Detekcija povišenog nivoa tetrahidrobiopterina u uzorcima seruma ME/CFS pacijenata sa ortostatskom netolerancijom: pilot studija

sažetak:Mijalgični encefalomijelitis ili sindrom hroničnog umora (ME/CFS) je multisistemska hronična bolest koju karakteriše jak umor mišića, bol, vrtoglavica i zamagljivanje mozga. Mnogi pacijenti sa ME/CFS doživljavaju ortostatsku netoleranciju (OI), koju karakterizira česta vrtoglavica, vrtoglavica i osjećaj nesvjestice dok drže uspravan položaj. Uprkos intenzivnom istraživanju, molekularni mehanizam ovog iscrpljujućeg stanja je još uvijek nepoznat. OI se često manifestira kardiovaskularnim promjenama, kao što su smanjeni cerebralni protok krvi, sniženi krvni tlak i smanjen broj otkucaja srca. Bioraspoloživost tetrahidrobiopterina (BH4), esencijalnog kofaktora enzima endotelne azot oksid sintaze (eNOS), usko je povezana sa kardiovaskularnim zdravljem i cirkulacijom. Da bi se istražila uloga BH4 u ME/CFS, uzorci seruma pacijenata sa CFS (n=32), CFS pacijenata samo sa OI (n=10; CFS + OI) i CFS pacijenata sa OI i polineuropatija malih vlakana (n=12; CFS + OI + SFN) podvrgnuti su BH4 ELISA testu. Zanimljivo je da su naši rezultati otkrili da je ekspresija BH4 značajno visoka kod pacijenata sa CFS, CFS + OI i CFS + OI + SFN u poređenju sa kontrolnom skupinom koja odgovara starosti/polu. Konačno, test proizvodnje ROS u kultivisanim mikroglijalnim ćelijama praćen Pearsonovom korelacionom statistikom je pokazao da bi povišeni BH4 u uzorcima seruma pacijenata sa CFS + OI mogao biti povezan sa odgovorom na oksidativni stres. Ovi nalazi sugeriraju da bi regulacija metabolizma BH4 mogla biti obećavajuća meta za razumijevanje molekularnog mehanizma CFS i CFS sa OI.

Cistanche može djelovati kao sredstvo protiv umora i poboljšanja izdržljivosti, a eksperimentalne studije su pokazale da dekocija Cistanche tubulosa može učinkovito zaštititi hepatocite jetre i endotelne stanice oštećene kod miševa koji plivaju s teretom, pojačati ekspresiju NOS3 i promovirati glikogen u jetri. sintezu, čime se postiže efikasnost protiv umora. Ekstrakt Cistanche tubulosa bogat feniletanoidnim glikozidima može značajno smanjiti serumsku kreatin kinazu, laktat dehidrogenazu i nivoe laktata i povećati nivo hemoglobina (HB) i glukoze kod ICR miševa, a to bi moglo igrati ulogu protiv umora smanjujući oštećenje mišića i odgađanje obogaćivanja mliječne kiseline za skladištenje energije kod miševa. Tablete Compound Cistanche Tubulosa značajno su produžile vrijeme plivanja za nošenje težine, povećale rezervu glikogena u jetri i smanjile nivo uree u serumu nakon vježbanja kod miševa, pokazujući svoj efekat protiv umora. Uvarak od cistanchisa može poboljšati izdržljivost i ubrzati otklanjanje umora kod miševa koji vježbaju, a može smanjiti i povišenje serumske kreatin kinaze nakon opterećenja i održati ultrastrukturu skeletnih mišića miševa normalnom nakon vježbanja, što ukazuje da ima efekte za jačanje fizičke snage i protiv umora. Cistanchis je također značajno produžio vrijeme preživljavanja miševa otrovanih nitritima i poboljšao toleranciju na hipoksiju i umor.

Kliknite na Over Fatigue

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Ključne riječi:ME/CFS; tetrahidrobiopterin; ortostatska intolerancija; polineuropatija malih vlakana; endotelni NOS; reaktivne vrste kiseonika

1. Uvod

Mijalgični encefalomijelitis/sindrom hroničnog umora (ME/CFS) je kronična multisistemska bolest koju karakterizira iscrpljujući zamor mišića, bol, vrtoglavica i magla u mozgu [1,2]. Podskup pacijenata sa ME/CFS pokazuje tešku ortostatsku hipotenziju [3] koju karakteriše značajan pad krvnog pritiska koji uzrokuje vrtoglavicu i nesvjesticu dok stoje u uspravnom stanju [4]. Ovo stanje se često naziva ortostatska intolerancija (OI). Podskup pacijenata sa OI takođe ispunjava dijagnostičke kriterijume za polineuropatiju malih vlakana [5,6] koja se dijagnostikuje korišćenjem Kongo crvenog bojenja za amiloidozu u uzorcima biopsije kože [7]. Uprkos intenzivnom istraživanju, molekularni mehanizam OI nije poznat.

