sojevi i većina izolata kvasca S. cerevisiae iz okoliša zaraženi su dvolančanom RNA (dsRNA) virusom koji se zove LA (1, 2). LA pripada široko rasprostranjenoj Totiviridae porodici endogenih dsRNA virusa. Kao i svi virusi ove porodice, genom LA dsRNA je upakovan u virion koji ga štiti od varenja posredovanog domaćinom. Rupe u virionu dozvoljavaju ekstruziju RNA transkripata u citosol koji kodira kapsidni protein, Gag, koji čini većinu čestice. LA transkript također kodira Gag-pol fuzioni protein, proizveden na mnogo nižim razinama od Gag proteina, koji posjeduje aktivnost RNA-zavisne RNA polimeraze. Svaki virion sadrži Gag-pol protein, koji je odgovoran za LA replikaciju i transkripciju unutar čestice. Kapsidacija virusnih transkripata unutar čestica u nastajanju i sinteza negativnog RNA lanca pomoću Gag-pola da bi se formirao dsRNA genom završava ciklus replikacije LA (2). Za proizvodnju ovih proteina, LA koristi karakteristike tipične za RNA viruse pronađene kod ljudi, uključujući mehanizam "hvatanja kape" koji daje LA transkripte sa 5'-metil kapom i ribosomski mehanizam pomjeranja okvira za proizvodnju Gag i Gag-pol fuzijskih proteina iz jedan transkript (3, 4).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Nedavne studije bakterijskih antivirusnih sistema pokazale su da oni dijele izvanrednu evolucijsku očuvanost s ljudima, otkrivajući potencijal mikrobnih organizama da pruže novi uvid u virusni urođeni imunitet (5-11). Zaista, rane studije koje su uključivale LA dovele su do otkrića dva antivirusna sistema za koja se kasnije pokazalo da doprinose urođenom imunitetu protiv različitih RNK ​​virusa kod sisara (12-17). Prvi od ovih antivirusnih sistema uključuje gene SKI2, 3 i 8, koji kodiraju podjedinice konzerviranog kompleksa povezanog s ribozomima koji se suprotstavlja transkripciji transkripata koji nemaju poli(A) repove poput onih koje kodira LA (18-23). Odvojeni put slabljenja LA događa se kroz Xrn1 (također poznat kao SKI1), 5′-3′ egzoribonukleazu koja razgrađuje neograničene mRNA (24–26).

Nedavno smo otkrili da mitohondrijska DNK/RNA endonukleaza Nuc1 potiskuje akumulaciju LA u sporulirajućim ćelijama, što predstavlja novi antivirusni put kvasca (27). Nuc1 je homolog endonukleaze G (EndoG) koji se nalazi u svim eukariotima i mnogim prokariotima i najpoznatiji je po svojoj ulozi u promicanju fragmentacije genoma tokom programirane ćelijske smrti sisara, istaknutog mehanizma odbrane virusa u posljednjem slučaju (28, 29). Intrigantno, programirana ćelijska smrt je svojstvena sporulaciji kvasca, a Nuc1 fragmentira DNK od umirućih mejotskih proizvoda tokom ovog procesa, pored svoje uloge u smanjenju nivoa LA virusa koji su naslijeđeni od strane preživjelih spora (27, 30, 31).

Uprkos sveprisutnoj prisutnosti LA u laboratorijskim sojevima, nije mu pripisana nikakva kondiciona posljedica i stoga se LA u velikoj mjeri smatra bezopasnim komensalom. Ovdje pokazujemo da je LA infekcija u stvari smrtonosna za gljivice i da se mora aktivno oslabiti kroz virusni urođeni imunitet kako bi se očuvala održivost. Konkretno, kod sojeva koji nemaju paralelno djelujući NUC1 i SKI antivirusni putevi, broj kopija LA je značajno povećan, što dovodi do smrtnosti na visokim temperaturama.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Zaključili smo da bi dalja karakterizacija LA i faktora koji održavaju njegovu replikaciju na niskom nivou mogla otkriti nove antivirusne sisteme. Identifikovanje uslova koji dovode do LA patogeneze omogućilo nam je da koristimo bioinformatičke pristupe i pristupe genetskom skriningu za otkrivanje novih antivirusnih gena. Koristeći skrining za prekomjerno eksprimirane gene koji potiskuju nuc1∆ ski3∆ uslovnu smrtnost, identificirali smo antivirusne funkcije za homologe kvasca poli(A)-vezujućeg proteina (PABPC1) i La-domena koji sadrži protein Larp1, koji su oba uključena u urođeni virus imunitet kod ljudi (32, 33). Štaviše, genetske studije gubitka funkcije identificirale su dvanaest novih antivirusnih gena. Među njima su visoko konzervirani SAGA transkripcijski koaktivatorski kompleks i nekoliko RNA egzonukleaza uključujući REX2 i MYG1, od kojih obje imaju različite, ali slabo karakterizirane humane i bakterijske homologe (34-37).

Konačno, karakteriziramo patogenezu LA koristeći ćelijske biološke metode i otkrivamo da visoko virusno opterećenje uzrokuje proteostatski stres. Kako je dobro poznato da visoka temperatura pogoršava proteostatski stres, ova zapažanja sugeriraju da je katastrofalni proteostatski stres uzrok smrtnosti uzrokovane LA. U skladu s ovom hipotezom, pokazujemo da nuc1∆ ski3∆ mutanti pokazuju LA-zavisnu osjetljivost na azetidin-2-karboksilnu kiselinu (AZC), analog prolina za koji je poznato da uzrokuje ortostatski stres (38). Nadalje, demonstriramo antivirusnu funkciju za HSF1, konzervirani faktor transkripcije koji osjeti i usmjerava odgovor na ortostatski stres. Zanimljivo je da ljudski Hsf1 također igra važnu ulogu u replikaciji i/ili patogenosti različitih virusa uključujući HIV, SARS-Cov-2 i virus denga groznice, iako su mehanizmi nejasni (39). Ova otkrića daju nove primjere očuvanja urođenog imuniteta od mikroba do ljudi i dalje visoke svjetlosti kvasca kao moćnog modela sistema za otkrivanje novih antivirusnih sistema.

Rezultati

NUC1, SKI i XRN1 antivirusni sistemi kvasca sarađuju kako bi spriječili LA patogenezu.

