Razvoj multifunkcionalne kozmetičke kreme koristeći bioaktivne materijale iz Streptomyces

Ram Hari Dahal1 , Tuan Manh Nguyen1,2, Dong Seop Shim3, Joon Young Kim4, Jangyul Lee4 i Jaisoo Kim1,*

sažetak:Sve više se koriste različiti kozmetički proizvodi s jednom funkcijom, ali kozmetika s višenamjenskim djelovanjem ostaje ograničena. Cilj nam je bio razviti multifunkcionalnu kozmetičku kremu koja imaantioksidans, anti-tirozinaza, anti-aging i antimikrobno djelovanje. Antimikrobne aktivnosti vršene su metodom disk difuzije. Ćelijska toksičnost i ćelijska proliferacija procijenjeni su u 96-ploči s jažicom sa različitim ćelijskim linijama kao što su HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 i B16F10. Inhibicija tirozinaze gljiva, inhibicija elastaze i aktivnosti uklanjanja 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikala su procijenjene i izračunata je IC50. Mezoporozna čestica silicijum dioksida sintetizovana je korišćenjem Pluronic P123 i tetraetil orto-silikata (TEOS). Slike lica su snimljene VISIA-CR (Sistem za snimanje lica za klinička istraživanja). Hrapavost slike je analizirana softverom PRIMOS, a svjetlina slike je analizirana Chromametrom CR-400. Sirovi proizvod soja T65 inhibirao je različite ljudske patogene bakterije kao što su Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus epidermidis. IC50 sirovog proizvoda T65 za aktivnosti uklanjanja radikala tirozinaze iz gljiva, elastaze i DPPH bio je 58,73, 14,68 i 6,31 ug/mL, respektivno. Sirovi proizvod T65 je proliferirao kolagen tipa I u CCD-986Sk ćeliji do 145,91 posto ± 9,11 posto (srednja vrijednost ± SD; prosjek od 24, 48 i 72 h) pri 250 pg/mL. Sintetizovane mezoporozne čestice (SBA-15) potvrdile su održive performanse kontrolnim otpuštanjem tokom tri dana. Formulirana funkcionalna kozmetička krema koja sadrži T65 ugrađen SBA-15, značajno je smanjila hrapavost kože za 4,670 posto i povećala sjaj kože za 0,472 posto nakon primjene od 4 sedmice. Sirovi proizvod T65 inhibirao je i gram-pozitivne i gram-negativne patogene. Sintetizovana mezoporozna čestica, SBA-15, potvrdila je da je fiziološki aktivna supstanca oslobođena u uslovima održivog oslobađanja. Sirovi proizvod T65 pokazao je besprijekoran antimikrobni učinak,antioksidans, aktivnosti protiv starenja i izbjeljivanja s necitotoksičnim efektima na različite ćelijske linije povezane s ljudskom kožom.

Ključne riječi: antioksidans; citotoksičnost; anti-tirozinaza; protiv starenja; antimikrobno; mezoporozne čestice silicijum dioksida; kozmetičke formulacije; estetska primena

cistanche izgubljeno carstvo biljatakođe ima aefekat izbeljivanja kože.

1. Uvod

Koža je najveći organ i vanjski omotač ljudskog tijela. Vizuelni izgled kože omogućava procjenu starosti, spola, zdravlja, privlačnosti i ljepote [1,2]. Kozmetički proizvodi se uveliko koriste za poboljšanje izgleda kože i smanjenje starenja kože. Osim toga, lokalna primjena kozmetike pokazuje kako povećati atraktivnost manipuliranjem faktorima ljepote povezanim s kontrastom lica [3,4]. Kozmetička industrija je u stalnoj potrazi za novim i prirodnim bioaktivnim materijalima s anti-aging, antioksidativnim, antitirozinaznim i antimikrobnim svojstvima za kozmetičke formulacije za poboljšanje pristupa njezi kože [5,6].

Starenje kože je složen biološki proces uzrokovan različitim unutarnjim i vanjskim faktorima koji dovode do fiziološke disfunkcije i gubitka strukturnog integriteta kože. Unutarnje starenje, općenito poznato kao prirodno starenje (hronološko starenje) kože, povezano je s hormonalnim promjenama na temelju starosti, dok je vanjsko starenje povezano s kretanjem mišića, zagađenjem, nikotinom, izlaganjem sunčevom zračenju, kofeinom, temperaturom, životnim stilom kao što je npr. kao što su prehrana (ishrana), nedostatak sna, stres i druga zdravstvena stanja [7–9]. Elastin pomaže koži da se vrati u prvobitni položaj nakon pokreta, dok elastaza proizvedena u acinarnim stanicama razgrađuje elastin i dovodi do starenja kože [9]. Anti-elastaza inhibira elastazu i zadržava elastin u njegovom početnom statusu, što sprječava starenje kože. Kozmetički proizvodi ili proizvodi za njegu kože sa svojstvima protiv starenja pozitivno utječu na starenje kože [10–13].

Slobodni radikali se obično stvaraju tokom ćelijskog metabolizma. Reaktivne vrste kisika (ROS) i reaktivne dušične vrste (RNS), kao što su anionski radikal, superoksid, peroksid, hidroksilni radikal, dušikov oksid (NO), peroksinitrit i hipoklorovita kiselina, odgovorne su za oksidativna oštećenja stanica, lipida, proteina, i DNK, što dovodi do ateroskleroze, karcinogeneze, kardiovaskularnih bolesti, ćelijskog starenja, kronične upale, dijabetesa, hipertenzije, mutageneze, neurodegeneracija, reumatoidnog artritisa, moždanog udara, septičkog šoka i drugih degenerativnih bolesti [7,14–17]. Antioksidansi sprečavaju oksidaciju proteina i stvaranje ROS i RNS koji mogu smanjiti oštećenje slobodnih radikala u normalnim tkivima boreći se protiv oksidativnog stresa [17–19].

Koža proizvodi tamni pigment poznat kao melanin. Proizvodnja melanina sprječava kožu od oštećenja izazvanih UV zračenjem [9]. Međutim, prekomjerna proizvodnja i akumulacija melanina uzrokuje kožnu hiperpigmentaciju, što dovodi do estetskih komplikacija kao što su melazma, pjege, senilni lentigine, nevusi i efelisi [9,20]. Tirozinaza je glikoprotein koji se nalazi u membranama melanozoma koji je odgovoran za biosintezu melanina hidroksilacijom l-tirozinaze u 3,4-dihidroksifenilalanin (l-DOPA) i naknadnom oksidacijom l-DOPA u dopakinon [21]. Zbog spontane polimerizacije, dopakinon se konačno pretvara u melanin [22]. Prekomjerno proizvedeni melanin treba kontrolisati kako bi se održao integritet kože. Zato je otkriće novih inhibitora tirozinaze za razvoj kozmetičkih formulacija izazvalo značajan interes [23–25].

