Izraziti receptori slični Toll-u Ekspresija gena i glialni odgovor u različitim regijama mozga prirodnog scrapie-a, 1. dio

sažetak:

Prionske bolesti su kronične i fatalne neurodegenerativne bolesti koje karakteriziraju akumulacija prionskog proteina specifičnog za bolest (PrPSc), spongiformne promjene, gubitak neurona i glioza.

Prionska bolest, također poznata kao bolest hrama, bolest jedenja voska, itd., je akutna virusna infekcija uzrokovana prionima. Bolest se uglavnom prenosi konzumiranjem nekuvane hrane koja sadrži prione. Jednom zaražen prionima, može izazvati upalu mozga i oštećenje nervnog sistema, a mogu se javiti i simptomi kao što su glavobolja, povraćanje i groznica.

Međutim, u takvoj situaciji ne možemo izgubiti povjerenje u svoje pamćenje zbog postojanja prionske bolesti. Većina zaraženih se može oporaviti i vratiti pamćenje nakon liječenja.

Naravno, iz preventivne perspektive, možemo pokušati da jedemo više kuvane hrane kako bismo izbegli infekciju prionima. Istovremeno, ako osjetite bilo kakve simptome, trebali biste što prije posjetiti ljekara kako biste spriječili pogoršanje bolesti.

U svakodnevnom životu možemo isprobati neke jednostavne treninge pamćenja, kao što su čitanje, sastavljanje lista, organiziranje događaja i informacija, itd. kako bismo poboljšali svoje pamćenje. Ovi treninzi ne zahtijevaju puno vremena i energije, ali su veoma važni za održavanje zdravog mozga i efikasne memorijske funkcije.

Ukratko, kada se susrećemo sa bolestima kao što je prionska bolest, trebamo se pozitivno suočiti s njima, potražiti stručnu medicinsku pomoć i preventivne mjere, te obratiti pažnju na svakodnevne vježbe pamćenja kako bismo osigurali svoje fizičko zdravlje i efikasan rad. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche tradicionalni kineski ljekoviti materijal sa brojnim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelovanje Cistanchea dolazi od različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite znati načine za poboljšanje funkcije mozga

Sve veći broj dokaza pokazuje da je neuroinflamatorni odgovor ključna komponenta prionbolesti i doprinosi neurodegeneraciji.

Toll-like receptori (TLR) su predloženi kao važni posrednici urođenih imunoloških odgovora koji se pokreću u centralnom nervnom sistemu kod drugih ljudskih neurodegenerativnih bolesti, uključujući Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest i amiotrofičnu lateralnu sklerozu.

Međutim, malo se zna o ulozi TLR-a u prionskim bolestima, a njihova uključenost u neuropatologiju prirodnog grebeža nije proučavana. Procijenili smo ekspresiju gena ovčijih TLR-a u četiri anatomski različita regiona mozga kod ovaca zaraženih prirodnim scrapie i procijenili moguće korelacije između ekspresije gena i patoloških znakova prionske bolesti.

Uočili smo značajne promjene u ekspresiji TLR kod ovaca zaraženih scrapie-om koje su u korelaciji sa stupnjem spongioze, taloženjem PrPSc i gliozom u svakoj od proučavanih regija.

Zanimljivo, TLR4 je bio jedini gen koji je pojačano reguliran u svim regijama, bez obzira na težinu neuropatologije. U hipokampusu smo uočili blažu neuropatologiju povezanu sa jasnim profilom ekspresije TLR gena i prisustvom osebujne mikroglijalne morfologije, nazvane rodmikroglia, koja je ovdje opisana po prvi put u mozgu ovaca zaraženih scrapie-om.

Podudaranje ovih karakteristika ukazuje na djelomičnu neuroprotekciju hipokampusa. Konačno, poređenje nalaza kod prirodno zaraženih ovaca u odnosu na model prevelikog miša (tg338 miševi) otkrilo je različite obrasce ekspresije TLRgena.

Ključne riječi: prion; scrapie; receptori slični naplati; neuroinflamacija; mikroglija; astrociti.