Naše prethodne studije NUC1 bile su fokusirane na mejotičke ćelije (27). Da bismo istražili antivirusnu funkciju NUC1 u vegetativno rastućem kvascu, ispitali smo broj kopija LA u mitotičkim haploidnim stanicama u referentnoj pozadini soja BY4742. Promatrali smo nivoe LA dsRNA koristeći etidij bromid bojenje elektroforeze RNK i otkrili da dvostruki mutant nuc1∆ ski3∆ pokazuje veliko povećanje LA dsRNA (slika 1A). Ove nalaze smo potvrdili korištenjem imunofluorescentne mikroskopije s dsRNA antitijelom koje se koristi za otkrivanje replicirajućih RNA virusa (40, 41). Ove slike su pokazale da se LA dsRNA akumulirala u žarištima, koja podsjećaju na mjesta virusne replikacije "fabrika virusa" uočena u ljudskim ćelijama (slika 1B i SI dodatak, slika S1) (42). U skladu sa prethodnim nalazima kod drugih sojeva (24, 27, 43), Western blotting je pokazao da su nivoi Gag proteina povišeni u nuc1∆ i ski3∆ mutantima (slika 1C). Nadalje, pokazali smo da je dvostruki mutant nuc1∆ ski3∆ akumulirao masivno povišene nivoe Gag (slika 1C). Ovi podaci pokazuju da NUC1 i SKI3 učestvuju u odvojenim antivirusnim putevima i da gubitak oba puta dovodi do značajnog povećanja LA virusnog opterećenja.

Da bismo utvrdili da li visoko LA virusno opterećenje utječe na staničnu kondiciju, ispitali smo rast kvasca koristeći testove rasta na licu mjesta. Suptilni defekti rasta pojedinačnih mutanata nuc1∆ i ski3∆ uočeni su na 37 stepeni kada su ćelije uzgajane sa glicerolom, a ne sa glukozom kao izvorom ugljenika, uslov pod kojim se kvasac oslanja na mitohondrijalno disanje (slika 1D). Zanimljivo, iako su dupli mutanti nuc1∆ ski3∆ normalno rasli na 30 stepena, oni su pokazali uslovnu smrtnost na 37 stepeni bez obzira na izvor ugljenika (slika 1D). Kao što se očekivalo, vijabilnost na visokoj temperaturi je vraćena nuc1∆ ski3∆ dvostrukom mutantu pomoću plazmida koji ekspresira NUC1- koji je izazvao odgovarajuće smanjenje nivoa Gag (Slika 1 C i D). Da bismo potvrdili da je defekt rasta dvostrukog mutanta nuc1∆ ski3∆ uzrokovan LA, konstruirali smo izogeni soj izliječen od LA (LA0) i ispitali njegov rast na visokim temperaturama. Otkrili smo da je defekt rasta potpuno ublažen, što implicira da je uslovna smrtnost rezultat neograničene replikacije LA (slika 1D). Da bismo procijenili efekte velikog broja kopija LA na sposobnost ćelija u optimalnim uslovima rasta, izmjerili smo stope proliferacije u tečnoj kulturi. Ove studije su otkrile smanjenu stopu rasta kod nuc1∆ ski3∆ dvostrukih mutanata u poređenju sa divljim tipom na 30 stepeni koji je bio obrnut u L-A0 sojevima, pokazujući da je visoko opterećenje LA štetno za kondiciju čak i u ćelijama bez stresa (SI Dodatak, Sl. S2).

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Da bismo dalje okarakterisali kako NUC1 interaguje sa poznatim antivirusnim putevima, testirali smo njegovu vezu sa XRN1. Otkrili smo da je dvostruki mutant nuc1∆ xrn1∆ akumulirao znatno povišene nivoe Gag u poređenju sa bilo kojim pojedinačnim mutantom i pokazao uslovnu smrtnost zavisnu od LA na visokoj temperaturi (SI Dodatak, slike S3 A ​​i B), što sugeriše da NUC1 i XRN1 deluju u paralelni putevi za slabljenje LA. Odražavajući njihove ključne neredundantne uloge u bulk regulaciji mRNA, dvostruki mutant xrn1∆ ski3∆ je neizvodljiv, čak i kod sojeva kojima nedostaje LA (44). Da bismo utvrdili da li XRN1 predstavlja antivirusni sistem nezavisan i od NUC1 i od SKI3, koristili smo plazmid velike kopije za prekomernu ekspresiju XRN1 u dvostrukom mutantu nuc1∆ ski3∆. Zaista, uočili smo značajno smanjenje nivoa Gag i supresiju uslovne letalnosti nuc1∆ ski3∆ koristeći prekomernu ekspresiju XRN1 vođenu plazmidom (sl. 1 C i D). Zaključujemo da se Nuc1, Ski3 i Xrn1 konvergentno suprotstavljaju replikaciji LA i da je masovno povećano LA virusno opterećenje u nuc1∆ ski3∆ ili nuc1∆ xrn1∆ mutantima uzrokovalo smrtonosnu patogenezu na visokim temperaturama (slika 1E).

Genetski pregled zasnovan na bioinformatici identifikuje nove antivirusne faktore.

LA-ovisna uslovna smrtnost dvostrukih mutanata nuc1∆ ski3∆ povećala je mogućnost da se drugi antivirusni faktori mogu identificirati kroz kombinatorne studije mutanata. Da bismo identificirali nove kandidate za antivirusne faktore, pretražili smo kuriranu bazu podataka genetskih interakcija za delecije gena koje su uzrokovale sintetički defekt rasta u kombinaciji s nuc1∆ u najmanje dvije studije visokog učinka (45). Pored očekivanog prisustva XRN1 i SKI delecija u ovom skupu podataka, pronašli smo šesnaest dodatnih gena. Koristili smo genetsko ukrštanje da bismo napravili trostruke mutante kombinujući delecije svakog od ovih šesnaest gena sa nuc1∆ ski3∆ i potvrdili da je šest uzrokovalo ozbiljne defekte u rastu (Tabela 1). Utvrdili smo da su sintetički fenotipovi rasta uzrokovani svakim od ovih gena obrnuti u LA0 sojevima, što sugerira da oni kodiraju antivirusne proteine ​​(Tabela 1). U nastavku opisujemo potvrdu nekoliko ovih pogotka na ekranu kao nove antivirusne faktore.

