Dijetetski cistanche ublažava akutno oštećenje ileuma kod patke

Sažetak: Aflatoksin B1 (AFB1) je stabilan toksični metabolit koji ugrožava zdravlje ljudi i životinja i široko kontaminiranu stočnu hranu i hranu za ljude. Ova sadašnja studija imala je za cilj da istraži efektedijetetski cistancheo ozljedi ileuma kod pataka uzrokovanih primjenom AFB1 i istražiti njegove osnovne mehanizme. Patke (N=450, jednodnevni mužjak) slične težine nasumično su raspoređene u 3 grupe, koje su sadržavale kontrolnu grupu, AFB1 grupu (60 µg AFB1 kg-1 tjelesne težine) i cistanche (500 mg cistanche kg-1 dijeta) plus AFB1 grupa. Primjena AFB1 značajno je povećala oštećenje ileuma, adukte AFB1-DNK u plazmi, te oksidacijski stres i upalu. Dodavanje cistanchea u ishranu zaštitilo je ileum od morfološkog oštećenja izazvanog davanjem AFB1, smanjilo adukte AFB1-DNK u plazmi i eliminisalo oksidacioni stres i upalu u ileumu pataka.Antioksidacijaiprotuupalno efekti cistancheamože zaštititi ileum od akutnog oštećenja aktiviranjem Nrf2-ARE signalnog puta i inhibiranjem NF-κB signalnog puta. konačno,cistanchebila dijetaantioksidacijaiprotiv upalaagent aktiviranjem Nrf2-ARE signalnog puta i inhibiranjem akutnog oštećenja NF-κB signalnog puta izazvanog primjenom AFB1.

Ključne riječi:cistanche; akutni ileum; AFB{0}}DNK adukti; Nrf2-ARE;

Kliknite ovdje za Cistanche proizvode protiv starenja

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950

1. Uvod

Meso je važan izvor visokokvalitetnih proteina za ishranu ljudi. Pačje meso se u velikoj meri konzumira širom sveta, posebno u Aziji zbog svojih poželjnih nutritivnih karakteristika [1]. Stoga je uzgoj pataka privukao pažnju ljudi. Za patke, postoje različiti nedostaci u procesu uzgoja, kao što je AFB1 koji ugrožava zdravlje pataka. Aflatoksin B1 (AFB1) je jedan od tabličnih toksičnih metabolita koje proizvode vrste Aspergillus. AFB1 je prepoznat kao najtoksičniji među grupama aflatoksina (AF), zajedno sa nizom toksičnih efekata koji ugrožavaju zdravlje ljudi i životinja [2].

Za ljude ili životinje, hrana ili hrana za životinje su uobičajen i važan način izloženosti AFB1, ali se udisanje i direktan kontakt s kožom ili sluznicom također računaju i ne zanemaruju [3]. Prethodne studije su dokazale da AFB1 ispoljava snažnu toksičnost koja je vrlo složena i jaka, što dovodi do usporavanja rasta, bioloških malformacija, toksičnosti jetre, poremećaja probavnog trakta, pa čak i raka [4,5]. AFB1 dobijen iz kontakta sa hranom ili sluzokožom imao je negativne efekte na respiratorni sistem, probavni sistem i tkiva i performanse rasta [3,6,7]. Oštećenja tkiva i organa uzrokovana primjenom AFB1 povezana su s oksidacijskim stresom i upalom. Davanje AFB1 označilo je povećan sadržaj AFB1-DNK adukata u povrijeđenom organu [8]. Apsorpcija i konverzija nutrijenata i toksina dogodila se u želucu i tankom crijevu, tako da

Imuni sistem sluznice crijeva je prva linija za zaštitu tijela od ozljeda [9]. Funkcionalnost i morfologija zdravstvenog gastrointestinalnog trakta mogu biti uništeni nepovoljnim faktorima kao što su toksikanti, bakterije i virusi [10,11]. AFB1 je inducirao destrukciju intestinalne strukture, što se manifestira odvajanjem epitelnih ćelija u resicama jejunala i infiltracijom limfocitnih ćelija u crijevima pilića [12,13]. Funkcionalnost i morfologija varijacije mogu se pripisati procesu metabolizma toksina koji je često praćen upalom oksidativnog stresa. Hitno je pronaći protuotrov za smanjenje i minimiziranje prijetnje AFB1 za ljude i životinje.

