Izraziti receptori slični Toll-u Ekspresija gena i glialni odgovor u različitim regijama mozga prirodnog scrapie-a, dio 3

Istraživali smo moguće korelacije između neuropatoloških obilježja prionske bolesti i ekspresije TLR gena u četiri različita područja mozga ovaca koje su prirodno zaražene scrapieom. U sva četiri područja mozga uočili smo značajne razlike u depoziciji PrPSc, spongiozi, astrogliozi i mikrogliozi kod prirodno zaraženih u odnosu na kontrolnu ovcu.

Prionska bolest, također poznata kao bolest hrama, bolest jedenja voska, itd., je akutna virusna infekcija uzrokovana prionima. Bolest se uglavnom prenosi konzumiranjem nekuvane hrane koja sadrži prione. Jednom zaražen prionima, može izazvati upalu mozga i oštećenje nervnog sistema, a mogu se javiti i simptomi kao što su glavobolja, povraćanje i groznica.

Međutim, u takvoj situaciji ne možemo izgubiti povjerenje u svoje pamćenje zbog postojanja prionske bolesti. Većina zaraženih se može oporaviti i vratiti pamćenje nakon liječenja.

Naravno, iz preventivne perspektive, možemo pokušati da jedemo više kuvane hrane kako bismo izbegli infekciju prionima. Istovremeno, ako osjetite bilo kakve simptome, trebali biste što prije posjetiti ljekara kako biste spriječili pogoršanje bolesti.

U svakodnevnom životu možemo isprobati neke jednostavne treninge pamćenja, kao što su čitanje, sastavljanje lista, organiziranje događaja i informacija, itd. kako bismo poboljšali svoje pamćenje. Ovi treninzi ne zahtijevaju puno vremena i energije, ali su veoma važni za održavanje zdravog mozga i efikasne memorijske funkcije.

Ukratko, kada se susrećemo sa bolestima kao što je prionska bolest, treba da se suočimo sa njom pozitivno, potražiti stručnu medicinsku pomoć i preventivne mere, i obratiti pažnju na svakodnevne vežbe pamćenja kako bismo obezbedili svoje fizičko zdravlje i efikasan rad. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer može regulisati i ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta, koji su veoma važni za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche također može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljnu ishranu i energiju, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati načine za poboljšanje funkcije mozga

Ove razlike su bile najočitije u medulla oblongata, najviše caudalarea. Nasuprot tome, najblaže lezije uočene su u frontalnom korteksu, u većini rostralarnih područja. Ovaj sekvencijalni obrazac je u skladu sa putem prionske neuroinvazije i diseminacije kroz CNS, počevši od ulaznih mesta u kičmenu moždinu i obeksa i konačno dostižući frontalni korteks [1,5,51].

Neočekivano, s obzirom na njihovu anatomsku blizinu, uočili smo drastičan pad taloženja i vakuolizacije PrPSc, te značajan pad astroglioze, pri kretanju iz talamusa u hipokampus, ne prateći postupnu kaudo-rostralnu progresiju patologije.

Specifična mikrogliamorfologija poznata kao štapićasta mikroglija uočena je u blizini piramidalnih ćelijskih neurona na CA3, ali je odsutna u svim drugim proučavanim neuroanatomskim regijama.

Prema našim saznanjima, ovaj mikroglijalni profil do danas nije bio povezan s neuroinflamacijom izazvanom prionima, iako je nedavna studija izvijestila o prisutnosti mikroglije u obliku štapa u malom mozgu pacijenata sa CJD [52].

Iako je malo proučavana od prvih opisa iz 1900-ih, mikroglija štapića je nedavno prijavljena kod neuroloških poremećaja kao što su epilepsija, demencija Lewyjevih tijela, Huntingtonova bolest i AD, posebno u umjereno oštećenim područjima moždane kore i hipokampusa [40,41,53]. Fenotipska ekspresija i funkcije mikroglije štapića još nisu jasni.

Međutim, činjenica da se ova morfološka karakteristika tipično poklapa s prisustvom neuronskih elemenata koji su oštećeni ili podložni oštećenjima sugerira neuroprotektivnu ulogu [42,54,55].