Jedan gen identificiran na našem ekranu, REX2, kodira 3′-5′ RNA egzonukleazu sačuvanu od bakterija do ljudi (35). I Rex2 i njegov humani homolog REXO2 lokalizirani su u mitohondrijima i sadrže EXOIII domen koji se široko nalazi u prokariotskim i eukariotskim proteinima, uključujući interferonom stimulirani antivirusni protein ISG20 (36, 37, 46–48). Otkrili smo da rex2∆ nuc1∆ dvostruko mutantni soj akumulira znatno povećane nivoe Gag u poređenju sa bilo jednim mutantom i pokazuje defekte rasta zavisne od LA, uključujući smrtnost na visokoj temperaturi (sl. 2 A i B, i SI dodatak, sl. S2). Rex2∆ single-mutant soj je pokazao blagi porast nivoa Gag, iako je ovaj efekat bio marginalan (slika 2B). Kako bismo rigorozno ispitali posljedice rex2∆ na broj kopija LA, kvantificirali smo LA RNK koristeći RT-qPCR. Ova mjerenja su potvrdila da rex2∆ nuc1∆ sojevi akumuliraju znatno povećane razine LA, iako su također otkrila da rex2∆ pojedinačni mutant nije akumulirao povećanu LA RNK (slika 2C). Ovi nalazi sugeriraju da je antivirusna uloga Rex2 očigledna samo u odsustvu funkcije NUC1. Zanimljivo je da su nuc1∆ ski3∆ rex2∆ i nuc1∆ xrn1∆ rex2∆ trostruki mutanti bili neodrživi u svim uslovima rasta, a ovi defekti su poništeni kod L-A0 sojeva (slika 2D). Ovi nalazi pokazuju ozbiljan patogeni potencijal LA mikovirusa i identificiraju novu antivirusnu ulogu za visoko konzerviranu mitohondrijalno lokaliziranu RNA egzonukleazu.

Slika 1. Slabljenje LA štiti kvasac od smrtonosne patogeneze. (A) Prikazan je gel ukupne RNA pripremljene od navedenih sojeva etidijum bromidom, sa 4,6 kb LA dsRNA trakom označenom strelicom. (B) Imunofluorescencija je korištena za vizualizaciju LA dsRNA (narandžasta) u ćelijama naznačenih genotipova. Ovi sojevi su izliječeni od slabo zastupljenog L-BC dsRNA virusa kako bi se eliminiralo pozadinsko bojenje (Detalji o metodi). DAPI bojenje DNK je plavo. (Skalirana traka, 1 μm.) (C) Prikazan je Western bloting nivoa proteina LA Gag i 3-fosfoglicerat kinaze (Pgk1) u naznačenim sojevima. Markeri molekularne težine su naznačeni na desnoj strani. (D) Spot test testovi rasta sojeva iz 1C su prikazani. Sojevi su uočeni na -Leu podlozi koja sadrži ili glukozu ili glicerol i uzgajani su na naznačenim temperaturama. (E) Mitohondrijski protein Nuc1 sarađuje sa citosolnim proteinima Xrn1 i SkiC kako bi regulisao nivo LA proteina i osigurao kondiciju ćelija.

Drugi gen identificiran na našem ekranu bio je MYG1, homolog kvasca gena 1 za proliferaciju humanog melanocita, 3′-5′ RNA egzonukleaze koja ima homologe u svim taksonima (34). Mutantni sojevi koji kombinuju myg1∆ i nuc1∆ pokazali su velika povećanja Gag proteina i LA RNA u poređenju sa pojedinačnim mutantima i pokazali ozbiljne defekte rasta zavisne od LA na visokoj temperaturi iu tečnoj kulturi (slika 2C i SI dodatak, slike S2, S4 A i C). Kao i kod rex2∆, myg1∆ pojedinačni mutantni soj pokazao je mali porast nivoa Gag i nije bilo promene u LA RNK (slika 2C i SI dodatak, slika S4C). Bili smo u mogućnosti da povratimo nuc1∆ ski3∆ myg1∆ trostruke mutante, iako su oni izuzetno sporo rasli na 30 stepena i akumulirali čak i više nivoe Gag (SI Dodatak, sl. S4 A i C). Ovi defekti rasta su također poništeni kod L-A0 sojeva (SI Dodatak, slika S4A). MYG1 stoga predstavlja novi antivirusni faktor, koji djeluje paralelno i sa NUC1 i sa SKI kompleksom.

Tabela 1. Identifikacija novih kandidata za antivirusne faktore korištenjem bioinformatičkog pristupa

Mutacije koje dovode do prekomjerne ekspresije ljudskog MYG1 povezane su s autoimunim poremećajem vitiligom, što sugerira da MYG1 može igrati određenu ulogu u ljudskom urođenom imunitetu (49, 50). Istražili smo ovu mogućnost koristeći plazmid koji eksprimira ljudski MYG1 pod kontrolom konstitutivnog promotora kvasca (34) i otkrili da je ljudski MYG1 spasio uslovni defekt rasta nuc1∆ myg1∆ mutanta (SI Dodatak, Slika S4D). Ovi nalazi pokazuju da se antivirusna funkcija kvasca MYG1 može postići ljudskim MYG1, što sugerira potencijalnu antivirusnu funkciju za MYG1 kod ljudi.

Slika 2. Novi antivirusni faktori su identifikovani korišćenjem patogeneze LA. (A) Prikazana je spot analiza sojeva defektnih u NUC1 i REX2. Sojevi su uočeni na SC mediju koji sadrži glukozu ili glicerol i uzgajani na naznačenoj temperaturi. (B) Western blotiranje nivoa proteina LA Gag i Pgk1 sojeva na slici 2A. Markeri molekularne težine su naznačeni na desnoj strani. (C) LA RNA je kvantificirana qPCR-om i normalizirana na endogenu ACT1 RNA. Prikazani su srednji nivo RNK i SD. n=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (nespareni Studentov t test). (D) Prikazana je spot analiza sojeva defektnih u tri paralelna antivirusna puta koji sadrže plazmid koji ekspresira NUC1. Sojevi su uočeni na -URA podlozi ili sintetički kompletnoj (SC) podlozi sa dodatkom 0,1% 5-fluoroorotske kiseline (5-FOA).

