Izloženost izduvnim gasovima dizel motora mijenja ekspresiju mreža uključenih u neurodegeneraciju u mozgu zebrice, 2. dio

Priprema uzorka proteina

Za pripremu uzoraka proteina, glave od 80 do 100 anesteziranih larvi (5 pdf) su pažljivo izolovane i isprane PBS-om prije prenošenja u pufer za lizu koji se sastojao od 15% prethodno ohlađenog TCA/acetona koji sadrži 0,07% beta-merkaptoetanola (ME )i koktel inhibitora proteaze (potreban proizvođač)u ukupnoj zapremini od 500 ul.

Posljednjih godina postoji značajan interes za efekte uzoraka proteina na pamćenje. Sve više ljudi počinje da shvata značaj ishrane za zdravlje, a posebno važnu ulogu proteina u ljudskom organizmu.

Proteini su osnovni građevinski materijali ljudskog tijela i igraju važnu ulogu u ljudskom tijelu. Zbog toga su uzorci proteina postali važan kanal za mnoge ljude u potrazi za zdravljem i ljepotom. Osim izgradnje mišića i oblikovanja tijela, uzorci proteina također mogu poboljšati pamćenje osobe.

Neki naučnici su proučavali odnos između proteina i pamćenja. Otkrili su da je dugotrajan unos dovoljno proteina koristan za sve aspekte fizičkog zdravlja, posebno za pamćenje. Sve je više dokaza da unos proteina ishranom ima važan uticaj na funkciju mozga i pamćenje.

Proteini su važna komponenta neurona u ljudskom mozgu, tako da dnevni unos proteina ima važan utjecaj na pamćenje i sposobnost razmišljanja ljudi. Dugotrajni unos proteina ne samo da zadovoljava potrebe organizma za proteinima, već i pomaže mozgu da ostane aktivan i zdrav.

Osim toga, proteini mogu pomoći tijelu u održavanju ravnoteže šećera u krvi i održavanju stabilnog raspoloženja. Ovo je veoma važno za održavanje pamćenja i sposobnosti razmišljanja. Stoga umjereni unos proteina može pomoći poboljšanju različitih kognitivnih funkcija i emocionalnih stanja ljudskog tijela.

Sve u svemu, postoji jaka veza između uzoraka proteina i pamćenja. Povećanje unosa proteina pomaže u održavanju zdravlja mozga i tijela, poboljšavajući vještine razmišljanja i pamćenje. Za osobe koje treba da poboljšaju svoje pamćenje, veoma je neophodno da unose odgovarajuću količinu proteina. Trebali bismo jesti proteinsku hranu na odgovarajući način i obratiti pažnju na razumne obroke kako bismo održali zdravo tijelo i oštar um. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola djeluje antioksidativno, protuupalno i protiv starenja, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime se štiti zdravlje nervnog sistema. Osim toga, Cistanche deserticola također može promovirati rast i popravak nervnih ćelija, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronskih mreža. Ovi efekti mogu pomoći u poboljšanju pamćenja, učenja i brzine razmišljanja, a također mogu spriječiti razvoj kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

Kliknite znati suplemente za jačanje pamćenja

Nakon kratke homogenizacije, proteini su precipitirani 12 h na 20 stepena, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 12,000 o/min u trajanju od 5 minuta na 4 stepena. Supernatant je uklonjen, a proteinski pelet je dva puta ispran hladnim acetonom (koji sadrži 0.07% ME i koktele inhibitora proteaze). Konačni proteinski pelet je otopljen u puferu za lizu koji je sadržavao 7,0 M uree, i 2,0 M tioureje sonikacijom na ledu.

Solubilizirani uzorci proteina su centrifugirani na 15,000 o/min tokom 10 minuta na 4 stepena da bi se istaložile nerastvorljive čestice, a koncentracija konačnih uzoraka proteina je mjerena korištenjem Bradford metode.

Proteomička analiza visoke propusnosti zasnovana na TMT-u

Uzorci su reducirani, alkilirani i digestirani uzastopnim dodavanjem tripsina i lys-C proteaza. Peptidi su zatim označeni pomoću 10-plexTMT izobaričnih oznaka prema uputama proizvođača. Obilježeni uzorci su pomiješani i zatim fino frakcionirani korištenjem visoko pH reverzne faznehromatografije.

Pojedinačne frakcije su zatim analizirane pomoću LC–MS/MS pomoću onlajn reverzne fazne hromatografije i tandem masene spektrometrije na Thermofsher Fusion Lumos masenom spektrometru. Podaci su dobijeni korišćenjem MS3 metode zasnovane na sinhronoj selekciji prekursora, kao što je prethodno opisano (McAlister14 i dr. 20). Pretraživanje baze podataka i ekstrakcija informacija o TMT reporter ionima obavljeni su pomoću softverske platforme MaxQuant (Cox and Mann 2008).