Antimikrobni konzervansi se dodaju kozmetičkim proizvodima kako bi se održala mikrobiološka čistoća tokom cijelog perioda njihove primjene [26]. Umjesto upotrebe kozmetičkih konzervansa kao što je metilparaben, prirodni antimikrobni spojevi koji imaju druge funkcije su bolji i korisniji za ljudsko zdravlje [27–29]. Sekundarni metaboliti izolirani iz bakterijskih resursa mogu imati i konzervans i antimikrobna svojstva koja inhibiraju kolonizaciju bakterijskih patogena (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus aureus) u koži [9,26,28].

Bioaktivni spojevi koje proizvode bakterije u tlu ili moru, posebno aktinobakterije, su neiskorištene i još uvijek neistražene [23,30]. Različiti bioaktivni spojevi koji su primjenjivi u kozmetičkoj i kozmetičkoj industriji, uključujući one sa anti-aging, antioksidativnim, antitirozinaznim, antimikrobnim i necitotoksičnim svojstvima, imaju veliki potencijal za nove upotrebe.

Postoje brojne studije o bioaktivnim materijalima izoliranim iz biljaka koje se trenutno koriste u kozmetičkim formulacijama, ali je dostupno vrlo malo studija o bioaktivnim materijalima iz bakterija [9,21,24–27,31]. Ovo istraživanje imalo je za cilj procijeniti kozmeceutski potencijal etil acetatnih ekstrakata iz bakterijskog soja Streptomyces sp. T65 za antioksidativne, anti-aging, anti-tirozinazne i antibakterijske aktivnosti i bilo koje citotoksične efekte na različite ćelijske linije miša i čovjeka. Osim toga, željeli smo sintetizirati čestice mezoporoznog silicijum dioksida. Konačno, glavni cilj ove studije bio je razvoj konačnog kozmetičkog proizvoda za lokalnu primjenu korištenjem bioaktivnog materijala ekstrahiranog iz mikroorganizama tla.

2. Materijali i metode

2.1. Reagensi, ćelijske linije i oprema

Svi korišćeni rastvarači su bili analitičkog kvaliteta. B16-F10 ćelijska linija melanoma, B16-F1 ćelijska linija mišjeg melanoma i ćelijska linija ljudskih keratinocita (HaCaT) kupljene su od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SAD). Dulbeccov modifikovani Eaglesov medijum (DMEM), penicilin-streptomicin i toplotno inaktivirani fetalni goveđi serum (HI FBS) kupljeni su od Gibca (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Seul, Južna Koreja). Komplet za brojanje ćelija-8 (CCK-8) je kupljen od Dojinda (Kumamoto, Japan). Ćelijska linija makrofaga miša RAW264.7 i humani fibroblasti CCD-986Sk kupljeni su od Korean Cell Line Bank (Seul, Južna Koreja). Lipopolisaharid (LPS, Escherichia coli, serotip O11:B4), sulfanilamid, naftil etilendiamin dihidroklorid, tirozinaza pečuraka, svinjska pankreasna elastaza, l-tirozin, askorbinska kiselina, arbutin, N-Succiliande-(A){1} , 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid (MTT), kolagen tip I, Tween 20, tetrametilbenzidin (TMB ), tetraetil orto-silikat (TEOS), pluronski P-123 (poli(etilen glikol)-blok-poli(propilen glikol)-blok-poli(etilen glikol); PEG-PPG-PEG) i -melanocit -stimulirajući hormon (-MSH) nabavljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) i oleanolna kiselina kupljeni su od Aldrich-a (St. Louis, MO, SAD). COL1A1 (kolagen, tip I, alfa 1) primarno antitijelo i sekundarno antitijelo konjugirano sa HRP (peroksidaza hrena) kupljeno je od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, SAD). SpectraMax 340PC384 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) je korišten za 96-očitavanje ploča u bunarici.

2.2. Patogeni bakterijski sojevi

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 i Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 kupljeni su od Korejske zbirke poljoprivrednih kultura (KACC, Jeonju, Južna Koreja); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 i Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 su nabavljeni od Korejske banke ekoloških mikroorganizama (KEMB, Suwon Južna Koreja); i Propionibacterium acnes KCTC 3314 je kupljen od Korejske kolekcije za tipske kulture (KCTC, Jeongeup, Južna Koreja).

2.3. Izolacija i očuvanje

Sakupljeni su različiti uzorci tla sa melioriranih travnjaka u Hwaseongu (37◦16′10" N 126◦45′43" E) i šumi Univerziteta Kyonggi (37◦18′1" N 127◦2′20" E) u Koreji. Bakterije su izolovane metodom koja je prethodno opisana [9]. Kolonije su prugane na R2A pločama svake 1 sedmice radi kratkoročnog čuvanja i pohranjene na -80 ◦C kao suspenzija u R2A bujonu sa dodatkom 20 posto (v/v) glicerola za dugotrajno očuvanje.

2.4. Skrining, identifikacija i filogenetski položaj izolovanih sojeva

Skrining kozmetičkih i antimikrobnih aktivnosti izoliranih sojeva je završen kao što je prethodno opisano [9]. Bakterije koje imaju funkcije identificirane su korištenjem sekvenciranja gena 16S rRNA. Genomska DNK sojeva je ekstrahovana pomoću InstaGene Matrix kita (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD), a gen 16S rRNA je amplificiran PCR-om korištenjem univerzalnog bakterijskog prajmera 27F i 1492R [32]. PCR proizvod je pročišćen sa multiscreen filter pločom (Millipore Corp., Bedford, MA, SAD) i sekvencioniran je Applied Biosystems 3770XL DNK analizatorom koristeći BigDye Terminator ciklus sekvenciranja kita v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD). Gotovo potpuna sekvenca je u skladu sa softverom SeqMan (DNASTAR Inc., Madison, WI, SAD). Najbliži soj izoliranih funkcionalnih sojeva identificiran je korištenjem EzBioCloud [33] i NCBI GenBank baze podataka [34]. Srodne sekvence 16S rRNA su dobijene iz GenBanka, a filogenetička analiza je obavljena korišćenjem MEGA7 [35].

2.5. Kultura bakterija

P. acnes je kultivisan inkubacijom na 37 ◦C tokom 3-4 dana anaerobno u Schaedler anaerobnom bujonu (Oxoid). Za anaerobnu kulturu korišćena je BBL anaerobna posuda sa GasPak EZ Gas Generating Container System (Becton Dickinson, NJ, SAD). S. epidermidis i S. aureus su uzgajani u TSB (Tryptic soy broth) mediju (Oxoid) na 37 ◦C tokom 24 h aerobno. E. coli, P. aeruginosa i B. subtilis su uzgajane u medijumu LB (Luria-Bertani) (Oxoid). Izolovani bakterijski sojevi su kultivisani u R2A na 28 ◦C tokom 4-5 dana.

2.6. Fermentacija

Za proces fermentacije, inokulum je pripreman u R2A bujonu na 28 ◦C tokom 4-5 dana u 150 sati. Soj T65 je fermentisan korišćenjem 1-2 procenta inokuluma u medijumu ISP2 (International Streptomyces Project 2) na 28 ◦C tokom 1 nedelje u 140 časova.