Druga kategorija gena identificirana korištenjem našeg bioinformatičkog ekrana bila je ekspresija gena. CDC73 i SPT3 kodiraju podjedinice konzerviranih kompleksa povezanih s hromatinom PAF1 i SAGA, respektivno. I cdc73∆ i spt3∆ uzrokovali su smrtnost zavisnu od LA u kombinaciji sa nuc1∆ ski3∆ (tabela 1). Budući da se pokazalo da SAGA (SptAda-Gcn5-acetiltransferaza) pojačava ekspresiju antivirusnih gena u gljivici kestenove gljivice Cryphonectria parasitica, dodatno smo istraživali ovaj kompleks (51). Dvostruko mutantni soj spt3∆ nuc1∆ akumulirao je povećane nivoe Gag i pokazao smrtonosnost zavisnu od LA na visokim temperaturama (SI dodatak, sl. S4 B i C). SAGA je veliki proteinski kompleks i potvrdili smo da delecije u nekoliko drugih gena koji kodiraju SAGA podjedinicu imaju iste fenotipske posljedice kao spt3∆ (SI Dodatak, Tabela S1 i S4C). Zajedno sa nalazima C. parasitica, ovi rezultati sugeriraju da kompleks SAGA kontrolira ekspresiju antivirusnih gena u različitim vrstama gljiva.

Skrining supresije visoke kopije identificira antivirusne faktore kvasca koji su također antivirusni kod ljudi.

Pošto je prekomerna ekspresija XRN1 potisnula defekte rasta soja nuc1∆ ski3∆, pretpostavili smo da bi prekomerna ekspresija drugih antivirusnih faktora proizvela sličan efekat, koji bi se mogao koristiti kao ekran za identifikaciju novih antivirusnih sistema. Koristili smo ekran za supresiju plazmida sa velikom količinom kopija da bismo otkrili gene čija je prekomerna ekspresija ublažila uslovnu smrtnost soja nuc1Δ ski3Δ (Detalji o metodi). Koristeći ovaj ekran, identifikovali smo SRO9, SLF1 i PAB1 kao supresore velike kopije nuc1∆ ski3∆, od kojih svi kodiraju proteine ​​koji se vezuju za ribosome (slika 3A) (52, 53). Sro9 i Slf1 su paralogni proteini sa domenom lupusa autoantigena (La), koji se široko nalaze u eukariotima. Značajno je da je njihov ljudski homolog, Larp1, nedavno identifikovan u pregledima za proteine ​​vezane za SARS-Cov-2 plus lanac ssRNA ili nukleokapsid (32, 54). Larp1 je bio glavni fokus u jednoj od ovih studija i pokazalo se da umanjuje replikaciju SARS-Cov-2 u ljudskim ćelijama, iako njegov mehanizam nije poznat (32). PAB1 kodira visoko konzervirani PolyA-vezujući protein, koji je uobičajena meta virusne inhibicije kod ljudi kroz različite mehanizme (33). Otkrili smo da prekomjerna ekspresija PAB1 ili SRO9 značajno smanjuje nivoe Gag u nuc1∆ ski3∆ mutantu, objašnjavajući njihove fenotipove spašavanja (slika 3B). Zanimljivo, iako je prekomjerna ekspresija SLF1 spasila defekt rasta nuc1∆ ski3∆ jednako dobro kao i SRO9, to nije dovelo do bilo kakvog smanjenja nivoa Gag (sl. 3 A i B). Ovi nalazi sugeriraju da PAB1 i SRO9 spašavaju ćelije suzbijanjem replikacije LA i da SLF1 štiti ćelije od patogenih posljedica povećane virusne replikacije.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Veliki broj LA kopija dovodi do citotoksičnog proteostatskog stresa.

Da bismo stekli uvid u divergentne mehanizme Sro9 i Slf1 antivirusnih aktivnosti, razmotrili smo koje bi mogle biti fiziološke posljedice patogeneze LA i kako bi SRO9/SLF1 mogao različito utjecati na njih. Primijetili smo prethodnu studiju u kojoj su delecije gena NUC1 ili SKI-kompleksa dovele do slabe indukcije GFP reporterskog gena kontroliranog Hsf1 (55), konzerviranog transkripcionog faktora koji osjeća proteostatski stres i aktivira odgovor ekspresije gena (56-58 ). Koristeći protočnu citometriju sa ovim reporterom (HSE-GFP), potvrdili smo ove rezultate i utvrdili da je dvostruki mutant nuc1∆ ski3∆ izazvao sinergističku i LA-ovisnu aktivaciju HSE-GFP (slika 3C i SI dodatak, slika S5). Pretpostavili smo da je masivna proizvodnja Gag uočena kod nuc1∆ ski3∆ mutanata objašnjava ovaj proteostatski odgovor na stres. U prilog tome, HSE-GFP aktivacija dvostrukog mutanta nuc1∆ ski3∆ je poništena prekomjernom ekspresijom PAB1 ili SRO9, odražavajući posljedice ovih gena na akumulaciju Gag (Slika 3 B i C). Značajno, prekomjerna ekspresija SRO9 paraloga SLF1 nije spriječila aktivaciju HSE-GFP. Evolucijska divergencija paralognih gena SRO9 i SLF1 je tako rezultirala različitim antivirusnim mehanizmima, pri čemu SRO9 potiskuje akumulaciju virusnih proteina i povezani proteostatski stres, a SLF1 naizgled štiti stanice od toksičnih posljedica virusom izazvanog proteostatskog stresa.

Slika 3. Prekomjerna ekspresija faktora kontrole translacije ublažava patogenezu LA. (A) Prikazani su Spot testovi rasta supresora visoke kopije SRO9, SLF1 i PAB1. Sojevi su uočeni na –LEU podlozi koji sadrže ili glukozu ili glicerol i uzgajani su na naznačenim temperaturama. (B) Western blotting za nivoe proteina LA Gag, Pgk1, Sro9 i Slf1 u sojevima iz 3A. Markeri molekularne težine su naznačeni na desnoj strani. (C) Protočna citometrija je korištena za mjerenje ekspresije HSE GFP u naznačenim sojevima (n {{10}}). Prvi i treći kvartil označeni su sivim okvirima. Srednji GFP intenzitet je označen crnim trakama unutar. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (nespareni Studentov t test). (D) Fluorescentna mikroskopija Hsp104-GFP u indiciranim sojevima. Ćelije su obojene DAPI za vizualizaciju jezgara. (Traka skale, 1 μm.) Procenat ćelija sa 3+ GFP fokusima je prikazan na desnoj strani. n=3. 75 do 140 ćelija je izbrojano za svaku repliku.