BH4 je važan kofaktor metabolizma aminokiselina [8]. Aminokiseline, kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan, pretvaraju se u važne stanične intermedijere djelovanjem enzima hidroksilaze. BH4 služi kao esencijalni kofaktor svih ovih enzima hidroksilaze [9-11]. Shodno tome, bioraspoloživost BH4 je kritična za sintezu neurotransmitera, kao što su dopamin i serotonin [10]. Osim ovih enzima hidroksilaze, BH4 također regulira funkciju enzima azot oksid sintaze i kontrolira proizvodnju dušikovog oksida (NO) u endotelu [12]. Endotelna proizvodnja NO pojačava vazodilatacijski odgovor, snižava krvni tlak i pomaže opuštanju mišića [13,14]. S druge strane, u prisustvu oksidativnog stresa, BH4 se odvaja od proizvodnje NO izazvane eNOS-om [15] i direktno povećava odgovor mitohondrijalnog stresa u srčanom tkivu [16] i skeletnim mišićima [17]. Stoga je regulacija metabolizma BH4 kritična za kardiovaskularnu funkciju i zdravlje cirkulacije. Budući da je prijavljeno da pacijenti sa OI pokazuju kardiovaskularne abnormalnosti, zainteresovani smo za proučavanje jesu li pacijenti sa OI izmijenili metabolizam BH4. Do sada nije bilo studije koja istražuje ulogu metabolizma BH4 u CFS. Štaviše, naša studija također istražuje da li su pacijenti sa CFS sa OI promijenili biosintezu BH4.

Uzorci seruma od 66 ispitanika uključeni su u studiju sa n=32 CFS i n=34 kontrolama. Urađena je dvostruko zaslijepljena kvantitativna ELISA da bi se uporedili nivoi BH4 između zdravih kontrola i pacijenata sa CFS. Zanimljivo je da smo primijetili da je došlo do snažnog povećanja BH4 kod pacijenata sa CFS u poređenju sa zdravim kontrolama. Upoređujući nivo BH4 između pacijenata sa CFS sa OI (n=10) i kontrolama koje odgovaraju starosti/polu (n=10), takođe smo primetili da pacijenti sa CFS sa OI imaju značajno viši nivo BH4 u serumu. Zajedno, naš trenutni rukopis naglašava da bi povišenje serumskog BH4 kod pacijenata sa CFS moglo igrati ključnu ulogu u patogenezi OI.

2. Rezultati

Subjekti uključeni u studiju: Da bi se kvantifikovali nivoi BH4 u uzorcima seruma, ukupno 66 ljudi je uključeno u studiju. Tabela 1 sumira starost, pol, etničku pripadnost i postojeće stanje ovih subjekata. Četiri ispitanika iz kontrolne grupe imala su komplikacije povezane s rakom i stoga su isključeni iz konačne analize. Minimalna, srednja i maksimalna starost kontrolne grupe su 18, 64,5 i 82 godine, respektivno. Za CFS grupu, ove vrijednosti su 26, 59 i 76 godina. Grafikon distribucije učestalosti starosti u obje grupe pokazao je sličnu iskrivljenost, a naknadni Bland-Altmanov test analize otkrio je da je prosjek razlika blizu nule što sugerira da nema pristranosti u pogledu starosti. Kontrolnu grupu činilo je 44% muškaraca i 56% žena, dok je CFS grupu činilo 41% muškaraca i 59% žena. Svi pacijenti su bili bijelci i živjeli su u geografskoj regiji Sjeverna Nevada i Kalifornija.

Populacija pacijenata sa ME/CFS je upisana na osnovu kanadskih 2003 i Fakuda kriterijuma za ME/CFS. Ispunili su i dijagnostičke kriterijume za SCID (novi naziv ME/CFS koji je ustanovio Institut za medicinu). Kontrole su bile prilagođene uzrastu/polu sa ispitanicima CFS-a koji su takođe bili pozvani zajedno sa pacijentima u Kliniku za internu medicinu dr. Petersona.

CFS + OI i CFS + OI_SFN podskupovi su uspostavljeni putem zapisa o dijagnostičkom testiranju (pregled medicinske karte - kompletan) i kliničke korelacije. Na primjer, ljudi s OI su se prijavili u ordinaciju s modificiranim pozitivnim NASA testom mršavosti (koji pokazuje OI) i svi su primili terapiju proširenja volumena IV (fiziološki rastvor). SFN pacijenti su imali uzorke biopsije. Za uključene CFS + OI + SFN subjekte, snimljen je izvještaj Mass General Hospital, u kojem je izvršeno bojenje Kongo crvenom bojom radi brojanja gustine neurita u bočnom mišićnom tkivu skočnog zgloba.