2.7. Ekstrakcija

Sakupljeni bujon kulture centrifugiran je na 11.305 × g 20 minuta na 4 ◦C sa centrifugom velikog kapaciteta 1736R (LABOGENE, Seul, Koreja). Supernatant kulture je filtriran sa filter papirom veličine 150 mm (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, UK) da bi se eliminisali ćelijski ostaci i koncentriran na rotacionom isparivaču na 40 ◦C. Koncentrovani sirovi proizvod je zatim ekstrahovan dva puta jednakim volumenom koristeći pet različitih rastvarača (n-heksan, dietil etar, dihlorometan, hloroform i etil acetat). Utvrđeno je da je etil acetat najbolji rastvarač, a dalje analize su sprovedene korišćenjem etil acetatnog ekstrakta. Organski sloj je odvojen lijevkom za odvajanje i uparen do suhog. Konačno, osušeni sirovi proizvod je otopljen u metanolu za dalju procjenu.

ekstrakt cistanche

2.8. Sakupljanje aktivnih frakcija preparativnom HPLC (Prep-HPLC)

Aktivne frakcije ekstrakta sirove kulture T65 sakupljene su preparativnom HPLC (Agilent 1200 serija). Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 reverzna kolona (30 mm id × 25 cm) s veličinom čestica od 15 μm korištena je kao stacionarna faza. Za mobilnu fazu korišteni su 0,1 posto HCHOOH vode (rastvarač A) i acetonitril (rastvarač B). Koncentracija rastvarača B bila je 10 posto do 100 posto od 0 min do 60 min i 100 posto od 60 min do 75 min. Brzina protoka je bila 15 mL/min. Korišten je viševalni detektor (MWD) sa 208, 230, 254 i 280 nm. Sakupljene frakcije od 14 min do 21 min su isparene do suva i rastvorene u metanolu (T65 sirovi proizvod) za dalju procenu.

2.9. Viabilnost ćelije HaCaT ćelije

Vijabilnost ćelija HaCaT ćelija određena je CCK-8 (Cell Counting Kit-8) testom prema uputstvima proizvođača. HaCaT ćelije su posađene u 96- ploče sa 104 ćelije po jažici i zatim inkubirane na 37 ◦C tokom 24 h u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagles medijumu (DMEM) koji sadrži 10 procenata fetalnog goveđeg seruma (FBS). Ćelije su tretirane različitim koncentracijama T65 sirovog proizvoda (10 mg/mL, 1 mg/mL, 100 ug/mL, 10 ug/mL, 1 ug/mL, 100 ng/ml i 1 ng/mL) i inkubirane na sobnoj temperaturi 2 h u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2 uz dodatak 10 μL CCK-8 reagensa. Apsorbancija reakcione smeše je izmerena spektrofotometrom na mikroploči na 450 nm i izračunat je procenat vitalnosti ćelija.

2.10. Evaluacija antioksidativnih aktivnosti

2.10.1. Procjena toksičnosti u ćelijama RAW264.7

RAW264.7 ćelije su održavane u DMEM-u koji sadrži 10 posto FBS, 100 U/mL penicilina i 100 ug/mL streptomicina na 37 ◦C u inkubatoru sa 5 posto CO2. RAW264.7 ćelije su zasejane u mikrotitarsku ploču sa ravnim dnom 96-jažice pri gustini od 104 ćelije po jažici sa različitim koncentracijama (0-1 mg/mL) T65 sirovog proizvoda i inkubirane na 37 ◦C tokom 24 h u inkubatoru sa 5 posto CO2. Nakon 24 h inkubacije, ćelije su dva puta isprane fiziološkim rastvorom puferiranim fosfatom (PBS), te je u svaku jažicu dodato 190 μL svježeg medija i 10 μL radnog rastvora MTT (5 mg/mL), a ploča je zatim inkubirana na 37 ◦C tokom 4 h u inkubatoru sa 5% CO2. Zatim je supernatant uklonjen, a formirani kristali formazana su solubilizirani dodavanjem 150 μL DMSO (dimetil sulfoksida) u svaku jažicu tokom 10 minuta na 37 ◦C u inkubatoru sa 5 posto CO2. Intenzitet rastvorenih kristala formazana je kvantifikovan korišćenjem čitača mikroploče na 570 nm.

2.10.2. Određivanje azotnog oksida

Ćelije RAW264.7 (105 ćelija/mL) su prethodno tretirane različitim koncentracijama T65 sirovog proizvoda (15,5-125 ug/mL) tokom 30 minuta, nakon čega je usledila stimulacija sa 1 ug/mL LPS tokom 24 h. Koncentracija NO oslobođenog iz ćelija određena je Griessovim reagensom koristeći standardnu ​​krivu NO2– [36]. Sto mikrolitara supernatanta kulture inkubirano je sa 100 μL Griessovog reagensa (mješavina N–1-naftil etilendiamin dihidroklorida (NEDHC) i sulfanilamida) na sobnoj temperaturi 20 minuta u mraku. Apsorbancija je izmjerena na 540 nm.

2.10.3. DPPH test uklanjanja slobodnih radikala

Aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala DPPH provedene su prema prethodno opisanoj metodi [9]. Sirovi proizvod ekstrakta kulture T65 razrijeđen je do koncentracija 600, 200, 100, 20 i 4 ug/mL u metanolu. Reakciona smjesa od 180 μL napravljena je sa 90 μL 0,1 mM DPPH (otopljenog u MeOH) i 90 μL otopina uzoraka različitih koncentracija (Tablica S1). Reakcije testa su temeljito izmiješane u pločama 96-jažica, inkubirane na 37 ◦C 30 min, a apsorpcija je mjerena na 516 nm spektrofotometrom. Procenat inhibicije DPPH izračunat je na sljedeći način:

Inhibicija ( procenat )=[1 − (ODexp − ODcon) / (ODstd − ODbln)] × 100 (1)

gdje je ODexp apsorbanca eksperimentalnog uzorka; ODcon je apsorpcija kontrole; ODstd, apsorbancija standarda; i ODbln, apsorbancija slijepog uzorka.

2.11. Evaluacija aktivnosti protiv starenja

2.11.1. Procjena citotoksičnosti u CCD-986Sk ćelijama

Ćelijska citotoksičnost različitih koncentracija (0-1 mg/mL) sirovog proizvoda T65 u ćelijama fibroblasta ljudske kože (CCD-986Sk) određena je MTT testom kao što je prethodno opisano za MTT test za RAW264.7 ćelije.

2.11.2. Proliferacija ljudskih fibroblasta pomoću CCD-986Sk ćelija

Proliferacija ćelija ljudskih dermalnih fibroblasta (HDF) određena je u CCD{{0}}Sk ćelijama pomoću CCK-8 testa. CCD-986Sk ćelije su posađene u 96-ploče sa 5 × 103 ćelija/bunariću i zatim inkubirane na 37 ◦C tokom 24 h u DMEM-u koji sadrži 10 procenata FBS. Ćelije su tretirane različitim koncentracijama T65 sirovog proizvoda (0-1 mg/mL) i inkubirane na sobnoj temperaturi 2 h u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2 uz dodatak 10 μL CCK-8 reagensa. Apsorbancija reakcione smeše je izmerena čitačem mikroploče na 450 nm i određen je procenat živih ćelija u poređenju sa apsorbancijom netretiranih ćelija.