Smatra se da mikroglija štapića nije povezana s teškim lezijama, jer se u ovim stanjima očekuje napredovanje ka ameboidnoj morfologiji [56]. Prisustvo rodmikroglije u hipokampusu ovaca zaraženih scrapie-om, ali ne i u drugim regijama mozga, može ukazivati ​​na neuroprotektivno okruženje, u dobrom skladu s ograničenim gubitkom neurona uočenim u ovoj oblasti.

Naša analiza ekspresije TLR otkriva direktnu korelaciju između težine lezije i prekomjerne ekspresije TLR gena koja se poklapa s gore spomenutom kaudo-rostralnom progresijom prionske neuropatologije.

Suprotno tome, TLR4 je bio na sličan način pretjerano izražen u svim područjima, bez obzira na težinu lezije. Prekomjerna ekspresija TLR4 u područjima blažeg neuronskog oštećenja (tj. hipokampus i frontalni korteks) može odražavati aneuropotektivnu ulogu, kao što je prethodno opisano za fagocitne ćelije kao što su makrofagi i mikroglija [23,57]. Povećana regulacija TLR7 je ranije prijavljena na mišjim modelima prionitis i ljudski pacijenti [22,26,31].

Zamijetili smo samo povećanje TLR7 u produženoj moždini, najoštećenijem području u kojem su otkriveni najviši nivoi spongioze i taloženja PrPSc.

Smrt neurona putem apoptoze je ranije bila povezana sa stimulacijom TLR7 [58,59], a njena prekomjerna ekspresija u produženoj moždini može biti povezana s ovim mehanizmom [60]. Iako uloga TLR1 u neurodegenerativnim bolestima još nije jasna, uključenost TLR2 u mikroglijalnu aktivaciju se sve više pokazuje kod amiotrofične lateralne skleroze, MS i AD [61,62].

Iako uloga TLR2 u prionskim bolestima nije u potpunosti shvaćena, predloženi su korisni efekti: vrijeme preživljavanja je smanjeno kod miševa koji ne eksprimiraju TLR2 nakon intracerebralne inokulacije scrapie [22].

Prekomjerna ekspresija TLR2 i MyD88 također može ukazivati ​​na fenotip proinflamatorne mikroglije, što bi moglo objasniti povećanje TNF- i IL-6 koje smo primijetili u talamusu [8,63].

Zanimljivo je da su eksperimenti sa EOC 13.31 ćelijama, besmrtnom linijom miševa nalik na mikrogliju, pokazali disregulaciju inflamatornog odgovora kao odgovor na aktivaciju TLR2 i sugerirali vezu između ekspresije TLR2 i akumulacije mikroglije u stanju koje nije optimalno za fagocitozu [26] .

Stoga, prekomjerna ekspresija TLR2 u produženoj moždini i talamusu, najoštećenijim područjima u kojima su također otkriveni prekomjerni nivoi fagocitne mikroglije, sugerira da disfunkcionalni klirens PrPSc može dovesti do kontinuirane akumulacije PrPSc i oštećenja neurona [9,17].

Naši nalazi u hipokampusu ovaca inficiranih scrapie otkrivaju suprotan obrazac u usporedbi s drugim analiziranim područjima mozga, sa smanjenom regulacijom TLR1, TLR2 i MyD88 i bez promjena citokina.

Ovo može ukazivati ​​da mikroglija različito reaguje u hipokampusu; zaista, pokazalo se da nedostatak TLR2 u primarnim mikroglijalnim ćelijskim kulturama, od neonatalnih miševa (0–3 dana) i stimuliranih neurotoksičnim peptidom PrP106-126, pomjera mikroglijalnu aktivaciju s neurotoksičnog na neuroprotektivni fenotip [63 ].

Međutim, relevantnost peptida PrP106-126 u prionskoj patologiji je dovedena u pitanje [64]. CD36 je drugačiji tip receptora za prepoznavanje uzoraka, sposoban da prepozna endogeno izvedene ligande kao što su peptidi koji formiraju amiloid, koji je uspostavio ulogu u endocitnom preuzimanju tih komponenti [65,66]. Ovaj receptor je povezan sa proinflamatornim mikroglijalnim statusom [67].

In vitro, stimulacija BV-2 ćelija, vrste besmrtnih mikroglijalnih ćelija, sa PrP106-126 rezultira regulacijom CD36, povećanjem proinflamatornih citokina i produkcije iNOS i NO [68,69].