Poređenje TMT podataka u uzorcima izvršeno je pomoću MSStats (Choiet al. 2014). Transkriptomska analiza Približno 80–100 glava je izolovano iz anesteziranih embriona (120 h), isprano PBS i podvrgnuto totalnoj ekstrakciji RNK pomoću Trizolricha (Sigma Al. , SAD) reagens prema uputama proizvođača.

Kvalitet i kvantitet RNK procijenjeni su pomoću spektrofotometra NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) i dalje od strane Agilent 2100 Bioanalyzer kako bi se osigurala minimalna koncentracija od 50 ng/ul i broj integriteta RNK (RIN) od 8. Priprema biblioteke je zatim izvršena korištenjem HiSeq Ilumina000 protokol: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow withRibo-Zero Gold", a uzorci su sekvencionirani prema sljedećim uslovima: "Upareni kraj rada, R1=75 ciklusi (antisense lanac), Indeks=8 ciklusi, R2=75 ciklusi (čulni niz)."

Analiza podataka

Oba skupa podataka za proteomske i transkriptomske studije istovremeno su učitana i analizirana pomoću online alata Metascape, koji omogućava označavanje gena za različite vrste, uključujući Danio rerio (Zhou et al. 2019). Da bi se procijenio doprinos promjene profila proteoma ili transkriptoma, bili su specifični putevi, podaci analizirano korištenjem softvera Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

Skupovi podataka koji sadrže identifikatore gena ili proteina i odgovarajuće vrijednosti ekspresije su učitani u aplikaciju. Svaki identifikator je mapiran na svoj odgovarajući objekt u Ingenuity bazi znanja.

Granica promjene ekspresije od 13- puta je postavljena da se identifikuju molekuli čija je ekspresija različito regulirana. Funkcionalna analiza je identificirala biološke funkcije i/ili bolesti koje su bile najznačajnije za skup podataka. Za analizu su uzeti u obzir molekuli iz skupa podataka koji su naišli na graničnu vrijednost i koji su povezani s biološkim funkcijama. Desnorepi Fisherov egzaktni test korišten je za izračunavanje p-vrijednosti koja određuje vjerovatnoću da je svaka biološka funkcija i/ili bolest pripisana tom skupu podataka samo zbog slučajnosti.

Analiza puta

Da bi se procijenio doprinos promjena profila proteoma ili transkriptoma u specifičnim putevima, oba skupa podataka su učitana u IPA softver (Krämer et al. 2014). Najznačajniji izmijenjeni kanonski putevi su zatim dalje procijenjeni i interpretirani korištenjem PCR-a i western blotinga kao što je opisano u nastavku.

Western blotting

Ukupno 25 µg proteina je napunjeno na 12% NuPAGE (Novex, CA) i prebačeno na PVDF membrane (Novex, CA) kako je opisano (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membrane su blokirane sa 5% obranog mlijeka u Tris-puferiranoj fiziološkoj otopini i 0,01% tween 20 (TBST pufer) u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi i zatim inkubirane preko noći na 4 stepena sa poliklonalnim anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) ili mišjim monoklonskim anti-GAPlonom zeca. Abcam, CA), razrijeđen u TBST puferu koji sadrži 1% obranog mlijeka.

Nakon ispiranja u TBST-u, mrlje su inkubirane sa sekundarnim magarećim anti-HRP-HRP (Abcam, CA) ili kozjim anti-mišjim-HRP (Santa Cruz, CA) antitijelima 2 h, nakon čega je uslijedio razvoj sa Pierce™ ECL Plus western blotting supstratom ( Thermo Fisher Scientific, SAD). Trake su vizualizovane snimanjem pomoću LI-COR skenera i analizirane denzitometrijom (LI_COR Biosciences,NE).

PCR u realnom vremenu

Ukupna RNK je izolovana iz glava pomoću TRIzol reagensa (Sigma Aldrich, Saint Louis, SAD) prema uputstvima proizvođača, a zatim izmjerena pomoću NanoDrop 2000 spektrofotometra (Thermo Scientific, MA). Količina od 1 ug svakog uzorka RNK je reverzno transkribirana korištenjem iScript™ supermiksa za reverznu transkripciju (Bio-Rad, CA), a PCR u realnom vremenu je izveden pomoću SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermiksa (Bio-Rad, CA), a prajmeri su navedeni u Dodatnoj tabeli 1. Relativni nivoi ekspresije su izračunati korišćenjem 2−ΔΔCT metode, a statistički T-test je korišćen za procenu značajnih razlika.