Cistanche je protiv starenja.

2.11.3. Analiza sinteze kolagena tipa I

Sinteza kolagena tipa I ispitana je enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA). CCD-986Sk ćelije su zasijane u 96-ploče sa gustinom od 5 × 103 ćelije/jažici u DMEM koji sadrži 10 posto FBS i inkubirane na 37 ◦ C 24 h. Različite koncentracije T65 sirovog proizvoda (31,25–25{{30}} pg/mL) dodane su u mediju bez FBS-a tokom 24 h. Zatim je 100 μL medijuma za kulturu i kolagena tipa I dodato u ploče obložene kolagenom 96-jažice i inkubirano na 37 ◦C tokom 24, 48 i 72 h. Svaka jažica je isprana sa 0,05% fosfatnim puferom sa fiziološkim rastvorom sa 0,1% Tween 20 (PBST), a primarno antitelo COL1A1 je dodano i inkubirano 1 h. Ponovo, jažice su isprane sa 0,05 posto PBST, a sekundarno antitijelo konjugirano sa HRP (peroksidaza rena) je dodano i inkubirano 1 h. Svaka jažica je isprana sa 0,05 posto PBST i dodan je TMB (tetrametilbenzidin). Nakon dobijanja željenog intenziteta boje (plava), reakcija je prekinuta dodavanjem 0,5N H2SO4, čime je boja rastvora postala žuta. Apsorbancija je izmjerena na 450 nm čitačem mikropločica i određena je proizvodnja kolagena tipa I.

2.11.4. Test inhibicije elastaze

Aktivnosti inhibicije svinjske pankreasne elastaze (PPE) analizirane su prema prethodno opisanoj proceduri [9]. Sirovi proizvod T65 je razrijeđen do koncentracija od 30{{10}}0, 1000, 500 i 100 ug/mL u metanolu. Reakciona smeša je pripremljena sa 0,2 M Tris-HCl pufera (pH 8,0), 0,5 mM N-Succ-(Ala)3-ρ-nitroanilida (SANA) kao supstratom, svinjskom pankreasnom elastazom (3,5 U/mL u 0,2 M Tris-HCl pufer; pH 8,0) i inhibitor (uzorak). Svaki uzorak je prethodno inkubiran na 37 ◦C tokom 15 minuta, a ukupna reakciona smeša je inkubirana na 37 ◦C tokom 20 minuta. Apsorpcija je izmjerena na 400 nm. Ukupna reakciona smeša od 150 μL pripremljena je kao što je prikazano u tabeli S2. Konačne koncentracije uzorka u reakcionoj smjesi bile su 300, 100, 50 i 10 ug/mL. Procenat inhibicije PPE izračunat je pomoću formule (1).

2.12. Evaluacija aktivnosti izbjeljivanja

2.12.1. Procjena citotoksičnosti u B16F1 ćelijama

Citotoksičnost sirovog proizvoda T65 na ćelije melanoma B16F1 određena je MTT testom. B16F1 ćelije su zasijane u 96-ploče sa 104 ćelije po jažici i zatim inkubirane na 37 ◦C tokom 24 h u DMEM-u koji sadrži 10 procenata FBS. Ćelije su tretirane različitim koncentracijama T65 sirovog proizvoda (0-1 mg/mL) i inkubirane na sobnoj temperaturi 2 h u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2. Apsorbancija reakcione smeše je izmerena spektrofotometrom na mikroploči na 450 nm i izračunat je procenat vitalnosti ćelija.

2.12.2. Inhibicija sinteze melanina u B16F10 ćelijama

B16F10 ćelije su prethodno tretirane sa -MSH u 6- pločama sa 105 ćelija po jažici i inkubirane na 37 ◦C tokom 24 h u DMEM-u koji sadrži 10 procenata FBS da bi se promovisala sinteza melanina. Ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama T65 sirovog proizvoda (31,25-125 ug/mL) i 100 ug/mL arbutina kao pozitivne kontrole u prisustvu ili odsustvu -MSH tokom 48 sati. Uočena je inhibicija sinteze melanina u stanicama melanoma B16F10.

Cistanche inhibira stvaranje melanina.

2.12.3. Test inhibicije tirozinaze gljiva

Aktivnosti inhibicije tirozinaze pečuraka određene su kao što je prethodno opisano [9]. Sirovi proizvod T65 je razrijeđen do koncentracija od 3000, 1000, 500 i 100 ug/mL u metanolu. Reakciona smeša je pripremljena sa 0,1 M kalijum fosfatnog pufera (pH 6,8), 3 mM rastvora l-tirozina [otopljenog u DW (destilovana voda)] i 2000 U/mL tirozinaze pečuraka (otopljenog u 0,05 M kalijum fosfatnog pufera. pH 6, pH 8, ; Sigma) u 96-pločama sa bunarima. Ukupna testna mešavina od 150 μL (120 μL fosfatnog pufera, 10 μL l-tirozina, 15 μL rastvora uzorka i 5 μL tirozinaze pečuraka; Tabela S3) je inkubirana na 37 ◦C tokom 10 minuta i merena je apsorpcija na 475 nm. Konačne koncentracije uzorka u reakcionoj smjesi bile su 300, 100, 50 i 10 ug/mL. Standard je bio bez otopine uzorka, kontrola je bila bez l-tirozina, a slijepa proba je bila bez l-tirozina i otopine uzorka. Procenat inhibicije tirozinaze je izračunat primenom formule (1).

2.13. Analiza aminokiselina

Slobodna aminokiselina sirovog proizvoda T65 određena je metodom GC-FID (gasna hromatografija – detektor plamene jonizacije) u Korejskom institutu za testiranje i istraživanje polimera (Koptri). Za metodu GC-FID, korišćena mašina je Agilent 6890N GC-FID; stub, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); temperatura dijela ubrizgavanja, 250 ◦C; kolona za injekciju, 2 μL; omjer podjele, 5:1; temperaturno stanje, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detektor, FID @ 320 ◦C; nosač, gasni dušik, 1,5 mL/min; proizvođač, Phenomenex; standard aminokiselina; i koncentracija 200 μmol/L.

Kompozitne aminokiseline T65 sirovog proizvoda određivane su metodom GC-FID (gasna hromatografija – detektor plamene jonizacije) na Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Za GC-FID, korišćena mašina je Agilent 6890N GC-FID; stub, ZB-AAA (10 m × 0,25 mm); temperatura dijela ubrizgavanja, 250 ◦C; kolona za injekciju, 2 μL; omjer podjele, 5:1; temperaturno stanje, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detektor, FID @ 320 ◦C; nosač, gasni dušik, 1,5 mL/min; proizvođač, Phenomenex; standard aminokiselina; i koncentracija 200 μmol/L.