Dodatno, prepoznavanje -amiloidnog peptida od strane CD36 pokreće sklapanje novog heterotrimernog kompleksa CD36-TLR4-TLR6 koji aktivira urođeni imuni odgovor [70,71].

U našoj studiji, sve regije su pokazale značajnu regulaciju CD36 osim hipokampusa. Povećana regulacija CD36, TLR4 i TLR6 u najoštećenijim područjima, produženoj moždini i obeksu, sugerira učešće ove trijade u pokretanju proinflamatornog mikroglijalnog statusa u odgovoru na prionsku infekciju.

Suprotno tome, odsustvo prekomjerne ekspresije CD36 i TLR6 u hipokampusu sugerira da ovaj heterotrimer nije formiran, što opet ukazuje na anuroprotektivno okruženje u ovoj regiji mozga.

Ostaje da se objasni zašto mikroglija različito reaguje u ovoj regiji mozga. Dok bi tropizam ćelija specifičan za prionski soj mogao odrediti obrazac mikroglioze i astroglioze, nedavna otkrića sugeriraju da su obje reakcije uglavnom pod utjecajem regije mozga [18,72].

Ni mikroglija ni astroglija ne reaguju jednolično u CNS-u, a ovaj odgovor specifičan za regiju mogao bi dovesti do selektivne ranjivosti nekih regija mozga u prionskim bolestima [16,18].

S tim u vezi, pretpostavljeno je da je upalni odgovor mikroglije na prionsku infekciju reguliran sijalilacijom PrPSc [14,73–75] i da je sijailacija PrPSc zavisna od regije mozga [18]. Konkretno, viši nivo sialilacije PrPSc nalazi se u hipokampusu i korteksu nego u talamusu i moždanom deblu, što sugerira potencijalnu ulogu u selektivnoj ranjivosti ovih moždanih regija [18,73,75].

Visok nivo PrPSc sijalicije u hipokampusu može biti povezan sa usporenom replikacijom priona, što dovodi do karakteristične prion-indukovane mikroglijalne aktivacije u ovoj regiji, što je u skladu sa smanjenom osjetljivošću ove regije koju impliciraju naši nalazi.

Zanimljivo je da prethodni nalazi ukazuju na to da hipokampus može biti zaštićen od prionske neurotoksičnosti u prirodnoj infekciji CJD [76,77], a detaljne neuropatološke studije slučajeva CJD su prijavile blaže lezije u hipokampusu nego u drugim regijama mozga [76].

Konkretno, čini se da je arhikorteks, koji prvenstveno obuhvata hipokampus, relativno pošteđen u poređenju sa drugim kortikalnim regionima u CJD [77]. Ovo blago zahvaćanje hipokampusa opisano u prirodnom CJD je u skladu sa sadašnjim nalazima kod ovaca koje su prirodno zaražene scrapie.

Zanimljivo je da se ova djelomična zaštita od najmanje dvije prirodne prionske bolesti javlja u hipokampusu, koji je filogenetski najstarija regija moždane kore i sastoji se od najosnovnijeg tipa kortikalnog tkiva.

Biće potrebne daljnje studije kako bi se istražila relevantnost ove korelacije. Ukratko, naši rezultati otkrivaju posebno blagu neuropatologiju u hipokampusu ovaca zaraženih prirodnim scrapieom, koju karakteriziraju niži nivoi spongioze, PrPScdepozicije i astroglioze od očekivanog s obzirom na kaudalni do -rostralno širenje scrapielezija.

Štaviše, prisutnost u hipokampusu ekskluzivne mikroglijalne morfologije, štapićaste mikroglije, koja može igrati neuroprotektivnu ulogu [54], zajedno s posebnim profilom ekspresije receptora za prepoznavanje uzoraka (TLR geni i CD36), dodatno razlikuje ovu regiju mozga od drugih neuroanatomskih. regiona kod ovaca zaraženih prirodnim grebezom.

Ovi nalazi ukazuju na stepen neuroprotekcije protiv prirodne prionske infekcije u hipokampusu koji zaslužuje dalje istraživanje. Neurodegenerativne bolesti uzrokovane pogrešnim savijanjem proteina uključuju začarani krug upale koji se sastoji od akumulacije pogrešno savijenog proteina, glijalne aktivacije i oslobađanja glijalnih inflamatornih medijatora, koji pogoršavaju taloženje proteina i neuroinflamacije.