Proteostatski stres je često povezan s akumulacijom citotoksičnih proteinskih agregata koji se mogu vizualizirati korištenjem GFP-a fuzioniranog s proteinskom dezagregazom Hsp104, direktnom metom aktivacije transkripcije Hsf1 za koju je poznato da se ko-lokalizira s proteinskim agregatima (59, 60). Da bismo dalje istražili proteostatske defekte povezane s patogenezom LA, koristili smo fluorescentnu mikroskopiju za vizualizaciju Hsp104-GFP žarišta u različitim sojevima. Kao što se i očekivalo, ćelije divljeg tipa uzgajane na 30 stepeni rijetko su akumulirale uočljive Hsp{9}}GFP žarišta. Dok su pojedinačni mutanti nuc1∆ i ski3∆ ličili na divlji tip, zapanjujuće je da je dvostruki mutant nuc1∆ ski3∆ pokazao više od 25% ćelija sa tri ili više Hsp104-GFP žarišta (slika 3D). Kao i kod svih drugih fenotipova koje smo primetili za nuc1∆ ski3∆, akumulacija Hsp104-GFP fokusa zavisila je od prisustva LA (slika 3D). Ovi nalazi pokazuju da je visoko virusno opterećenje uzrokovano delecijom NUC1 i SKI3 dovelo do akumulacije Hsp104-GFP žarišta što ukazuje na agregaciju citotoksičnih proteina.

Budući da je patogeneza LA bila u korelaciji s proteostatskim defektima, pretpostavili smo da će Hsf1 funkcionirati kao antivirusni faktor. Brisanje HSF1 je smrtonosno, pa smo koristili alel osjetljiv na temperaturu hsf1-848 koji potiče iz ranije objavljene kolekcije sojeva (61). Alel hsf1-848 pokazao je odsustvo rasta na 39 stepeni, srednji fenotip rasta na 37 stepeni, i bez vidljivog defekta rasta na 35 stepeni (slika 4A). Spot test testovi su pokazali da su fenotipovi rasta hsf1-848 na 35 stepeni i 37 stepeni uveliko poboljšani kada se kombinuju sa nuc1∆ ili ski3∆ i da su ovi defekti rasta poništeni kod sojeva koji nemaju LA virus (slika 4A) . Kao što se i očekivalo, neodrživost svih mutantnih sojeva hsf1-848 opstala je u ćelijama koje su uzgajane na 39 stepeni bez obzira na prisustvo LA. Štaviše, koristeći tetradne disekcije, pokazali smo da su hsf1-848 nuc1∆ ski3∆ trostruki mutanti bili neodrživi na dozvoljenoj temperaturi ako su bili zaraženi LA, ali zdravi ako su izvedeni iz LA0 soja (SI Dodatak, sl. S6). Koristeći western blotting, otkrili smo da hsf1-848 nuc1∆ i hsf1-848 ski3∆ akumuliraju povećane količine LA Gag u poređenju sa pojedinačnim mutantima (slika 4B). Zajedno s našim biološkim studijama ćelija, ovi nalazi sugeriraju da Hsf1-regulisani proteostatski odgovor na stres funkcionira kao antivirusni sistem u kvascu, suprotstavljajući se patogenim posljedicama nenamjerne replikacije LA.

Kako je poznato da se proteostatski defekti pogoršavaju i dovode do citotoksičnosti na visokim temperaturama (59), jednostavan model pripisuje smrtonosne posljedice patogeneze LA na visokim temperaturama katastrofalnom proteostatskom stresu. Da bismo dalje testirali ovaj model, tretirali smo sojeve azetidin-2-karboksilnom kiselinom (AZC), analogom prolina koji je ugrađen u proteine ​​što dovodi do ortostatskog stresa (38). Ovi eksperimenti su pokazali da nuc1∆ ski3∆ pokazuje jaku osjetljivost na AZC na način koji ovisi o LA virusu (slika 4C i SI dodatak, slika S6). Nadalje, otkrili smo da je nuc1∆ ski3∆ pokazao osjetljivost na 5% etanola, stanje koje također uzrokuje proteostatske defekte, ali ne i na 0.5 M NaCl, što uzrokuje osmotski stres (SI Dodatak, Slika S6). Ovi nalazi upućuju na to da su smrtonosne posljedice patogeneze LA posebno uzrokovane nadmoćnim proteostatskim stresom.

Slika 4. Odgovor toplotnog šoka potiskuje patogenezu LA. (A) Prikazana je spot analiza sojeva defektnih u HSF1, NUC1 i SKI3 sa ili bez LA. Sojevi su uočeni na SC mediju koji sadrži glukozu i uzgajani na naznačenoj temperaturi. (B) Western blotting za nivoe proteina LA Gag i Pgk1 indiciranih sojeva. Markeri molekularne težine su naznačeni na desnoj strani. (C) Prikazana je spot analiza sojeva tretiranih proteotoksičnim analogom prolina, azetidin-2-karboksilnom kiselinom (AZC). Sojevi su primećeni na SC medijumu koji sadrži glukozu dopunjenu sa ili bez 0.1 mg/mL AZC i uzgajane na 30 stepeni.

Diskusija

Uprkos njegovoj sveprisutnoj prisutnosti u laboratorijskim sojevima, studije LA dsRNA virusa su ograničene zbog njegove naizgled benigne prirode. Ovdje pokazujemo da LA ima duboke posljedice za kvasac kada je njegova replikacija nekontrolisana i da različiti urođeni imuni sistemi održavaju replikaciju LA na podnošljivom nivou. Konkretno, pokazujemo da je kod sojeva koji nemaju paralelno djelujući NUC1 i SKI3 antivirusni geni, replikacija LA snažno regulirana, što dovodi do ortostatskog stresa i uvjetne letalnosti na visokim temperaturama. Koristeći ovo novo otkriće, koristili smo bioinformatičke i napredne genetske ekrane da identifikujemo nove gene kvasca koji funkcionišu da ograniče replikaciju LA ili štite ćelije od patogenih posledica neobuzdane replikacije LA. Kako ovi ekrani nisu bili zasićeni, genom kvasca vjerovatno kodira brojne druge antivirusne faktore. Mnoga pronicljiva istraživanja su sprovedena na kvascu proučavajući replikaciju egzogeno uvedenih virusnih RNK ​​iz drugih organizama i biće zanimljivo utvrditi da li antivirusni faktori LA deluju slično na ove virusne RNK (62, 63).