2.14. Masna kiselina

Masna kiselina sirovog proizvoda T65 određena je metodom GC-FID (gasna hromatografija – detektor plamene jonizacije) u Korejskom institutu za testiranje i istraživanje polimera (Koptri). Za GC-FID, korišćena mašina je Agilent 6890N GC-FID; kolona, ​​Supelco SP–2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 μm); temperatura dijela ubrizgavanja, 250 ◦C; kolona za injekciju, 1 μL; omjer podjele, 50:1; temperaturno stanje, 100 ◦C (4 min) → 3 ◦C/min → 240 ◦C (15 min); detektor, FID @ 285 ◦C; nosač, gasoviti azot, 0,8 mL/min; proizvođač, SUPELCO 37 Component FAME Mix; i koncentracija 0,5 mg/mL.

2.15. Antimikrobne aktivnosti

Inhibicija patogenih bakterija izvedena je metodom disk difuzije. Sto mikrolitara kulture P. acnes pri 108 CFU (jedinica za formiranje kolonije)/mL je rašireno i inkubirano na 35 ◦C anaerobno 2-3 dana na Schaedler agar pločama zajedno sa diskom od 6 mm (Whatman) koji sadrži 15 ug sirovog ekstrakta rastvorenog u metanolu i merene su zone inhibicije. Slično, 100 μL S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli i P. aeruginosa pri 108 CFU/mL je raspoređeno i inkubirano na 35 ◦C aerobno na R2A ili LBA pločama za 1-2 dana i mjerene su zone inhibicije.

2.16. Sinteza mezoporoznih čestica silicijum dioksida

Polimer koji indukuje strukturu je otopljen u dejonizovanoj vodi da se pripremi rastvor micela. Mezoporozni silicijumski materijali sintetizirani su prema metodama opisanim u literaturi [37]. Za sintezu mezoporoznih čestica silicijum dioksida (SBA-15), 10 g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, SAD), rastvoreno je u 55 mL 2 M HCl, nakon čega je mešano na sobnoj temperaturi. temperature 30 min. Nadalje, 22 g tetraetilortosilikata (TEOS) je dodato u otopinu i dalje miješano 30 min i stavljeno na 36 ◦C 24 h, a zatim stavljeno u rernu, u kojoj je temperatura održavana na 100 ◦C, i ostavljena da odstoji. 4 dana u statičkom stanju. Nakon 4 dana, rastvor se promenio u mutni rastvor u boci. Zamućeni rastvor je filtriran sa dva sloja celuloznog filter papira i ispran sa EtOH (dva puta) i DI (dejonizovanom) vodom (dva puta). Dobijeni filtrirani prah je osušen u konvekcijskoj peći na 120 ◦C i stavljen u peć za muflanje (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Seoul, Južna Koreja). Šest uzoraka je sintetizovano u istim uslovima, ali u različitoj seriji. Transmisione elektronske mikrofotografije (TEM) sintetiziranog SBA-15 snimljene su na Nacionalnom univerzitetu u Seulu transmisijskom elektronskom mikroskopijom (Talos L120C; FEI).

2.17. BET Analiza površine

Veličina čestica silicijum dioksida izmerena je pomoću Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, Ujedinjeno Kraljevstvo). Za pripremu uzorka BET (Brunauer–Emmett–Teller) analize, 5 g P-123 je dodano u 76 g 2M HCl i miješano na 250 rpm tokom 24 h. Nakon 24 h, kada je P-123 bio potpuno otopljen, 160 mL DI (dejonizovane) vode i TEOS su ravnomjerno dodani (15 mL/min) i miješani na 750 rpm tokom 24 h. Nakon toga, formirani prah je odvojen filtriranjem, a izdvojeni prah je stavljen u naprstak i ispran sa Soxhletom 24 h. Zatim je ispran s DI vodom i spaljen u peći za muflanje (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Južna Koreja). BET analize površine su sprovedene da bi se potvrdile performanse praha proizvedenog SBA{14}} sintezom. BET analize su završili Univerzitet Inha i Nacionalni univerzitet Changwon.

Analizator sorpcije gasa (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, Orebić, SAD) korišćen je za ispitivanje površine i raspodele veličine pora pripremljenih mezoporoznih silicijumskih materijala. Raspodjela površine i veličine pora izračunate su korištenjem ASiQwin softvera (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, SAD) na osnovu izoterme adsorpcije-desorpcije. Netaknute sintetizovane čestice su degazirane na 300 ◦C/3h, zatim su izmerene izoterme adsorpcije i desorpcije N2 na temperaturi od −196 ◦C. Višetačka BET analiza je primijenjena za proračun ukupne površine.

2.18. Procjena održivosti

Da bi se potvrdilo prisustvo T65 u ugrađenom SBA-15, izvršeno je sljedeće: 12 g SBA-15 i 1,2 g T65 sirovog proizvoda pomiješani su u 500 mL acetonitrila. Rastvor je mešan 18 h na 30 ◦C. Nakon filtracije, smjesa je filtrirana, a filtrirane čestice su osušene u konvekcijskoj peći na 100 ◦C. Da bi se pronašla sama čestica T65 u SBA-15, 1 g osušenog T65 ugrađenog u SBA-15 je otopljen u acetonitrilu i dodano je 25 mL 3 M fluorne kiseline. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 24 h dok rastvor nije postao bistar. Zatim je rastvor filtriran, a rastvor filtrata je korišćen kao uzorak. Uzorci dobijeni iz gornjih eksperimenata analizirani su HPLC.

Da bi se odredila osobina kontrolisanog otpuštanja, 35 mL ugrađenog SBA-15 je sipano u 50 mL mineralnog ulja (M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i dobro izmiješano. Zatim je u smešu dodato 50 mL DI vode i mućkano na sobnoj temperaturi 6 h, a zatim ostavljeno na stolu 12 h. Kada je tečni sloj odvojen, sloj vode je odbačen, a 1 mL sloja ulja je sakupljen kao uzorak za HPLC analizu. Isti eksperiment je ponovljen drugog i trećeg dana i uzorak je ponovo analiziran pomoću HPLC.

2.19. Kozmetička formulacija i primjena

2.19.1. Test formulacije i stabilnosti

Kozmetički proizvod je formuliran od kreme tipa emulgatora. Stabilnost kozmetičke formulacije određena je držanjem kozmetičkog proizvoda na različitim temperaturama (37, 45 i 60 ◦C), uključujući u zamrzivaču, frižideru i na sobnoj temperaturi do 28 dana. Stabilnost kozmetičke kreme uočena je u prvoj, drugoj, trećoj i četvrtoj sedmici.