Prekid ovog začaranog kruga ciljanjem aktivacije mikroglije upotrebom specifičnih TLR inhibitora u specifičnoj fazi bolesti može predstavljati obećavajući pristup za ograničavanje dalje neuroinflamacije. Naši nalazi ističu smanjenje regulacije TLR2 kao potencijalnu metu za takav pristup, jer to može izazvati promjenu mikroglije sa neurotoksičnog na aneuropotektivni fenotip [63].

Konačno, iako je napravljen veliki napredak u karakterizaciji raznolikosti glijalfenotipova korištenjem mišjih modela neurodegenerativnih bolesti, pitanje je da li mišji modeli vjerno odražavaju ključne aspekte prionskih bolesti je predmet rasprave [78,79].

Naši rezultati u tg338 transgenskom modelu reproducirali su uobičajene patološke znakove prionske infekcije, uključujući izraženu depoziciju PrPSc, neuropil spongiozu, astrogliozu i mikrogliozu.

Međutim, inficirani miševi su pokazali značajnu prekomjernu ekspresiju TLR1 i TLR2 i sklonost ka prekomjernoj ekspresiji TLR7. Dok je regulacija ovih gena prethodno opisana na drugim modelima miševa zaraženih scrapieom [22,26], ovaj obrazac je u suprotnosti s našim nalazima u mozgu ovaca. Zanimljivo je da u mozgu miša nismo primijetili nikakve promjene u ekspresiji TLR4, gena za koji su uočene najveće promjene u ekspresiji u uzorcima ovaca.

Ovi konfliktni nalazi mogu biti posljedica različitih puteva infekcije i/ili nivoa ekspresije prionskih proteina kod tg338 miševa [80,81]. Ipak, naši rezultati u konačnici pokazuju da intracerebralnokulacija skrapija kod prevelikih tg338 miševa ne reproducira imuni odgovor uočen kod prirodne infekcije scrapie.

4. Materijali i metode

4.1. Ovce zaražene scrapie i kontrolisane ovce

Dvadeset i jedna ženka Rasa Aragonesa ovca (u dobi od 2-6 godina) bila je uključena u ovu studiju. Svi su genotipizirani za PRNP polimorfizme, kao što je ranije objavljeno [82], i utvrđeno je da pokazuju ARQ/ARQ genotip. Kontrolne životinje (n=8) su odabrane iz jata u kojem nisu prijavljeni slučajevi scrapia.

Životinje zaražene scrapieom (n=13) dobijene su iz jata zaraženih grebezom i dijagnosticirane su imunohistohemijskom (IHC) biopsijom rektalne sluznice. Infekcija je potvrđena postmortalnom imunodetekcijom PrPSc u obeksu prema objavljenim kriterijumima [83].

Životinje su eutanazirane intravenskim predoziranjem barbiturata i iskrvavljenjem.

U vrijeme eutanazije, sve ovce zaražene scrapieom pokazale su kliničke znakove različite težine: neke životinje su pokazivale početne znakove kao što su svrbež leđa i bokova nakon digitalne stimulacije i blagog smanjenja tjelesne kondicije, dok su druge pokazivale napredne kliničke znakove kao što je spontano češanje korijen repa, lumbalni dio i udovi, neurološki znakovi uključujući ataksiju i drhtanje glave, škrgutanje zubima, gubitak vune i intenzivan gubitak težine [84].

4.2. Infekcija Tg338 miša

Za procjenu ekspresije TLR gena u mozgu mišjeg modela scrapie, deset sedmica starih tg338 miševa (n=8) (prekomjerna ekspresija ovčjeg VRQ/VRQ PrPC 8- na 10-prestruktuju [ 85]) inokulirani su mozgom od prirodne ovce Rasa Aragonesa inficirane grebežom žrtvovane u kliničkoj fazi.

Miševi su inokulirani sa 20 uL inokuluma scrapie (razrijeđenog 2% w/v u PBS-u) u desnu cerebralnu hemisferu pod anestezijom izofluranom. Intracerebralne injekcije su izvedene pomoću šprica od 50 µL i igle od 25G. Nakon inokulacije, miševima je davana supkutana injekcija buprenorfina (0,3 mg/kg) radi induceanalgezije.