Shodno tome, AFB1 je jedna od najvećih briga u živinarskoj industriji zbog svoje snažne toksičnosti. cistanche je vrsta polifenolne komponente koja se javlja u rizomima kurkume (Cur cuma Longa Linn) kao funkcionalni dodatak stočnoj hrani koji se koristi u hrani za stoku [14] i široko se koristi

kao zeleni i prirodni začin, bojilo, konzervans i aroma u prehrambenoj industriji. Ekstrakti biljaka kao što je cistanche koji sadrže polifenole poboljšali su imunitet organizma [15]. cistanche igra ključnu ulogu protiv patološko-patoloških stanja i aktivnosti uzrokovanih oksidativnim stresom kada se koristi kao terapija za liječenje i prevenciju kroničnih bolesti [16,17]. Klinička ispitivanja su pokazala da cistanche nema jake toksične ili nuspojave, te da ima antikancerogena i antitoksikogena svojstva, što je dovelo do toga da je cistanche atraktivno kemopreventivno sredstvo protiv oštećenja tkiva izazvanog AFB1- [18–20]. Literatura je pokazala da cistanche ima sposobnost protiv upale, anti-apoptoze i antioksidacije aktiviranjem Nrf2/HO-1 puta, pojačanim antiox kapacitetom da eliminira upalu i oksidativni stres u tijelu i eliminira AFB1-indukovanu oksidativni stres [21–25]. cistanche je potisnuo oksidacijski stres i formiranje inflamasoma aktivacijom Nrf2-ARE i inhibiranjem NF-κB signalnog puta u ostatku bubrega [26], antioksidacijskim i antiinflamatornim svojstvima. Osim toga, dijetalni cistanche značajno je poboljšao antioksidativni kapacitet kod brojlera [27] i pataka [28]. Nije bilo pokušaja da se poveže uloga cistanche u Nrf2-ARE i NF-κB signalnom putu i u životinjskom modelu akutne primjene AFB1.

Ova studija je bacila svjetlo na ovo pitanje i pružila teorijsku osnovu za cistanche kao dodatak hrani za zaštitu zdravlja pataka od primjene AFB1 i smanjenje ekonomskih gubitaka industrije hrane za životinje i uzgoja uzrokovanih zagađenjem AFB1.

2. Materijali i metode

2.1. Hemikalije

cistanche je kupljen od Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Kina, CAS: 458-37-7), njegova čistoća je bila više od 98 posto prema HPLC analizi. AFB1 (čistoća veća ili jednaka 98 posto, CAS BR. 1162-65-8) je kupljen od Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Antitela korišćena u ovoj studiji nabavljena su od Bey time Biotechnology, Šangaj, Kina, uključujući GAPDH (kataloški broj: AG019), Nrf2 (kataloški broj: AF7623), Phospho-NF-κB p65 (Ser276) (kataloški broj: AF5875), HRP označen kozji anti-zečji IgG (H plus L) (kataloški broj: A0208) i koza označen s HRP-om

Anti-mišji IgG (H plus L) (kataloški broj: A0216).

2.2. Patke i uzgoj

Eksperimentalni protokol je proveden u skladu sa praksama navedenim u Vodiču za njegu i korištenje poljoprivrednih životinja u istraživanju i nastavi poljoprivrede Sjeveroistočnog poljoprivrednog univerziteta (broj protokola: NEAU-[2011]-9).

Patke (n {{0}}, jednodnevni mužjak Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 g) bez značajnih razlika u težini kupljene su iz komercijalnog mrijestilišta i nasumično raspoređene u 3 grupe (Tabela 1), sa 10 ponoviti olovke (kaveze) po grupi i 15 pataka po oboru za 70-dan

ispitivanje hranjenja. Bazalne dijete su formulisane prema Nacionalnom istraživačkom savetu (1994). Patke u grupi T0 i T0 plus AFB1 hranjene su bazalnom dijetom od kukuruza i soje (Tabela 2), patke u grupi T500 plus AFB1 hranjene su bazalnom prehranom sa dodatkom 500 mg

cistanche kg-1 dijete (T500) 70-dnevna proba. Tokom 70 dana, patke slične tjelesne težine u grupama T0 plus AFB1 i T500 plus AFB1 hranjene su sa 60 µg AFB1 kg-1 tjelesne težine, i patke u T0 grupi su hranjene istom količinom rastvora PBS. Patke su hranjene u eksperimentalnoj bazi Acheng na Northeast Agricultural University i omogućen im je ad libitum pristup vodi i ishrani u prahu. Petnaest pataka sa sličnom tjelesnom težinom (1,4 ± 0,3 kg) iz svake grupe je odabrano i posteno 12 h, zatim hranjeno PBS otopinom za patke u T0 grupi i 60 µg AFB1 kg-1 tjelesne težine za patke u T0 plus AFB1 i T500 plus AFB1 grupe u isto vrijeme. Nakon 12 h, petnaest pataka u svakoj grupi trebalo je da dobije uzorke pataka.

2.3. Zbirka uzoraka

Uzorci krvi (10 mL) su dobijeni pomoću heparinskih epruveta iz vena pačjih krila i centrifugirani na 1000×g 15 minuta na 4 ◦C. Dobijena plazma je odmah odvojena i pohranjena na -80 ◦C radi analize. Patke su anestezirane udisanjem etra i ubijene da bi se dobio ileum. Ileum je ispran 3 puta u PBS-u, odmah, i pojedinačno pohranjen u rezervoaru sa tečnim azotom, a zatim na -80 ◦C za qRT-PCR i analizu antioksidativnog kapaciteta. Zatim je dobijeno oko 0,125 cm3 ileuma i stavljeno u 4-postotni rastvor paraformaldehida za presek tkiva i oko 1 mm3 ileuma je stavljeno u elektronski mikroskop.

rastvor na 4 ◦C za kasnije ultrastrukturno posmatranje.