2.19.2. Klinička ispitivanja, volonteri i metode primjene

Funkcionalna kozmetička krema koja sadrži T65 sirovi proizvod primijenjena je na 21 volonterku za određivanje poboljšanja bora i efikasnosti izbjeljivanja kroz hrapavost kože i sjaj kože. Sve eksperimentalne procedure za uključivanje ljudi u ovu studiju odobrio je Elad Institutional Review Board (IRB) (EL-P-7400). Od svih pojedinačnih učesnika dobijen je informirani pristanak. Ispitivanja su obavljena prije primjene proizvoda, nakon 2 sedmice i nakon 4 sedmice. Oko 5 mg kozmetičkog proizvoda nanosilo se dva puta dnevno (ujutro i uveče) na lice nakon čišćenja lica i mekano razmazivalo prema teksturi kože. Volonterima nije bilo dozvoljeno da koriste bilo koje druge kreme ili proizvode 1 sedmicu prije ispitivanja i tokom ispitivanja.

2.19.3. Metode snimanja i obrade slike

Slike su snimljene od strane VISIA-CR. Hrapavost slika je analizirana softverom PRIMOS (PRIMOS verzija 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, SAD). Prosječna hrapavost (Ra) i maksimalna dubina hrapavosti (Rmax) izračunate su pomoću sljedeće formule:

Ra ili Rmax stopa ( posto )=(vrijednost prije tretmana − vrijednost nakon tretmana)/vrijednost prije tretmana × 100 (2)

Svjetlina slika je analizirana pomoću Chromameter CR-400. L* je parametar svjetline i mjeri se sljedećom formulom:

L* stopa rasta ( posto )=(vrijednost prije tretmana − vrijednost nakon tretmana)/vrijednost prije tretmana × 100 (3)

2.20. Statistička analiza

Statistički proračuni IC50 vrijednosti su obavljeni pomoću statističkog softvera OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a svi rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD tri odvojena eksperimenta. Podaci su analizirani nezavisnom uzorkom jednosmjernom analizom varijanse t-testom (jednosmjerna ANOVA), nakon čega je uslijedio Tukeyjev post-hoc test koristeći OriginPro 8.5. Razlike su smatrane značajnim pri p <>

3. Rezultati i diskusije

3.1. Izolacija, selekcija i filogenija odabranih aktivnih sojeva

Iz prikupljenih uzoraka tla izolovano je ukupno 2285 sojeva bakterija. Rezultati skrininga pokazali su da 102 soja bakterija imaju funkcije primjenjive na kozmetičke proizvode (Tablica S4). Na osnovu primarnog skrininga, Streptomyces sp. Utvrđeno je da T65 ima veće aktivnosti za sve kozmetičke primjene, naime, antioksidativno, antielastazno, antitirozinazno i ​​antimikrobno djelovanje. Konačno, soj T65 je odabran za dalju procjenu kako bi se identificirala njegova potencijalna primjena u kozmetici. Filogenetska analiza je pokazala da je soj T65 formirao kladu sa Streptomyces bungoensis DSM 41781T (najbliži soj na osnovu sekvence gena 16S rRNA) sa jakom bootstrap vrijednošću (slika S1).

3.2. Detekcija i sakupljanje bioaktivnog materijala

Mješoviti bioaktivni materijali iz ekstrakta kulture etil acetata T65 sakupljeni su iz Prep-HPLC. Bioaktivni materijali su mjereni na 208, 230, 254 i 280 nm detektorima. Frakcije su sakupljene na osnovu vremena (od 14 min do 21 min). Sakupljene frakcije su isparene do suha i otopljene u metanolu (T65 sirovi proizvod) i korištene su za sve procjene, uključujući antimikrobno djelovanje.

3.3. Citotoksičnost u HaCaT ćeliji

Vijabilnost ćelija u ćelijskoj liniji ljudskih keratinocita (HaCaT ćelija) ostala je nepromenjena od T65 sirovog proizvoda do 10 mg/mL. S druge strane, vitalnost stanica se povećala na način ovisan o dozi kada su primijenjene koncentracije od 10 ng/mL do 10 mg/mL T65 sirovog proizvoda (Slika S2). Ovaj raspon koncentracija rezultirao je sa više od 100 posto vijabilnosti stanica, što ukazuje da je promovirao proliferaciju HaCaT stanica i stoga nije bio toksičan za HaCaT staničnu liniju.

3.4. Antioksidativne aktivnosti

3.4.1. Citotoksičnost u ćeliji RAW264.7

Citotoksičnost sirovog proizvoda T65 procijenjena je vijabilnošću ćelija u makrofagima RAW264.7 metodom MTT testa. Sirovi proizvod T65 nije pokazao citotoksični efekat na ćelijske linije RAW264.7.

Naprotiv, T65 sirovi proizvod je pomogao u proliferaciji ćelija RAW264.7 na način ovisan o dozi kada se tretira sa 13,5 do 1000 ug/mL. Kada je korišćeno 1000 ug/mL T65 sirovog proizvoda, vitalnost ćelija RAW264.7 bila je 118,7 procenata (p < 0,05).="" ovi="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" je="" sirovi="" spoj="" t65="" netoksičan="" do="" 1="" mg/ml="" i="" da="" se="" može="" koristiti="" u="" kozmetičkim="">

3.4.2. Inhibicija proizvodnje azotnog oksida (NO).

Griessov reagens je korišten za određivanje nivoa NO. Za određivanje inhibicije NO, RAW264.7ćelije su tretirane sa 1 ug/mL LPS (lipopolisaharida) zajedno sa različitim koncentracijama T65 sirovog proizvoda. RAW264.7 ćelije su aktivirane LPS-om, a proizvodnja NO je mjerena kao koncentracija nitrita u mediju kulture. U poređenju sa samim LPS-om, T65 sirovi proizvod značajno (p < 0.001)="" inhibira="" koncentraciju="" nitrita="" u="" lps-stimuliranim="" ćelijama="" raw264.7="" na="" način="" ovisan="" o="" koncentraciji="" kada="" se="" koristi="" od="" 15,5="" do="" 125="" ug/ml="" (slika="" 2).="" makrofagi="" su="" bili="" ekspresija="" inducibilne="" no="" sintaze="" (inos)="" nalik="" lps-toll-u="" signaliziranjem="" ćelijske="" aktivacije="" preko="" receptora="" [38].="" lps="" je="" aktivator="" makrofaga="" i="" igra="" važnu="" ulogu="" u="" proizvodnji="" no="" u="" stanicama="" sisara="" [39].="" no="" je="" slobodni="" radikal="" koji="" proizvode="" imunokompetentne="" ćelije="" kao="" što="" su="" makrofagi="" [40].="" proizvodnja="" no="" ima="" fagocitni="" efekat="" na="" makrofage.="" tako="" je="" ćelijska="" linija="" makrofaga="" raw264.7="" odabrana="" za="" antioksidativni="" test.="" dugo="" vremena="" se="" velika="" pažnja="" poklanjala="" potrazi="" za="" prirodnim="" antioksidansima="" koji="" bi="" inhibirali="" proizvodnju="" no="" [41].="" na="" 125="" ug/ml,="" t65="" sirovi="" proizvod="" je="" dovoljno="" smanjio="" nivoe="" no="" za="" 57,4="" posto="" u="" poređenju="" sa="" no="" proizvedenim="" od="" 1="" ug/ml="" lps.="" na="" osnovu="" inhibicije="" no="" proizvedenog="" u="" ćelijskoj="" liniji="" makrofaga="" raw264.7="" izazvanoj="" lps-om,="" ekstrakt="" kulture="" t65="" može="" se="" smatrati="" snažnim="">

DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveennggininggpAerccteivnitayges pri različitim koncentracijama i IC50 vrijednosti T65 sirovog proizvoda date su u Tabeli S5. Askorbinska kiselina (vitamin C) korištena je kao standard jer se koristi u losionima, kremama, serumima i flasterima, za koje je dobro poznato da imaju snažna antioksidativna svojstva za lokalnu primjenu [42]. IC50 za aktivnosti uklanjanja radikala DPPH za sekundarne proizvode vitamina C i T65 je 5,01 odnosno 6,31 ug/mL (Slika 3).