1. Uvod

Transmisivne spongiformne encefalopatije (TSE) ili prionske bolesti su grupa ofatalnih neurodegenerativnih poremećaja koji uključuju Creutzfeldt-Jakobovu bolest (CJD) kod ljudi, scrapie u ovaca i koza, goveđu spongiformnu encefalopatiju (BSE) u goveda i hroničnu bolest iscrpljenosti kod cereva. CWD).

Ove TSE karakteriše transformacija prionskog proteina kodiranog domaćina (PrPC) u infektivnu izoformu, PrPSc, koja se prvenstveno akumulira u nervnom sistemu i limforetikularnom sistemu (LRS), i inflamatornom imunom reakcijom u centralnom nervnom sistemu (CNS) [1 ,2]. Prionske bolesti, kao što je scrapie, mogu se prirodno dobiti oralnim izlaganjem PrPSc.

Nakon što pređe crijevnu barijeru i prođe primarnu replikaciju u limfoidnim tkivima, PrPSc stiže do CNS-a putem procesa poznatog kao neuroinvazija. Infekcija se širi od mjesta u gastrointestinalnom traktu preko vagusnih i splanhničkih nerava do moždanog debla i kičmene moždine [3,4].

Kada stigne do CNS-a, PrPSc se širi od kaudalnih torostralnih regija, odnosno preko rostralnog moždanog debla do malog mozga, diencefalona i frontalnog korteksa [5]. Anatomski stereotipna akumulacija PrPSc sugerira da je njegovo širenje posredovano neuronskom vezom i/ili selektivnom ranjivosti različitih regija mozga.

Faktori domaćina kao što su genotip PrPSc, rasa i starost u trenutku infekcije doprinose veličini taloženja PrPSc i distribuciji spongiformnih lezija.

Međutim, molekularna osnova interakcija domaćin-prion koje određuju selektivno ciljanje PrPSc na specifične regije mozga ostaje nepoznata i predstavlja jedan od najintrigantnijih aspekata fenomena prionskog soja.

Prvobitno se pretpostavljalo da imunološki sistem ne reaguje na PrPSc zbog prirodne tolerancije, ali studije tokom vremena otkrile su brzu aktivaciju i proliferaciju mikroglije i astrocita čak i prije pojave kliničkih znakova i neuronske degeneracije [6–8].

Čini se da ova rana aktivacija i proliferacija mikroglije i astrocita igra središnju ulogu u patogenezi prionskih poremećaja, iako molekularni mehanizmi uključeni u njihovu aktivaciju i precizna uloga reaktivnih astrocita i mikroglije u patogenezi bolesti ostaju nejasni [9,10].

Štaviše, široko je prihvaćeno da mikroglijalna i astroglijalna distribucija i fenotip variraju među regijama mozga i vrstama [11–14], pripisujući intrinzične karakteristike svakom regionu koje utiču na ranjivost na neurodegeneraciju [10,15,16].

Ovaj fenomen je posebno očigledan u pretkliničkoj fazi, tokom koje i mikroglija i astroglija reaguju na infekciju prionima na način specifičan za region.

Međutim, kako bolest napreduje, češći neuroinflamatorni odgovor počinje da prevladava, razrjeđujući većinu regionalnih karakteristika [17,18]. U posljednjih nekoliko godina prijavljena je uloga Toll-like receptora (TLR) u mikroglijalnoj i astroglijalnoj reaktivnosti. kod nekoliko neurodegenerativnih poremećaja, naglašavajući njihov utjecaj na progresiju ovih bolesti [19–21].

Međutim, podaci o ulozi TLRsin prionskih bolesti su oskudni. Djelomično zaštitna uloga TLR-a opisana je u prionskoj patologiji. Konkretno, objavljeno je da gubitak TLR2 [22] i TLR4 [23] ubrzava patogenezu priona, dok stimulacija TLR9 usporava napredovanje bolesti kod mišjih modela [24,25].

Do danas je većina studija TLR-a u prionskim bolestima izvedena in vitro ili korištenjem mišjih modela [8,22,26–29], a njihova uloga kod prirodno zaraženih životinja i ljudi ostaje neizvjesna. Prema našim saznanjima, jedno istraživanje je izvedeno na novorođenim jaganjcima oralno inokuliranim scrapie-om (tj. korištenjem prirodnog, ali ne prirodno inficiranog domaćina) i prijavilo je prekomjernu ekspresiju TLR2 i TLR4 u krvi u kliničkim stadijumima bolesti [30].