Rezultati i diskusija

Proteomske i transkriptomske analize su dva glavna alata za razumijevanje molekularnih mehanizama u pozadini procesa bolesti i odgovora na podražaje iz okoline (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková i sur.2012) 2017; . Ovdje smo izvršili duboke analize ekspresije i na transkriptomskom i na proteomskom nivou u glavama embriona zebrice izloženih DEPe.

Glave, sastavljene uglavnom od moždanog tkiva, izolovane su kako bi se eliminirali profili ekspresije drugih tkiva jer nas zanima utvrđivanje intrinzičnih patoloških puteva CNS-a.

Profil ekspresije glava zebrafishembriona

Analiza profila dala je 11.172 otkrivena proteina i 14.748 mRNA meta od više od 26 000 kodirajućih gena (Howe et al. 2013). Među 11.172 proteina identifikovanih iz uzoraka obeleženih TMT (dodatna tabela 2), 141 protein je bio značajno povećan, a 607 je bio smanjen (dodatna tabela 3 i slika 1a). Slično, 367 transkripata je regulirano naviše, a 149 je smanjeno među 14.748 transkripata (dodatna tabela 4) otkrivenih u RNA-seq analizi (slika 1b i dodatna tabela 5).
U većini slučajeva, nalazi iz poboljšane proteomske i transkriptomske analize bili su konzistentni. Na primjer, visoko regulirani proteini uključuju citokrom P450 Cyp1a, Cyp1c1, gama podjedinicu proteina koji vezuje gvaninnukleotide, aneksin, pleksin B2b kratku izoformu, dehidrogenazu/reduktazu (SDR familija) člana 13-kao 1, S-antigen gretine (arrestin) b i sulfotransferaza6B1.

Isto tako, geni sa najvećom transkriptomikuregulacijom uključuju citokrom P450 (Cyp1a), hemokin (C–C motiv) ligand 27a, represor receptora aril-ugljovodonika A, citokrom P450 (Cyp1b), i Rh familije C glikoprotein ruku, i Down glikoprotein ruku regulisani proteinima. nisu uvek bile u visokoj korelaciji.

Na primjer, kompleksin 2, spektrin alfa, laki lanac srčanog miozina-1, protein koji interaguje s SEC23, membranska podjedinica ATP sintaze EA, citokrom b i NAD-zavisna protein deacetilaza spadaju među proteine ​​sa visokim stepenom regulacije, dok protein membrane retinalouter segmenta 1a , porodica nosača rastvora 5 (jodidni transporter), FBJ virusni homolog B onkogena za osteosarkom miša, kompleksin 4c, FOS-sličan antigen 1a, opsin 1 i v-fos pokazuju najveću smanjenje regulacije transkripcije (Tabele 1 i 2).

Antitijela koja prepoznaju proteine ​​zebrice su ograničena, ali smo potvrdili uzorak ovih promjena korištenjem Western blot analize. Povećana regulacija proteina Cyp1A i niska regulacija kompleksina 2 (CPLX2) potvrđeni su korištenjem GAPDH kao kontrole opterećenja (slika 2a). Viši nivoi transkripcije TAT i UGT1B1 i niži nivoi CHNRB i TH2 takođe su potvrđeni qPCR koristeći Elf-alpha kao internu kontrolu (slika 2b).

Gene anotacija

Postoji nekoliko online bioinformatičkih alata i softvera koji mogu pružiti korisne informacije o beleškama o genima. Među njima, Metascape, sa mogućnošću označavanja gena za Danio rerio (Zhouet al. 2019), korišten je u ovom radu.

Oba skupa podataka za proteomske i transkriptomske studije istovremeno su učitana i analizirana pomoću ovog online alata. Nakon kombinovanja izlaza i proteomskih i transkriptomskih promjena u softveru, nekoliko procesa kao što su odgovor na ksenobiotski stimulans, metabolizam ksenobiotika pomoću citokroma P450 ekspresije, pronađeni su izazvani tretmanom DEPe (slika 3a).

Ova analiza je takođe sugerisala potisnute nivoe bioloških procesa kao što su "vizuelna percepcija", "fototransdukcija" i "internalizacija receptora vezanih za G protein". Promjene u ekspresijskim profilima vezanim za vid nisu bile neočekivane jer je tretman DEPe tokom ranog razvoja rezultirao manjim očima (podaci nisu prikazani).

Signalizacija metabolizma ksenobiotika

Ksenobiotici, koji su strana prirodna ili sintetička kemijska jedinjenja, mogu pokrenuti ćelijski stresni odgovor, što dovodi do diferencijacije, proliferacije, apoptoze ili nekroze. Zaista, tijelo treba da se aktivno štiti od ksenobiotika, kao i toksičnih endogenih spojeva i njihovih metabolita, putem ekspresije enzima i transportera koji su uključeni u njihovu eliminaciju i detoksikaciju.