Postoji samo nekoliko studija o antioksidativnim aktivnostima bakterijskih izolata u poređenju s onima iz biljnog materijala, a većina studija se fokusirala na dobro utvrđene biljne proizvode [43–49]. Koncentracija proizvoda od 10 ug/mL bila je u stanju da ukloni 68,66 ± 2,83 posto DPPH slobodnih radikala. IC50 sirovog proizvoda T65 bio je gotovo uporediv s najjačim antioksidansom vitamina C, što je pokazalo da se može koristiti kao antioksidans u formulaciji kozmetičkih preparata.

3.5.1. Citotoksičnost u CCD-986Sk ćelijama

Citotoksičnost sirovih jedinjenja T65 u ćelijama humanih dermalnih fibroblasta (HDF) procenjena je u ćelijskoj liniji CCD-986Sk pomoću MTT testa. Kada je dovedena koncentracija T65 sirovog proizvoda od 0 do 1 mg/mL, HDF ćelije su proliferirale na način ovisan o dozi do koncentracije od 500 ug/mL. Ovaj rezultat je pokazao da sirova jedinjenja iz T65 nisu citotoksična za HDF ćelije. Međutim, utvrđeno je da je koncentracija veća od 1 mg/mL citotoksična, a samo 81,34 posto ćelija je preživjelo u poređenju sa kontrolom (Slika 4).

3.5.2. Proliferacija HDF-a

Proliferacija HDF ćelija određena je pomoću CCD{{0}}Sk ćelijske linije. Sirovi proizvod T65 proliferirao je HDF ćelije na način ovisan o koncentraciji od 0 do 500 ug/mL (Slika 5). Međutim, bio je citotoksičan u koncentraciji od 1 mg/mL. Rast ljudskih dermalnih epitelnih ćelija potvrdio je sposobnost poboljšanja bora kroz promjenu primarnih kultiviranih ćelija izoliranih iz ljudskih dermalnih stanica i izlučenog kolagena [50,51].

3.5.3. Sinteza kolagena tipa I

Sinteza kolagena tipa I otkrivena je ELISA testom. Sirovi proizvod T65 pri 250 pg/mL povećao je koncentraciju kolagena tipa I na način ovisan o dozi do 145,91 posto ± 9,11 posto (srednja vrijednost ± SD; srednja vrijednost od 24, 48 i 72 h). Rezultat tri eksperimenta u 24, 48 i 72 h pokazao je sintezu kolagena tipa I (Slika 6). Dakle, lučenje kolagena u dermalnim ćelijama praćeno rastom ćelija dermalnog epitela čoveka potvrdilo je sposobnost T65 jedinjenja za poboljšanje bora.

3.6. Aktivnosti izbjeljivanja

3.6.1. Citotoksičnost u B16F1 ćelijama

Rezultat citotoksičnosti T65 sirovog produkta na ćelije melanoma B16F1 MTT testom prikazan je na slici 8. Ishod inkubacije sirovog proizvoda T65 u B16F1 ćelijama pokazao je netoksične efekte do koncentracije do 1 mg/mL. B16F1 ćelije su proliferirale na način ovisan o dozi do koncentracije od 62,5 ug/mL, ali je procijenjeno značajno (p < 0.05)="" dozno-zavisno="" smanjenje="" vitalnosti="" ćelija="" sa="" 125="" na="" 1000="" ug/ml.="" međutim,="" pri="" koncentraciji="" od="" 1="" mg/ml="" uočeno="" je="" 99,12="" posto="" ±="" 4,16="" posto="" živih="" stanica="" (slika="" 8).="" eksperimentalni="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" etil="" acetatni="" ekstrakt="" kulture="" soja="" t65="" nije="" citotoksičan="" za="" staničnu="" liniju="" melanoma="" b16f1="" i="" da="" se="" može="" koristiti="" u="" formulaciji="" kozmetičkih="" proizvoda="" za="" izbjeljivanje="" ljudske="">

3.6.2. Inhibicija sinteze melanina u B16F10 ćelijama

Za potvrdu efekta izbjeljivanja, ćelije B16F10, ćelijska linija koja luči i proizvodimelanin u ćelijama. Za promoviranje sinteze melanina, B16F10 je dopunjen sa 1 ug -MSH. Arbutin (100 ug/mL; komercijalno sredstvo za izbjeljivanje) korišten je kao pozitivna kontrola. Mikroskopsko posmatranje ovog eksperimenta pokazalo je gotovo potpunu inhibiciju melanina primjenom 125 ug/mL ekstrakta kulture T65 za 48 h (Slika 9A, B). Ovaj eksperiment je dokazao da ekstrakt kulture T65 ima potencijal da inhibira sintezu melanina na način ovisan o dozi i može se koristiti kao sredstvo za izbjeljivanje za formulaciju kozmetičkih proizvoda za lokalnu primjenu.

3.7. Mesoporozni silicijumski materijali

Mezoporozni materijal je materijal koji sadrži pore promjera od 2 do 50 nm prema nomenklaturi IUPAC (Međunarodne unije za čistu i primijenjenu hemiju), te je stoga mezoporozni materijal silicijum dioksida koji ima pore prečnika 2-50 nm. Ovaj materijal je prijavljen 1970-ih prvo u američkim patentima, ali nije bio dobro zapažen u srodnim poljima, pa je stoga sličan materijal nezavisno istraživao i sintetizirao Japan ponovo 1990. godine [69]. Detaljnije istraživanje pratila je Mobil Corporation Laboratories, te su ovaj materijal nazvali MCM (Mobil kristalni materijal), uz primjere kao što su MCM-41 ili MCM-48, čiji se prečnik mezopora kreće od 2 do 6 nm [70,71]. Druga istraživačka grupa na Univerzitetu Kalifornije, Santa Barbara, uspjela je sintetizirati mezoporozni silicijum dioksida veće veličine (5-30 nm) 6 godina kasnije, i nazvali su ga SBA (Santa Barbara amorfni materijal)-15 [72] . Mesopore silicijumski materijal je isprva dizajniran za upotrebu kao molekularno sito zbog svog strukturnog karaktera, ali je nedavno pronašao širok spektar primjena u isporuci lijekova, katalizatoru, biosenzoru, skladištenju energije i tako dalje.