Dvije studije su prijavile izmijenjenu ekspresiju TLR gena kod ljudi sa sporadičnim CJD(sCJD) [31,32]. Disregulacija gena uključenih u imunološki odgovor uključivala je prekomjernu ekspresiju mRNA TLR4 i TLR7 u malom mozgu i frontalnom korteksu pacijenata s sCJD MM1 i TLR7 u malom mozgu pacijenata sa sCJD VV2.

Štaviše, Areskeviciuteet al. [32] uključio je TLR4 u prvih 40 uzvodnih regulatora za koje se predviđa da će pokazati diferencijalnu ekspresiju u sCJD u odnosu na kontrolne uzorke mozga. Ispitali smo kako prirodna infekcija scrapie utiče na nivoe transkripcije ovineTLR-a i nekih citokina u četiri regije mozga s različitim stupnjevima osjetljivosti na prione, na osnovu prethodni rezultati [18].

Kvantitativna PCR (qPCR) analiza otkrila je promjene u ekspresiji ingena u grupi zaraženoj scrapie u odnosu na kontrolnu grupu i odgovor koji ovisi o regiji mozga.

Zanimljivo je da je hipokampus pokazao najizrazitiji profil lezija, sa specifičnom reaktivnom morfologijom mikroglije i uzorkom transkripcije TLR. S obzirom na nedostatak eksperimentalnih podataka o ekspresiji TLR gena kod miševa koji prekomjerno eksprimiraju PrP ovaca, također smo izveli eksperimente koristeći tg338 miševe intracerebralno inokulirane sa scrapieom.

Naši rezultati otkrivaju neke sličnosti s prethodnim studijama na miševima divljeg tipa, ali značajne razlike u pogledu nalaza kod prirodnog grebeža.

2. Rezultati

2.1. Scrapie neuropatologija prirodno zaraženih ovaca

Prvo smo potvrdili neuropatologiju scrapie kod prirodno zaraženih ovaca uključenih u ovu studiju, kao što je prethodno opisano [33–36]. Spongioza, taloženje PrPSc i reaktivna glija ispitivani su u četiri regije mozga inficiranih i kontrolnih ovaca: medullaoblongata (Mo), talamus (Th), hipokampus (Hc) i frontalni korteks (Fc).

Sve prirodno zaražene životinje bile su u kliničkoj fazi bolesti. Međutim, klinički status, zasnovan na učestalosti i ozbiljnosti kliničkih znakova, varirao je među ovcama, u rasponu od početnih do uznapredovalih kliničkih faza (Tablica 1).

Slika 1 prikazuje reprezentativne mikrofotografije za procjenu vakuolacije i imunološkog bojenja za PrPSc, GFAP i Iba1, snimljene u svakoj od odabranih regija kod inficiranih i kontrolnih životinja.

Kao što se očekivalo, nisu otkriveni dokazi vakuolacije ili taloženja PrPSc u dijelovima tkiva kontrolne ovce. Nasuprot tome, kod ovaca zaraženih scrapie-om, sva neuroanatomska područja su pokazala spongiozu, taloženje PrPSc i reaktivnu gliju (p < 0.05).

Intenzitet vakuolacije, taloženja PrPSc i glioze smanjio se od oblongate moždine do frontalnog korteksa. Zanimljivo, uprkos blizini talamusa i hipokampusa, uočene su značajne razlike u rezultatima za sve patološke markere.

Najveći stepen spongioze uočen je u produženoj moždini i tetalamusu, za razliku od vrlo raštrkane vakuolacije pronađene u hipokampusu i frontalnom korteksu.

Intraneuronska vakuolacija je bila obilna u jezgrima produžene moždine, kao što je prikazano u dorzalnom motornom jezgru vagusnog nerva, dok je neuropilna spongioza dominirala u talamusu i frontalnom korteksu (Slika 1A). Vrlo malo vakuola je pronađeno u neuropilu hipokampusa.

Slika 1. Reprezentativna neuropatologija i imunohistohemijska procjena spongioze, PrPScdepozicije, mikroglioze i astroglioze u CNS-u kontrolnih i scrapie-inficiranih ovaca u oblongati meduli (Mo), talamusu (Th), hipokampusu (Hc) i frontalnom korteksu (Fc) .