Kao kontrole, tg338 miševi (n=8) su inokulirani sa homogenatom mozga ovce negativne scrapie, slijedeći istu proceduru koja je gore opisana. Miševi su praćeni zbog razvoja kliničkih znakova i eutanazirani su dislokacijom grlića materice kada su se pojavili terminalni znaci bolesti kao što su teška ataksija i nemogućnost hranjenja.

Miševi inficirani inokulumom pozitivnim na scrapie pokazali su srednje vrijeme preživljavanja od 187 ± 26 dpi.

4.3. Zbirka tkiva

Uzorci iz CNS-a su sakupljeni i podijeljeni sagitalno na dvije polovine; jedan je fiksiran u 10% neutralno puferiranom formalinu za histopatologiju i imunohistokemijsku analizu, a drugi je direktno zamrznut i održavan na -80 ◦C za analizu proteina ili stabiliziran u otopini RNAlaterTM (InvitrogenTM, Waltham, MA, SAD) za ekstrakciju RNK, a zatim zamrznut i pohranjen na −80 ◦C.

4.4. PRNP sekvenciranje

DNK je ekstrahovan iz uzoraka krvi Speedtools kompletom za ekstrakciju DNK tkiva (Biotools, Madrid, Španija) prema uputstvima proizvođača. PCR amplifikacija i sekvenciranje su urađeni kako je prethodno opisano [82].

4.5. Imunohistohemija

Tkiva fiksirana na formalin obrađena su prema standardnim histopatološkim procedurama. Presjeci tkiva su umotani u parafin, izrezani na 4 µm debele dijelove i obojeni hematoksilin-eozinom (HE) za procjenu vakuolacije i neuropilne spongioze.

IHC za detekciju PrPSc je izveden korištenjem mišjeg monoklonskog primarnog antitijela L42 kod ovaca (1:500 razrjeđenje na sobnoj temperaturi 30 min) (R-Biopharm, Darmstadt, Njemačka) i zečjeg poliklonskog antitijela R486 kod miševa (1: 8000 razblaženja, preko noći na 4 ◦C) (R. Jackman, neobjavljeno) kao što je prethodno opisano [86,87].

Sekcije su također podvrgnute konvencionalnom imunološkom bojenju za astrocitni marker glijalnog fibrilnog kiselog proteina (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Danska) i mikroglija marker ionizirani kalcijum-vezujući adapter molekul 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond, Richmond). , VA, SAD), prema objavljenim protokolima [88]. Sve histološke i IHC procjene su izvršila dva veterinarska patologa slijepa za kliničke podatke.

Procjene intenziteta spongioze i PrPSc bojenja su polukvantitativno rađene i prilagođene prema kriterijima opisanim u prethodnim studijama: vakuolacija neuropila i perikarije ocijenjena je od 0 (odsutan) do 5 (veoma brojan i konfluentan) [51], PrPSc signal je kvantificiran na osnovu stepena imunološkog obojenja od 0 (bez označavanja) do 5 (intenzivno uniformno obilježavanje) kao što je prethodno objavljeno [89], a stepen GFAP i Iba1 imunoobilježavanja je ocijenjen na skali u rasponu od {{ 8}} do 5 (0=slabo bojenje; 5=značajno imunoobilježavanje u cijelom regionu) kako je opisano [88]. Procijenjena su četiri područja mozga: frontalni korteks (Fc), talamus (Th), formacija hipokampusa (Hc) i produžena moždina (Mo), a svako područje je globalno analizirano za bodovanje i grafički predstavljeno kao srednja vrijednost ± standardna greška.

4.6. Western Blot

100 mg moždanog tkiva svakog područja mozga (Fc, Th, Hc i Mo) od 13 ovaca zaraženih scrapie-om, 8 sa uznapredovalim kliničkim znakovima i 5 s početnim kliničkim znacima, homogenizirano je u 1 mL pufera za lizu.