2.4. Analiza nivoa antioksidansa u plazmi

Nivoi ukupne superoksid dismutaze (T-SOD), glutation peroksidaze (GSH Px), glutation S-transferaze (GSH-ST) i malondialdehida (MDA) u plazmi mjereni su kompletima za analizu (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina), odnosno sa

UV-VIS spektrofotometar (UV1100, MAPADA, Šangaj, Kina).

2.5. Analiza nivoa AFB1-DNK adukta u plazmi

Generacija AFB1-DNK adukata u plazmi određena je korišćenjem ELISA kompleta prema specifikacijama kompleta (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nan jing, Kina).

2.6. Ispitivanje antioksidativne sposobnosti u ileumu

Ileum (100.00 mg) je razdvojen i pomiješan u 0,9 mL fiziološke otopine soli (4 ◦C, 0,9 posto NaCl, pH=7,2 –7.4) da bi se dobio 10 posto ileuma/SPSS homogenata. Aktivnost ili sadržaj ukupne superoksid dismutaze (T-SOD U/mg proteina), reduktivnog glutationa (GSH-PX µmol/mg proteina), glutation S-transferaze (GSH-ST U/mg proteina) i malondialdehida (MDA nmol/ mg proteina) u ileumu procijenjeni su korištenjem kompleta za analizu (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina), respektivno, uz UV-VIS

spektrofotometar (UV1100, MAPADA, Šangaj, Kina).

2.7. Izolacija RNK i kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR)

Ukupna RNK pačjeg ileuma (100.00 mg) izolovana je pomoću kompleta reagensa (TaKaRa, Japan) prema protokolu preporučenom od strane proizvođača. Koncentracija i čistoća ukupne RNK detektovani su u odnosu A260/A280 spektrofotometrom (IMPLEN, Njemačka). 1 µg ukupne RNK u svakom uzorku pretvoreno je u cDNK sa Prime Script™ RT kompletom reagensa sa gDNA Eraser-om (TaKaRa, Dalian, Kina) prema

prema protokolu koji preporučuju proizvođači. Dobijena cDNK iz svakog pačjeg ileuma korišćena je kao šablon za TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, Kina) RT-PCR (qRT-PCR) komplet. Pristupni broj gena pataka dobijen je od NCBI i

prajmere gena za patke sintetizovao je Sangon Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Kina) (tabela 3). Relevantna ekspresija gena u pačjem ileumu određena je termalnim ciklusnim aparatom Quanta gen Q225. qRT-PCR je izveden u Monad Selected Real-Time

PCR sistem (ABI 7500 PCR instrument u realnom vremenu (SAD)) teče u stanje: jedan ciklus na 95 ◦C tokom 30 s, 40 ciklusa na 95 ◦C tokom 5 s i na 60 ◦C tokom 30 s. Relativni odnos genske ekspresije detekcijske mRNA detektovan je metodom 2−∆∆Ct i normalizovan na ekspresiju -aktina.

2.8. Western blotting

Pačji ileum je usitnjen i liziran u RIPA puferu koji sadrži 1 mmol/L PMSF (Beyotime, Šangaj, Kina) u ledu. Ukupna koncentracija proteina u ileumu određena je kompletom za analizu bicinhoninske kiseline (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina). 12 posto i 10 posto SDS-poliakrilamidnog gela za elektroforezu

koristi se za dobijanje ciljnih proteina različite molekularne težine. Zatim su ciljni proteini prebačeni na poliviniliden-difluoridnu (PVDF) membranu (Beyotime, Šangaj, Kina) za blotiranje pomoću trans blot aparata. PVDF membrana je isprana 3 puta po 10 minuta svaki put u 1 × PBST, a zatim blokirana 2 h u 5% obranom mlijeku. PVDF membrana je ponovo isprana 3 puta i inkubirana sa GAPDH, Nrf2 i P-P65 (Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina) primarnim antitelima tokom 8 – 12 h na 4 ◦C, respektivno. Sledećeg dana, PVDF membrana je isprana ponovo 3 puta i inkubirana sa odgovarajućim antitelom obeleženim peroksidazom rena na 37 ◦C tokom 1 h, a zatim ponovo isprana 3 puta.

Ciljne proteinske trake su otkrivene i vizualizovane pod dejstvom kompleta za detekciju poboljšane fluorescencije BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina). Slike mrlja su snimljene i analizirane pomoću platforme za snimanje Essential V6 (UVITEC, Cambridge,

Engleska). GAPDH protein je služio kao interni kontrolni protein. Svi rezultati eksperimenta ponovljeni su u tri primjerka. Relativna ekspresija ciljnih proteina izražena je kao omjer intenziteta traka proteina prema GAPDH.

2.9. Statistička analiza

Podaci eksperimenta dobiveni su najmanje šest puta i svaki uzorak je mjeren tri puta. Analiza podataka istraživanja korištenjem Independent-Samples T Test by SPSS (verzija 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) sa 5 posto Vjerovatnoća greške i statistička značajnost bila je p < {{4} }.05 u ovoj studiji