Ovi enzimi su klasifikovani u tri grupe: enzimi faze I (CYP, ALDH, FMO) koji unose polaritet u ksenobiotike; Enzimi faze II (UGT,GST, SULT) koji uvode hidrofilnost konjugacijom hidrofilnih molekula kao što su sulfat, glukuronska kiselina i glutation sa ksenobioticima; i enzimi faze III (MDR1, OATP2, MRP) koji prenose ksenobiotike ili konjugate II formirane tokom Phaze na ekstracelularno područje.

Ovi enzimi se induciraju putem signalnih kaskada koje uključuju specifične receptore (CAR, PXR, AHR) i MAPK posredovanu aktivaciju transkripcionih faktora (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

U nedostatku aktivatora, konstitutivno aktivni receptor (CAR) nalazi se u citoplazmi kao kompleksu sa CCRP i HSP90. Ali kada je aktivator prisutan, CAR se translocira u jezgro i vezuje se za RXR kako bi formirao heterodimer i dalje se vezuje za nekoliko varijanti motiva ponavljanja, kao što su DR3, DR4, ER6 i ER8, i doprinosi regulaciji genske ekspresije (dodatna tabela 2).

Naša proteomička analiza otkrila je aktivaciju ksenobiotskog metabolizma. Zaista, jasna pojačana regulacija CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (heme oksigenaza 1), CAT (katalaza) i CES1 (karboksilesteraza 1) pokazuje indukciju metabolizma faze I, dok povećana ekspresija UGT1A1 (UDP glukuronoziltransferaza) i 1 člana GSTP1 porodice A. glutationS-transferaza pi 1) ukazuje na aktivaciju metabolizma faze II.

Zanimljivo, smanjena regulacija sulfatnih transferaza kao što su SULT1A1 (1A član porodice sulfotransferaza), SULT1C2 (član 2 porodice sulfotransferaza 1C) i SULT2B1 (član 1 porodice sulfotransferaza 2B) sugerira da se povećanje hidrofilnosti u Fazi II metabolizma po mogućnosti javlja putem metabolizma glute kiseline. , ali ne i sulfatna konjugacija (slika 4).

Rezultati transkriptomske studije su prilično konzistentni, pošto su CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 i UGT1A1 svi pojačano regulisani na nivoima RNK. Međutim, SULT2B1 pokazuje pojačanu regulaciju na nivou RNK (dok je nedovoljno zastupljen na nivoima proteina).

Ovo može biti zbog uključivanja drugih mehanizama koji indukuju degradaciju ili inaktivaciju enzima sulfat transferaze nakon tretmana DEPe. Ono što je posebno iznenađujuće je da su se ove promjene u metabolizmu ksenobiotika dogodile u glavama (vjerovatno mozgu) riba. Ekspresija ksenobiotskih gena opisana je u nervnom sistemu sisara, ali ovo je prvi izvještaj o njima u mozgu zebrice (McMillan i Tyndale 2018).

Ovi nalazi su u skladu sa sličnom studijom koju su sproveli Shankar i saradnici koji su testirali efekte različitih grupa ekoloških policikličnih aromatičnih ugljovodonika (PAH) na razvoj embriona i dalje evaluirali uticaj svakog režima tretmana na profil transkriptoma.

Na cijelom tijelu od 48 embriona nakon oplodnje (hpf), pokazali su da je regulacija Cyp1a na nivou transkripcije i proteina rani pouzdani biomarker ksenobiotske aktivacije AHR-a i nizvodnih transkriptomskih promjena (Shankar et al. 2019).

NRF2-posredovani odgovor na oksidativni stres

Oksidativni stres može izazvati apoptozu i nekrozu i vjeruje se da je uključen u neurodegeneraciju (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Glavni odgovor ćelijske odbrane na oksidativni stres je indukcija antioksidativnih i detoksikacijskih enzima.

Nuklearni faktor-eritroidni 2-faktor 2(Nrf2) se vezuje za promotor antioksidativnih elemenata odgovora (ARE) i aktivira njihovu transkripciju. Neaktivni Nrf2 je povezan s proteinom Keap1 koji vezuje aktin i zadržava se u citoplazmi.

Pokrenut oksidativnim stresom, Nrf2 je fosforiliran kao odgovor na puteve protein kinaze C, fosfatidilinozitol 3-kinaze i MAP kinaze. Fosforilirani Nrf2 se zatim može translocirati u jezgro i vezati ARE kako bi transaktivirao enzime za detoksikaciju i antioksidanse (dodatna tabela 3) (maj 2013.).

For more information:1950477648nn@gmail.com