S obzirom na jasan rizik od infekcije LA, zbunjujuće je kako ona ipak opstaje unatoč sveprisutnoj antivirusnoj aktivnosti. Objašnjenje za ovaj paradoks može biti da LA pruža protutežu. Jedna od mogućih prednosti LA je da nekim sojevima omogućava održavanje satelitskih virusa koji kodiraju izlučene toksine koji ubijaju susjedne neinficirane stanice. Međutim, LA je prisutan u mnogim sojevima kojima nedostaju sateliti "ubice", tako da je ovo objašnjenje nedovoljno da se objasni perzistentnost LA infekcije. Stoga spekulišemo da LA može imati neku zagonetnu korist koja je protivteža njegovom štetnom potencijalu.

Naše otkriće Rex2 kao faktora atenuacije virusa proširuje arsenal poznatih mitohondrijskih antivirusnih faktora izvan Nuc1 i sugerira da su mitohondrije ključno antivirusno središte u kvascu. Zaista, mitohondrije imaju centralnu ulogu u odbrani od virusa kao programirani regulator ćelijske smrti i kao platforma za antivirusnu signalizaciju kod ljudi. Kako mitohondrijalne nukleaze oslabe virus koji se nalazi u citosolu kvasca? Jedna od mogućnosti je da se ovi enzimi, iako su ciljani na mitohondrije, ipak mogu akumulirati do niskih, ali dovoljnih nivoa u citosolu da direktno postignu slabljenje LA. U skladu s ovom hipotezom, ranije smo pokazali da se Nuc1 akumulira u citosolu mejotičkih stanica, iako ga naše metode nisu mogle otkriti u citosolu mitotičkih stanica (27). Druga hipoteza je da se neki aspekt ciklusa replikacije LA javlja u bliskoj vezi s mitohondrijama. Na primjer, LA transkripti se mogu povezati s mitohondrijama i eventualno proći kroz njih, izlažući ih Nuc1 i/ili Rex2. Naši rezultati ističu potencijalnu opštu važnost mitohondrija za virusni urođeni imunitet kod eukariota i pozicioniraju kvasac-LA sistem kao moćan model za dalja istraživanja ove teme.

Antivirusni SKI kompleks povezan s prevođenjem ribozoma i naša identifikacija Pab1, Sro9 i Slf1 kao supresora visoke kopije LA patogeneze dalje otkrivaju translacijski ribosom kao ključno središte antivirusne aktivnosti kvasca. Nalaz da PAB1 (polyA vezujući protein) potiskuje LA je iznenađujući s obzirom na odsustvo polyA repova u LA transkriptima, što sugerira da Pab1 ne djeluje direktno na LA. Prethodni nalazi su pokazali da se LA transkripti takmiče sa poliA+ mRNA kvasca za hvatanje 60S ribosomskih podjedinica kako bi se formirale translatorne 80S komplekse (64). Jedan model koji objašnjava naše nalaze je da Pab1 poboljšava translaciju mRNA koje sadrže poliA rep, što onda iscrpljuje dostupnost 60S podjedinica za LA transkripte za translaciju. Uloge Sro9 i Slf1 u prijevodu su manje shvaćene, ali se njihove funkcije mogu na sličan način odnositi na konkurenciju LA transkripata za 60S podjedinice. Važno je da su homolozi Pab1 i Sro9/Slf1 uključeni u ljudsku virusnu odbranu i dalja istraživanja ovih gena u kvascu će baciti svjetlo na antivirusne mehanizme sačuvane od kvasca do ljudi.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

Identificirali smo antivirusnu ulogu za očuvani transkripcijski faktor HSF1 zajedno sa LA-indukovanim proteostatskim stresnim odgovorom koji uključuje akumulaciju Hsp104-GFP žarišta, HSF1-aktiviranog markera citotoksičnih proteinskih agregata. Ovi rezultati podržavaju model u kojem je patogeneza LA uzrokovana proteotoksičnim stresom. Također smo otkrili antivirusnu funkciju za SAGA kompleks, za koji se pokazalo da djeluje kao koaktivator indukcije ciljnog gena Hsf1 nakon toplotnog šoka (65, 66). Ova zapažanja sugeriraju da visoki nivoi LA dovode do SAGA-zavisne aktivacije Hsf1 ciljnih gena koji zatim izvršavaju antivirusnu funkciju, osvjetljavajući potencijalni antivirusni program ekspresije gena u kvascu koji pupa. Ovaj model daje mnoga testirana predviđanja koja mogu biti relevantna za virusnu patogenezu u drugim organizmima. Zaista, humani HSF1 takođe kontroliše ekspresiju proteolitičkih regulatornih faktora. Dok su antivirusne funkcije humanog HSF1 opisane, nejasno je kakvu ulogu u tome igra ortostatski odgovor na stres (39). Naši nalazi osvjetljavaju moćan sistem za razaznavanje antivirusne funkcije Hsf1 s obzirom na njegovu ulogu u aktivaciji proteostatskog odgovora na stres.

reference

1. T. Nakayashiki, CP Kurtzman, HK Edskes, RB Wickner, prioni kvasca [URE3] i [PSI+] su bolesti. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 102, 10575–10580 (2005).

2. RB Wickner, T. Fujimura, R. Esteban, Virusi i prioni Saccharomyces cerevisiae. Adv. Virus Res. 86, 1–36 (2013).

3. T. Fujimura, R. Esteban, Mehanizam hvatanja kapice kod LA dvolančanog RNA virusa kvasca. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 108, 17667–17671 (2011).

4. JD Dinman, T. Icho, RB Wickner, A -1 ribosomski pomak okvira u dvolančanom RNA virusu kvasca formira gag-pol fuzioni protein. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 88, 174–178 (1991).

5. A. Bernheim et al., Prokariotski viperini proizvode različite antivirusne molekule. Nature 589, 120–124 (2021).

6. A. Bernheim, R. Sorek, Pan-imuni sistem bakterija: Antivirusna odbrana kao resurs zajednice. Nat. Rev. Microbiol. 18, 113–119 (2020).

7. AG Johnson et al., Bakterijski umovi otkrivaju drevni mehanizam ćelijske smrti. Science 375, 221–225 (2022).

8. BR Morehouse et al., STING ciklički dinukleotidni sensing nastao u bakterijama. Nature 586, 429–433 (2020).

9. G. Ofir et al., Antivirusna aktivnost bakterijskih TIR domena putem imunoloških signalnih molekula. Nature 600, 116–120 (2021).