Grafikoni prikazuju polukvantitativne vrijednosti procjene za svaki analizirani parametar. (A) Bojenje hematoksilin-eozinom pokazalo je promjene spongioze u CNS-u kod ovaca zaraženih scrapie-om i izostanak spongioze kod ovaca s kontrolom. (B) Detekcija PrPSc sa L42 antitijelom u regijama mozga zaraženih scrapie-om.

U kontrolnoj grupi otkriveno je noimuno označavanje. (C) Imunološko bojenje ioniziranim kalcijum-vezujućim molekulom adaptera-1(Iba1) pokazalo je povećanu mikroglijalnu reaktivnost kod ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolne ovce.

(D) Glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) imunobojenje pokazuje povećanu reaktivnu astrogliozu kod ovaca inficiranih scrapie u poređenju sa kontrolnim ovcama. (E) Statistička poređenja spongioze, PrPScdepozicije, Iba1 i GFAP intenziteta između regija mozga.

Rezultati se kreću od 0 (negativno) do 5 (maksimalni intenzitet). Značajne razlike u spongiozi, PrPSc, Iba1 i GFAP utvrđene su korištenjem Studentovog t-testa ili Mann-Whitney U testa za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno.

Statističke razlike između područja mozga određene su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) ili Kruskal-Wallisovim testom za normalno i nenormalno raspoređene podatke, respektivno. * p < 0.05, ** p < 0.01. Skala bar=200 µm.

Sve ovce zaražene scrapie-om pokazale su široko rasprostranjenu akumulaciju PrPSc u četiri analizirana regiona CNS-a, osim tri ovce koje su pokazale početne kliničke znakove i bile su PrPSc-negativne prema imunohistohemijskim (IHC) i Western blot (WB) nalazima u frontalnom korteksu (Tabela 1).

Intenzitet PrPSc imunološkog bojenja otkrio je kaudalno do rostralno smanjenje, slično onom uočenom za spongiozu, s maksimalnim intenzitetom u oblongati i talamusu, dvije regije s najvećim stepenom vakuolacije, a nižim intenzitetom u hipokampusu i frontalnom korteksu (Slika 1B).

U hipokampusu, PrPScimmunostojanje je pokazalo žarišnu i neujednačenu distribuciju, za razliku od homogenog, raspršenog točkastog obrasca uočenog u frontalnim dijelovima korteksa.

Uočili smo četiri glavna morfološka obrasca depozicije PrPSc, kao što je prethodno opisano [36]: dva intracelularna uzorka, koji su uključivali intraneuronske i intraglijalne (uključujući intraastrocitne i intramikroglijalne) depozicije, i dva obrasca na ćelijskoj membrani/ekstracelularni, koji su uključivali neuropilne ćelije povezane i povezano taloženje (Slika S1).

Intraneuronski obrasci i obrasci povezani s neuropilom su dominirali u svim područjima mozga. Zanimljivo je da su duboki i glijalni obrasci drastično smanjeni ili čak izostali u frontalnom korteksu i hipokampusu u poređenju sa produženom moždinom i talamusom. Paralelno sa IHC, analizirali smo prisustvo priona otpornih na proteazu (PrPres) od strane WB.

Uzorci mozga ovaca zaraženih scrapieom pokazali su klasični tropojasni PrPres uzorak povezan s klasičnim scrapieom, s molekularnom masom tada neglikoziliranog fragmenta od približno 19 kDa (Slika 2).

Uprkos određenom stepenu varijabilnosti, PrPres signal se povećavao sa ozbiljnošću kliničkih znakova u svim regijama mozga i bio je obilniji u kaudalnim područjima mozga.

WB za PrPres bio je pozitivan u produženoj moždini i talamusu kod svih ovaca zaraženih scrapieom. Nasuprot tome, uzorci hipokampusa i frontalnog korteksa nisu bili pozitivni na PrPres kod svih zaraženih životinja.

Iako je IHC bio pozitivan na PrPres u hipokampusu svih zaraženih ovaca, 4/13 je bilo negativno od strane Svjetske banke. U frontalnom korteksu, 3/13 ovaca je bilo PrPres-negativno prema IHC-u, a 4/13 je bilo PrPres-negativno prema WB.