Hemiencefaloni 8 inficiranih i 8 kontrolnih miševa su homogenizirani na 10% (w/v) u puferu za lizu. Uzorci tkiva su homogenizirane epruvete za mljevenje (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) koristeći TeSeEPrecess 48 TM homogenizator (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), a koncentracija proteina je mjerena korištenjem PierceTM BCA Protein Assay kita (ThermoScientificTM, Waltham, MA, SAD) prema uputama proizvođača.

Za PrPres analizu, jednake količine proteina iz homogenata tkiva su inkubirane 10 minuta na 37 ◦C sa rastvorom proteinaze K, kao što je prethodno opisano [90].

Dobijeni uzorci su podvrgnuti elektroforezi u 12% CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gelu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i prebačeni na PVDF membrane koje su blokirane 1 h sa 2% nemasnog suhog mlijeka u TBST (Tris- puferirani fiziološki rastvor sa 0.1% Tween20).

Za imunoblotiranje, membrane su inkubirane preko noći na 4 ◦C sa primarnim antitijelom Sha31 (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Francuska) u koncentraciji od 1 µg/mL, nakon čega je uslijedila 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) s peroksidazom iz hrena- konjugirano anti-mišje IgG sekundarno antitijelo (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD).

Imunoreaktivnost je otkrivena upotrebom hemiluminiscentnog supstrata ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Njemačka). Ekspresija TLR4 proteina je analizirana iz homogenata tkiva pomiješanih sa 2×Laemmli puferom za uzorke (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) prema uputama proizvođača .

Četrdeset mikrograma ukupnog proteina je napunjeno po jažici, stavljeno u 7,5%CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i prebačeno na PVDF membrane, koje su zatim blokirane 2 h sa 4% goveđeg serumskog albumina. (BSA) (Merck, Darmstadt, Njemačka) u TBST na RT. Membrane su inkubirane preko noći na 4 ◦C sa zečjim poliklonskim anti-TLR4 antitelom (Novus Biological, Minneapolis, MN, SAD) u koncentraciji od 0.5 µg/mL, a zatim isprane i inkubirane sa kozjim antizečjim IgG ( H + L) HRP sekundarno antitijelo (ThermoScientificTM, Waltham, MA, SAD) u 1:20,000 1 h na sobnoj temperaturi.

Mrlje su vizualizirane kako je gore opisano. Zatim su membrane skinute sa RestoreTM Western Blot Stripping puferom (ThermoScientificTM, Waltham, MA, SAD) tokom 15 minuta na 37 ◦C, isprane i ponovo blokirane.

Zatim su membrane inkubirane preko noći na 4 ◦C sa primarnim mišjim monoklonskim antitijelom na aktin (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, SAD) u 1:1000, isprane i inkubirane sa anti-mišjim m-IgGkBP-HRP sekundarnim antitijelom (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD) za 1 h. Nakon pranja, mrlje su razvijene kako je gore opisano.

Denzitometrije su rađene softverom ImageJ, a vrijednosti su normalizirane korištenjem -aktina. Normalizirane vrijednosti su predstavljene sa GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, USA).

Statističke analize za poređenje zaražene i kontrolne grupe obavljene su Studentovim t-testom, a jednakost varijansi je određena Leveneovim testom koristeći SPSS softver (SPSS Statistics for Windows, verzija 17.0, Chicago, IL, SAD). Razlike između grupa su smatrane statistički značajnim na * p<0.05.

4.7. Ekstrakcija RNK, sinteza cDNK i ekspresija gena

Ukupna RNK ovaca ekstrahirana je iz 90 mg uzoraka tkiva iz frontalnog korteksa, talamusa, hipokampusa i duguljaste moždine. Mišji mozgovi su podijeljeni na srednjoj liniji i iz njih je ekstrahirana ukupna RNK<90 mg obtained from the thalamic area. 

Tkiva su homogenizovana korišćenjem TeSeEPrecess 48TM homogenizatora (Bio-Rad) sa RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemačka) u kombinaciji sa TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, SAD) da bi se uklonila moguća kontaminacija genomske DNK. Koncentracija RNK određena je spektrofotometrijski sa NanoDrop spektrofotometrom (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), a za svaki uzorak analizirani su omjeri 260/280 i 260/230 kako bi se provjerila čistoća uzorka.

Jedan mikrogram komplementarne DNK (cDNA) sintetiziran je pomoću qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA,USA) prema uputama proizvođača. Pored toga, efikasnost tretmana DNazom je procenjena u RT negativnim uzorcima. Nakon reverzne transkripcije, ista serija razrijeđene cDNK je podvrgnuta qPCR-u kako bi se pojačali TLR.