10. KM Slavik i saradnici, cGAS-slični receptori osjećaju RNK i kontroliraju 3'2'-cGAMP signalizaciju u Drosophila. Nature 597, 109–113 (2021).

11. AT Whiteley et al., Bakterijski enzimi slični cGAS-u sintetiziraju različite nukleotidne signale. Nature 567, 194–199 (2019).

12. HM Burgess, I. Mohr, Cellular 5'-3' mRNA egzonukleaza Xrn1 kontroliše dvolančanu akumulaciju RNK i antivirusne odgovore. Cell Host Microbe. 17, 332–344 (2015).

13. SC Eckard et al., SKIV2L RNA egzosom ograničava aktivaciju receptora sličnih RIG-I. Nat. Immunol. 15, 839–845 (2014).

14. M. Miyashita, H. Oshiumi, M. Matsumoto, T. Seya, DDX60, DEXD/H box helikaza, je novi antivirusni faktor koji promoviše signalizaciju posredovanu receptorom nalik RIG-I. Mol. Cell Biol. 31, 3802–3819 (2011).

15. CS Ng, DM Kasumba, T. Fujita, H. Luo, Prostorno-vremenska karakterizacija antivirusne aktivnosti XRN1-DCP1/2 agregacije protiv citoplazmatskih RNA virusa kako bi se spriječila smrt ćelije. Cell Death Differ 27, 2363–2382 (2020).

16. RE Rigby, J. Rehwinkel, RNK degradacija u antivirusnom imunitetu i autoimunosti. Trends Immunol. 36, 179–188 (2015).

17. F. Shiromoto et al., IL-1beta/ATF3-posredovana indukcija ekspresije Ski2 pojačava degradaciju virusa hepatitisa B x mRNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 503, 1854–1860 (2018).

18. JT Brown, X. Bai, AW Johnson, Antivirusni proteini kvasca Ski2p, Ski3p i Ski8p postoje kao kompleks in vivo. RNA 6, 449–457 (2000).

19. DC Masison et al., Zavaravanje sistema degradacije kap-mRNA pomoću dvolančanog RNA virusa i nadzor poli(A)-mRNA od strane antivirusnog sistema kvasca. Mol. Cell Biol. 15, 2763–2771 (1995).

20. C. Schmidt et al., Krio-EM struktura kompleksa ribosom-Ski2-Ski3-Ski8 helikaza. Science 354, 1431–1433 (2016).

21. AM Searfoss, RB Wickner, 3' poly(A) je neophodan za prijevod. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 97, 9133–9137 (2000).

22. EA Toh, P. Guerry, RB Wickner, Chromosomal superkiller mutants of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 136, 1002–1007 (1978).

23. A. Zinovjev, RK Ayupov, IS Abaeva, CUT Hellen, TV Pestova, Ekstrakcija mRNA iz zaustavljenih ribozoma u Ski kompleksu. Mol. Cell 77, 1340–1349 e1346 (2020).

24. SG Ball, C. Tirtiaux, RB Wickner, Genetska kontrola broja kopija La i L-(Bc) Dsrna u sistemima ubica SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Genetics 107, 199–217 (1984).

25. R. Esteban, L. Vega, T. Fujimura, 20S RNA narnavirus prkosi antivirusnoj aktivnosti SKI1/XRN1 u Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 283, 25812–25820 (2008).

26. PA Rowley, B. Ho, S. Bushong, A. Johnson, SL Sawyer, XRN1 je faktor restrikcije virusa specifičan za vrstu u kvascima. PLoS Patog. 12, e1005890 (2016).

27. J. Gao et al., Mejotička atenuacija virusa kroz apoptotički put predaka. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 116, 16454–16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Endonukleaza G je apoptotička Dnaza kada se oslobodi iz mitohondrija. Nature 412, 95–99 (2001).

29. BJ Thomson, Virusi i apoptoza. Int. J. Exp. Pathol. 82, 65–76 (2001).

30. MD Eastwood, SW Cheung, KY Lee, J. Moffat, MD Meneghini, Razvojno programirano nuklearno uništavanje tokom gametogeneze kvasca. Dev. Cell 23, 35–44 (2012).

31. MD Eastwood, MD Meneghini, Razvojna koordinacija diferencijacije gameta sa programiranom ćelijskom smrću u sporulirajućem kvascu. Eukariotska ćelija 14, 858–867 (2015).

32. N. Schmidt et al., Interaktom SARS-CoV-2 RNA-proteina u inficiranim ljudskim ćelijama. Nat. Microbiol. 6, 339–353 (2021).

33. RW Smith, NK Grey, Poli(A)-vezujući protein (PABP): Uobičajena virusna meta. Biochem. J. 426, 1–12 (2010).

34. R. Grover et al., Myg1 egzonukleaza spaja nuklearne i mitohondrijalne translacijske programe kroz obradu RNK. Nukleinske kiseline Res. 47, 5852–5866 (2019).

35. EV Koonin, Očuvani drevni domen pridružuje se rastućoj superfamiliji 3'-5' egzonukleaza. Curr. Biol. 7, R604–606 (1997).

36. M. Szewczyk et al., Human REXO2 kontroliše kratke mitohondrijalne RNK koje nastaju mtRNA procesiranjem i mašinama za raspad kako bi se spriječilo nakupljanje dvolančane RNK. Nukleinske kiseline Res. 48, 5572–5590 (2020).

37. Y. Zuo, MP Deutscher, Superfamilije egzoribonukleaza: Strukturna analiza i filogenetička distribucija. Nukleinske kiseline Res. 29, 1017–1026 (2001).

38. EW Trotter, L. Berenfeld, SA Krause, GA Petsko, JV Grey, Pogrešno savijanje proteina i povećanje temperature uzrokuju zaustavljanje G1 preko zajedničkog mehanizma koji ovisi o faktoru toplotnog šoka u Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 98, 7313–7318 (2001).

39. A. Reyes, AJ Navarro, B. Diethelm-Varela, AM Kalergis, PA Gonzalez, Postoji li uloga HSF1 u virusnim infekcijama? FEBS Open Bio 12, 1112–1124 (2022).

40. F. Weber, V. Wagner, SB Rasmussen, R. Hartmann, SR Paludan, Dvolančanu RNK proizvode RNA virusi sa pozitivnim lancima i DNK virusi, ali ne u količinama koje se mogu detektirati kod negativnih RNA virusa. J. Virol. 80, 5059–5064 (2006).