Postoje različite razlike u SBA-15 i MCM-41 mezoporoznim materijalima. Međutim, najjednostavniji način da se razlikuju ova dva je debljina stijenke silicijum dioksida. SBA-15 sa debljim zidom od silicijum dioksida ima stabilniju i čvršću strukturu u poređenju sa MCM-41, koji ima tanju debljinu zida. Štaviše, sintetički metod SBA-15 je jednostavniji od MCM-41. Zbog ovih razlika, SBA-15 je odabran da nosi bioaktivni T65 sirovi proizvod unutar mezopore silicijumskog materijala.

3.8. Sinteza mezoporoznih čestica silicijum dioksida

Nakon što je proces kalcinacije sproveden na 200 ◦C tokom 2 h i 600 ◦C tokom 3 h u kontinuitetu, dobijen je beli silicijum mezoporozni prah. Ovim procesom je sintetizovan SBA{4}} od 8 nm pora. Utvrđeno je da su veličine čestica SBA-15 11,539–13,630 mm u prečniku (slika S4) i određene su pomoću dva različita objekta: laboratorija Univerziteta Inha i laboratorija nacionalnog univerziteta Changwon. Osim toga, svih šest uzoraka na slici S4 sintetizirano je istom metodom, ali različitom serijom.

Kada je smjesa održavana na 60 ◦C i ostavljena 4 dana u statičkim uslovima slijedeći gornju metodu, upoznat je SBA-15 pora od 5 nm. Dodatno, kada je temperatura kontrolisana na 120 ◦C, sintetizovan je SBA-15 od 10 nm. Prema rezultatima, veličina mezopora se može kontrolirati ovisno o procesu starenja [73]. SBA-15 od 10 nm pora (Slika 11) je korišten za dalju obradu jer nanomaterijali mezoporoznog silicijum dioksida s velikim porama imaju bolje djelovanje za isporuku biomolekula od uskih pora [74].

3.9. Evaluacija održivog učinka

Da bi se utvrdilo da li mezoporozni SBA-15 ima sposobnost kontrolisanog oslobađanja, SBA-15 i T65 sirovi proizvod su kombinovani zajedno u DI vodi, metanolu, acetonitrilu ili rastvaraču etilen glikola. Kada su SBA-15 i voda pomiješani, otopina je postala kaša zbog koagulacije između površine silicijum dioksida i vode. Metanol je bio dobar rastvarač i za silicijum i za T65 sirovi proizvod. Međutim, zbog toksičnosti, metanol je zamijenjen acetonitrilom. Čestice za omjer imerzije T65 određene su PV vrijednosti (Tablica S13). Kao što je prikazano u Tabeli S13, PV vrijednost SBA-15 se smanjila nakon potapanja sa T65 sirovim proizvodom. Ovo je pokazalo da su materijali T65 dobro uronjeni unutar čestica mezoporoznog silicijum dioksida.

Da bi se utvrdilo da li postoji T65 unutar čestice, sam T65 je ispitan pomoću HPLC (slika S5). Kao što pokazuju podaci, postojala su dva specifična vrha (unutar crvene kutije) koja su uvijek bila vidljiva u slučaju ekstrakata kulture T65, iako je serija preparata T65 promijenjena. Ova dva pika su imala vrijeme zadržavanja od 10 min i 12 min na 230 nm. Uzorak filtrata je ispitan u HPLC kako bi se utvrdilo da li je T65 prisutan unutar ugrađenog SBA-15. Kao što je prikazano na slici S6, dva specifična pika su uočena blizu 10 min i 12 min. Nadalje, uočen je mali vrhunac blizu 18 minuta vremena zadržavanja, što je vrlo važno za praćenje proizvoda T65 koji se vremenski otpuštaju.

Slika 12 predstavlja kontrolisano izdavanje održivog testa T65 ugrađenog SBA-15 od 0 do 3 dana. Specifični vrh T65 bio je vidljiv blizu 15 i 20 min od dana 0 do 3. Sirovi proizvodi T65 su pravilno uronjeni i postepeno su se lučili tokom vremena. Osim toga, mezoporozni materijali od silicijum dioksida (SBA-15) predloženi u ovoj studiji mogli bi nositi fiziološki aktivne tvari u T65 sirovom proizvodu i potvrdili da su se fiziološki aktivne tvari oslobađale na način odloženog oslobađanja nakon punjenja. Štaviše, mezoporozni materijal silicijum dioksida predložen u ovoj studiji mogao bi se u budućnosti koristiti kao dobar nosač za impregnaciju različitih funkcionalnih materijala i kao materijal sa produženim oslobađanjem podržavajući različite fiziološki aktivne supstance.

4. Zaključak

Sekundarni bioaktivni materijali ekstrahovani iz mikroorganizama u zemlji su od interesa za kozmetičku primjenu zbog svog antimikrobnog, antioksidativnog, protiv bora, izbjeljivanja kože i antimikrobnog djelovanja. Ova studija opisuje novu aktivnost etil acetatnog ekstrakta kulture soja T65 za funkcionalne sastojke u kozmetičkim formulacijama. Sirovi proizvod T65 nije bio toksičan za različite ćelijske linije, kao što su HaCaT (ljudski keratinocit), RAW264.7 (ćelija makrofaga), CCD-986Sk (ćelija fibroblasta ljudske kože) i B16F1 i B16F10 ćelije melanoma . Osim toga, sirovi proizvod T65 pokazao je pojačanu regulaciju sinteze kolagena tipa I, što je vrlo važno za smanjenje bora na koži. Nadalje, T65 sirovi proizvod je dovoljno inhibirao ljudske patogene bakterije kao što su B.subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus i S. epidermidis, što može pomoći u sprječavanju kvarenja kozmetičkog proizvoda i kolonizacije patogenih bakterija formiranje acne vulgaris na ljudskoj koži. Štaviše, T65 sirovi proizvod inhibira tirozinazu gljiva za učinak izbjeljivanja i svinjsku pankreasnu elastazu za aktivnosti protiv starenja, te inhibira NO i DPPH radikale za antioksidativno djelovanje. Sinteza mezoporoznih čestica silicijum dioksida, SBA-15, dokazala je da bi sirovi proizvod T65 bio efikasan u kozmetičkim formulacijama sa efikasnim svojstvima kontrolisanog oslobađanja. Konačno, in vivo primjena formulisanog kozmetičkog proizvoda zajedno sa T65 sirovim proizvodom na lica volontera dokazala je učinak T65 izbjeljivanja i protiv bora. Međutim, kemija različitih bioaktivnih spojeva i molekularni mehanizmi povezani s različitim aktivnostima inhibicije enzima i inhibicije patogena tek treba otkriti. Zaključno, naša studija je snažno podržala ideju da se bakterijski resursi mogu dodati kozmetičkim proizvodima za lokalnu primjenu za učinak izbjeljivanja, stvaranje bora, antioksidativni učinak i antimikrobno djelovanje.

cistanche pharma special

Za više detalja kliknite ovdje.