Dva najčešće korištena gena za održavanje (HK) odabrana su da normaliziraju ekspresiju ciljnih gena: gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) i aktin-beta (ACT) [91]. Stabilnost ovog HK gena je potvrđena u našim eksperimentalnim uslovima. Ekspresija glasničke RNK (mRNA) određena je qPCR za 1 do 10 ovčijih TLR gena, 1 do 9 mišjih TLR gena i MyD88 gena za obje vrste.

Dva proinflamatorna (TNF- i IL-6) i dva antiinflamatorna (IL-10 i TGF-) citokina su također proučavana u talamusu i hipokampusu ovaca. Prajmer sekvence i efikasnost su prethodno objavljeni ili su dizajnirani pomoću alata Primer3Plus [92] (tablica 2).

Proverili smo efikasnost svakog gena koji generiše standardnu ​​krivu tako što smo pojačali 1:2 serijska razblaženja kontrolne cDNK i zatim proveravali linearnost između koncentracije početne šablone i vrednosti praga ciklusa (Ct). Svi geni su pokazali koeficijent korelacije između 0.9 i 0.99, sa vrijednošću nagiba standardnih krivulja u rasponu od −3.2 do −3.5 i qPCR efikasnošću od 90–110%.

qPCR reakcije su izvedene pomoću Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR sistema, 96-dobro sa univerzalnim uslovima amplifikacije: početna aktivacija i korak denaturacije cDNK od 10 minuta na 95 ◦C, nakon čega slijedi 40 ciklusa od 3 s na 95 ◦C i 30 sat 60 ◦C.

Da bismo identificirali prisustvo nespecifičnih PCR amplikona ili visoke razine prajmerdimera, izvršili smo protokol krivulje disocijacije nakon svake qPCR reakcije. Svaki uzorak je analiziran u tri primjerka u ukupnom volumenu reakcije od 10 µL, koji se sastoji od 15 ng cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mixa (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD), i potrebne količine naprijed i nazad prajmeri (tabela 2).

Voda bez nukleaza je dodana do konačnog volumena od 10 µL. Nivoi ekspresije gena određivani su komparativnom Ct metodom. Rezultati su predstavljeni kao fold-change i razlike u ekspresiji gena u odnosu na srednji nivo kontrolne grupe skalirane na 1.

4.8. Analiza podataka i statistika

Svi prikupljeni kvantitativni podaci testirani su na normalnost Shapiro-Wilk Wtestom. Histološke i imunohistohemijske razlike između inficirane i kontrolne grupe procenjene su korišćenjem Studentovog t-testa ili Mann-Whitney U testa u zavisnosti od parametarske ili neparametarske distribucije podataka.

Statističke razlike između četiri različita regiona mozga kod ovaca zaraženih scrapieom određene su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) praćenom Bonferronijevim post hoc testom ili Kruskal-Wallisovim testom, ovisno o parametarskoj ili neparametarskoj distribuciji podataka. Statistička analiza qPCR podataka obavljena je iz srednjih vrijednosti ∆Ct za svaki gen.

Za statističko poređenje inficiranih i kontrolnih grupa, rađen je Studentov t-test ili Mann-Whitney U test u zavisnosti od normalne distribucije svakog gena, a jednakost varijansi određena je Levenovim testom. Razlike u ekspresiji su smatrane značajnim na p < 0.05.

Za označavanje p-vrijednosti na slikama korištene su sljedeće oznake: * p < 0.05; ** p Manje ili jednako 0.01; # p < 0.1. Za statističke analize korišten je softver SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0,Chicago, IL, USA). Grafovi su generisani pomoću GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, SAD) i podaci prikazani na slikama predstavljaju srednju vrijednost i standardnu ​​grešku srednje vrijednosti (srednja vrijednost ± SEM).

5. Zaključci

Prema našim saznanjima, ova studija je prva koja opisuje nivoe ekspresije TLRgena u različitim regionima mozga ovaca zaraženih prirodnim skrapijem i prevelikih miševa tg338 eksperimentalno zaraženih grejbom.