41. S. Welsch et al., Sastav i trodimenzionalna arhitektura mjesta replikacije i okupljanja virusa denga groznice. Cell Host Microbe. 5, 365–375 (2009).

42. I. Fernandez de Castro, R. Tenorio, C. Risco, Fabrike za sklapanje virusa u svijetu lipida. Curr. Opin. Virol. 18, 20–26 (2016).

43. YX Liu, CL Dieckmann, Prekomjerna proizvodnja virusnih čestica kvasca od strane sojeva s nedostatkom mitohondrijalne nukleaze. Mol. Cell Biol. 9, 3323–3331 (1989).

44. AW Johnson, RD Kolodner, Sintetička smrtnost sep1 (xrn1) ski2 i sep1 (xrn1) ski3 mutanata Saccharomyces cerevisiae je nezavisna od virusa ubice i sugerira opštu ulogu ovih gena u kontroli translacije. Mol. Cell Biol. 15, 2719–2727 (1995).

45. C. Stark et al., BioGRID: Opće spremište za skupove podataka o interakciji. Nukleinske kiseline Res. 34, D535–539 (2006).

46. ​​L. Espert et al., ISG20, nova interferonom indukovana RNKaza specifična za jednolančanu RNK, definira alternativni antivirusni put protiv RNA genomskih virusa. J. Biol. Chem. 278, 16151–16158 (2003).

47. T. Hanekamp, ​​PE Thorsness, YNT20, zaobilazni supresor yme1 yme2, kodira pretpostavljenu 3'-5' egzonukleazu lokaliziranu u mitohondrijima Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet 34, 438–448 (1999).

48. A. van Hoof, P. Lennertz, R. Parker, Tri konzervirana člana RNase D porodice imaju jedinstvene i preklapajuće funkcije u obradi 5S, 5.8S, U4, U5, RNase MRP i RNase P RNA u kvascu . EMBO J. 19, 1357–1365 (2000).

49. M. Dwivedi, NC Laddha, R. Begum, Korelacija povećane ekspresije MYG1 i polimorfizma njegovog promotora s progresijom bolesti i većom osjetljivošću kod pacijenata s vitiligom. J. Dermatol. Sci. 71, 195–202 (2013).

50. K. Kingo et al., MYG1, novi gen vezan za melanocite, ima povećanu ekspresiju kod vitiliga. J. Dermatol. Sci. 44, 119–122 (2006).

51. IB Andika, A. Jamal, H. Kondo, N. Suzuki, SAGA kompleks posreduje u regulaciji transkripcije naviše utišavanja antivirusne RNK. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 114, E3499–E3506 (2017).

52. SG Sobel, SL Wolin, Dva proteina kvasca koji sadrže La motiv su proteini koji se vezuju za RNK koji se povezuju sa poliribozomima. Mol. Biol. Cell 10, 3849–3862 (1999).

53. A. Proweller, JS Butler, Ribosomska asocijacija poli(A)-vezujućeg proteina u poli(A)-deficijentnom Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271, 10859–10865 (1996).

54. DE Gordon i saradnici, Mapa interakcije proteina SARS-CoV-2 otkriva ciljeve za ponovno korištenje lijekova. Nature 583, 459–468 (2020).

55. O. Brandman et al., Ribozomski vezan kompleks za kontrolu kvaliteta pokreće degradaciju peptida u nastajanju i signalizira stres translacije. Cell 151, 1042–1054 (2012).

56. J. Anckar, L. Sistonen, Regulacija funkcije HSF1 u odgovoru na toplotni stres: Implikacije u starenju i bolesti. Annu. Rev. Biochem. 80, 1089–1115 (2011).

57. J. Li, J. Labbadia, RI Morimoto, Rethinking HSF1 u stresu, razvoju i zdravlju organizma. Trends Cell Biol. 27, 895–905 (2017).

58. PK Sorger, HR Pelham, Prečišćavanje i karakterizacija proteina koji vezuje element toplotnog šoka iz kvasca. EMBO J. 6, 3035–3041 (1987).

59. EJ Solis et al., Definiranje esencijalne funkcije kvasca Hsf1 otkriva kompaktni transkripcijski program za održavanje eukariotske proteostaze. Mol. Cell 63, 60–71 (2016).

60. JR Glover, S. Lindquist, Hsp104, Hsp70 i Hsp40: Novi chaperone sistem koji spašava prethodno agregirane proteine. Cell 94, 73–82 (1998).

61. Z. Li et al., Sistematsko istraživanje esencijalne funkcije gena kvasca s mutantima osjetljivim na temperaturu. Nat. Biotechnol. 29, 361–367 (2011).

62. RY Zhao, Kvasac za istraživanje virusa. Microb. Cell 4, 311–330 (2017).

63. T. Panavas, E. Serviene, J. Brasher, PD Nagy, Pregled genoma kvasca otkriva različite skupove gena domaćina koji utiču na replikaciju RNK virusa. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 102, 7326–7331 (2005).

64. Y. Ohtake, RB Wickner, Propagacija virusa kvasca kritično ovisi o koncentraciji slobodne 60S ribosomske podjedinice. Mol. Cell Biol. 15, 2772–2781 (1995).

65. SB Kremer, DS Gross, SAGA i Rpd3 kompleksi za modifikaciju hromatina dinamički regulišu strukturu i ekspresiju gena toplotnog šoka. J. Biol. Chem. 284, 32914–32931 (2009).

66. MD Leach et al., Hsf1 i Hsp90 orkestriraju temperaturno zavisnu globalnu transkripcionu remodelaciju i arhitekturu hromatina u Candida albicans. Nat. Commun. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron, JH Park, JM Giafaglione, O. Brandman, Agregacija CAT repova blokira njihovu degradaciju i uzrokuje proteotoksičnost kod S. cerevisiae. PLoS One 15, e0227841 (2020).

68. L. Magtanong et al., Mreže genetičkih interakcija supresije doziranja poboljšavaju funkcionalne dijagrame ožičenja ćelije. Nat. Biotechnol. 29, 505–511 (2011).

69. V. Bilanchone et al., Ty3 retrotranspozon otima parenjem tijela za obradu RNK kvasca da inficira nove genome. PLoS Genet. 11, e1005528 (2015).

70. L. Ruan et al., Citosolna proteostaza kroz uvoz pogrešno savijenih proteina u mitohondrije. Nature 543, 443–446 (2017).