Pored vakuolacije i taloženja PrPSc, aktivacija glijalnih ćelija je opširno dokumentovana kao rani događaj u patogenezi bolesti pogrešnog savijanja proteina.

Da bi se okarakterizirala reaktivna glija, sva područja mozga su podvrgnuta IHC-u korištenjem anti-GFAP antitijela za otkrivanje astrocita i anti-Iba1 antitijela za otkrivanje mikroglije.

Iba1 imunobojenje, koje otkriva i mirnu i aktiviranu mikrogliju [37], značajno je povećano u svim regijama mozga kod ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolne ovce i otkrilo je značajne razlike u mikroglijalnoj morfologiji među regijama mozga kod inficiranih životinja (Slika 1C).

Aktivacijski status mikroglijalnih ćelija je definisan na osnovu tri glavne morfologije: razgranate, hipertrofične i ameboidne [38,39]. Mikroglijalne ćelije u "nadzornom" ili relativno neaktivnom stanju imaju razgranatu morfologiju, koju karakterizira malo ćelijsko tijelo s mnogo finih procesa, kao što je uočeno kod naših kontrolnih životinja.

Aktivno stanje karakterizira ameboidna morfologija, koja se obično povezuje sa fagocitnim stanjem [38] i sastoji se od sferičnih, nerazgranatih ćelijskih tijela. Hipertrofičnu morfologiju karakterizira mikroglija s većim staničnim tijelom i kraćim, debelim procesima, a povezana je s proizvodnjom i oslobađanjem inflamatornih medijatora [40,41].

Ameboidna morfologija bila je najzastupljenija u produženoj moždini kod ovaca zaraženih scrapieom. U talamusu je uočena ameboidna morfologija, ali nije prevladavala: niz velikih i tankih procesa pomiješanih s rijetkim, debelim procesima koji proizlaze iz izduženih ćelijskih tijela, što odgovara hipertrofičnoj mikrogiji.

Morfologija proliferativne mikroglije u frontalnom korteksu i hipokampusu značajno se razlikovala od morfologije produžene moždine i talamusa. U oba regiona preovladavala je hipertrofirana mikroglija, a ameboidna mikroglija je praktično izostala.

Zanimljivo je da je Cornu Ammonis 3 (CA3) regija hipokampusa pokazala najveće razlike u morfologiji mikroglije, pokazujući mikroglijalni uzorak poznat kao mikroglija štapića koji nije primijećen ni u jednoj drugoj regiji mozga.

Ove izrazite razlike uočene u procjeni hipokampusa potaknule su nas da izvršimo detaljno ispitivanje podpolja CA1, 3, 4 i stratum lakunoze-molekularnog (SLM).

Slika 2. Western blot detekcija PrPres-a u CNS-u kontrolne i prirodne ovce zaražene scrapie-om. Ispunjene su jednake količine proteina za adekvatno poređenje, a imunoblotovi su rađeni korištenjem SHA31 monoklonskog antitijela za analizu uzoraka iz (A) produžene moždine, (B ) talamus, (C) hipokampus i (D) frontalni korteks ovaca zaraženih scrapie sa početnim kliničkim znacima (uzorci 1-5) i sa naprednim kliničkim znacima (uzorci 6-13). Linija 14 prikazuje negativnu kontrolu, a linija 15 uzorak neinficiranog homogenata mozga ovaca koji nije podvrgnut pK digestiji.

GFAP imunobojenje otkrilo je izraženu astrogliozu kod ovaca zaraženih scrapie u odnosu na kontrolne ovce (Slika 1D). Morfološki, astrociti inficiranih ovaca dosljedno su pokazivali hipertrofična ćelijska tijela i procese, potvrđujući prisustvo reaktivne astroglioze, dok su kontrolne ovce pokazale tipičnu zvjezdastu morfologiju neaktiviranog stanja.

U produženoj moždini i talamusu, GFAP imunobojenje je bilo intenzivnije, uz pojavu astrocitnih mreža zbog procesa preklapanja. U hipokampusu i frontalnom korteksu, astrociti su bili ravnomjerno raspoređeni, uz prisustvo izolovanih hipertrofičnih zvjezdanih tijela.

For more information:1950477648nn@gmail.com