Naše istraživanje jasno pokazuje da su TLR, a posebno TLR4 kod ovaca i TLR1 i TLR2 kod miševa, uključeni u patogenezu scrapie-a. Osim toga, za razliku od svih drugih proučavanih regija, karakterističan profil ekspresije TLR gena, zajedno sa jedinstvenom mikroglijalnom morfologijom i blaga neuropatologija uočena u hipokampusu, sugerira imunološki odgovor specifičan za regiju mozga kod infekcije prirodnog scrapie.

Međutim, bit će potrebne daljnje studije kako bi se okarakterizirala ekspresija TLR-a u mikroglijama, astroglijama i neuronima u infekciji scrapie kako bi se razumio precizan doprinos svakog tipa ćelije neuroinflamaciji. Nadalje, tek treba da se utvrdi da li je aktivacija TLR direktan odgovor na toksičnost priona ili se javlja kao sekundarno u odnosu na druge upalne mehanizme.

TLR-i predstavljaju obećavajuću metu za terapijske pristupe prionskim bolestima, i stoga će biti potrebno bolje razumijevanje neuroinflamatornih odgovora reguliranih TLR-om kako bi se osigurao dalji napredak u ovoj oblasti.

Dodatni materijali: Sljedeće je dostupno na Internetu na adresihttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Doprinosi autora: Konceptualizacija, istraživanje i prikupljanje podataka, MCG i LMC; pisanje-izrada originalnog nacrta, MG-M., MCG i LMC; eksperimentalna metodologija, MG-M.; pisanje-recenzija i uređivanje, MG-M., MCG, LMC i AO; in vivo metodologija, MB; prikupljanje sredstava, RB i JJB; molekularna metodologija, BS-P.; supervizija, MCG i JJB Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

Finansiranje: Ovo istraživanje je finansirao "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Vlada Aragona) kroz projekat "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Sve procedure koje se odnose na životinje su u skladu sa smjernicama sadržanim u španjolskom zakonu o zaštiti životinja RD53/2013 i Direktivi Evropske unije 2010/63 o zaštiti životinja koje se koriste u eksperimentalne svrhe. Protokol je odobrio Komitet za etiku eksperimenata na životinjama Univerziteta u Saragosi (broj dozvole: PI38/159 oktobar 2015. i PI19/14 11 april 2014).

Izjava o informiranoj saglasnosti: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Podaci predstavljeni u ovoj studiji dostupni su u tekstu članka, slikama i dodatnom materijalu.

Priznanja: Zahvaljujemo se Olivieru Andreolettiju (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) i Vincentu Beringueu (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) za ljubazno pružanje tg338 miševa korištenih za ove eksperimente.

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Finanseri nisu imali nikakvu ulogu u kreiranju studije; u prikupljanju, analizi ili interpretaciji podataka; u pisanju rukopisa ili u odluci o objavljivanju rezultata. Slike i brojke u ovom rukopisu su originalni podaci.

Reference

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Saradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Rana akumulacija PrP(Sc) u limfoidnim i nervnim tkivima povezanih sa crijevima osjetljivih ovaca iz stada Romanov s prirodnim scrapie. J. Gen. Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prionske bolesti i BSE kriza. Science 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Rano širenje scrapie iz gastrointestinalnog trakta u centralni nervni sistem uključuje autonomna vlakna splanhničnog i vagusnog nerava.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions i njihovo smrtonosno putovanje do mozga. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WE; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc širenje uzoraka u mozgu ovaca povezanih s različitim tipovima priona. Vet. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Dokazi za rani upalni odgovor u centralnom nervnom sistemu miševa sa scrapie. Neuroscience 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner,S.; Wadsworth, JD; et al. Prionska neuropatologija prati akumulaciju alternativnih izoforma prionskih proteina nakon što je infektivni titar dostigao vrhunac. Nat. Commun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Definiranje mikroglije koja reagira na vremenski tok kronične neurodegeneracije. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia u prionskim bolestima. J. Clin. Investig. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Uloga mikroglije u prionskim bolestima: paradigma funkcionalne raznolikosti. Front. Aging Neurosci. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogenost u distribuciji i morfologiji mikroglije u normalnom mozgu odraslih miševa. Neuroscience 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Heterogenost u morfologiji i fiziologiji astrocita. Brain Res. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com