Nivo BH4 je visok u uzorcima seruma pacijenata sa ME/CFS: Ukupno, 32 CFS i 34 kontrolna subjekta su uključena u studiju (Tabela 1) za mjerenje nivoa BH4 u serumu kompetitivnim ELISA testom. Standardna kriva BH4 ELISA bila je eksponencijalna kriva negativnog nagiba koja je izvedena iz šest rastućih koncentracija BH4 standarda (5, 10, 25, 50, 10{{52 }} i 150 ng/mL). Nagib i presek standardne krive korišteni su za mjerenje apsolutnih nivoa BH4 od vrijednosti OD. Serijsko razrjeđivanje uzoraka seruma praćeno BH4 ELISA testom otkrilo je da je razrjeđenje seruma 1:2 dalo najkontrastnije rezultate u poređenju sa slijepim probom ili pozadinom. Stoga su svi uzorci seruma razrijeđeni 1:2. Zanimljivo je da je dvostruko zaslijepljena ELISA analiza praćena neparametarskim Mann-Whitneyjevim U testom [* p < 0,05 (=0.033); U=304.5] je otkrio da su nivoi BH4 bili značajno viši kod n=32 pacijenata sa CFS u poređenju sa n=28 kontrolnih subjekata (Slika 1A). Četiri ispitanika (n=4) u kontrolnoj grupi isključena su zbog već postojećih karcinoma. Budući da su ispitanici uključeni nasumično, bez obzira na njihovu dob i spol, željeli smo analizirati korelaciju nivoa BH4 sa dobi i spolom ispitanika. U skladu s tim, neparametrijska Spearmanova korelacijska analiza (Slika 1B) otkrila je da ne postoji korelacija između nivoa BH4 i starosti ispitanika' (Spearman r=-0.1657; p=0.1835). Zatim smo uporedili nivo BH4 između muških i ženskih ispitanika (slika 1C). Za procjenu značaja između muškarca i žene (efektor #1 je spol), kao i između kontrolne i CFS (efektor #2 je zdravstveno stanje), izvršena je dvosmjerna ANOVA analiza. Shodno tome, ispitanici muškaraca i žena nisu pokazali nikakvu značajnu razliku u nivoima BH4 (p > 0,05; =0.3496). Međutim, postojala je značajna razlika u BH4 između kontrolnih i CFS ispitanika (p < 0,05; =0.0375) bez obzira na spolnu razliku.

Budući da je trenutna kohorta striktno ograničena na istu geografsku oblast, etničku pripadnost i iz prakse jednog ljekara, analiza BH4 u parovima između slučajeva i kontrola koja odgovara dobi i spolu bila bi uvjerljivija. Upoređeno je ukupno 15 parova (slika 1D). Neparametarski Wilcoxonov test rangiranja podudarnih parova sa potpisom otkrio je da pacijenti sa CFS imaju značajno veći BH4 (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alfa ({{0}}.05)]. Budući da su svi uzorci CFS i kontrolni uzorci upareni sa uzrastom i spolom, urađena je analiza poređenja u paru. Naknadni upareni t-test (t1,9=3.834; ** p < 0.01=0.004) pokazao je da uzorci seruma CFS + OI imaju značajno veći BH4 u poređenju sa kontrolnim uzorcima seruma (Slika 2C ). Kumulativni statistički test kolone (Slika 2D) je dalje otkrio da je 7 od 10 pacijenata sa CFS + OI imalo značajno više nivoe BH4 od medijane (=99.63 ng/mL). S druge strane, samo 2 od 10 kontrolnih ispitanika imalo je veći BH4 od medijane vrijednosti. Zbirno, ovi podaci sugeriraju da su pacijenti sa CFS + OI imali značajno veći BH4 u poređenju sa kontrolnim subjektima.

Podskup pacijenata sa CFS (n=12) ima i OI i SFN. Poređenje nivoa BH4 (Slika 3A) između zdravih kontrolnih i CFS + OI + SFN ispitanika otkrilo je da pacijenti sa CFS + OI + SFN imaju značajno viši nivo BH4 [t1,22=2.371; * str<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Upoređujući nivoe BH4 između samo CFS i pacijenata sa CFS + OI, uočili smo da uzorci seruma pacijenata sa CFS + OI (n=14) imaju više nivoe BH4 (Slika 4A) u poređenju sa onima kod kontrolnih subjekata (n {{ 6}}). Analiza QQ dijagrama pokazuje da je distribucija podataka normalna u obje grupe (slika 4B), što sugerira da se parametarski test može usvojiti za poređenje srednjih vrijednosti. Shodno tome, neupareni t-test za analizu značajnosti srednje vrijednosti između grupa otkrio je jaku razliku [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Statistika kolone odabrane kohorte (n=22) ukazuje da je 9 od 14 pacijenata sa CFS + OI imalo viši nivo BH4 u serumu u poređenju sa medijanom od 119,7 ng/mL (Slika 4C). Uzeti zajedno, naši rezultati sugeriraju da pacijenti sa CFS sa OI imaju povišene nivoe BH4 u serumu. Zajedno, naš trenutni rukopis identifikuje BH4 kao potencijalni biomarker koji se prenosi krvlju za pacijente sa CFS + OI i CFS + OI + SFN.

Povišeni nivoi BH4 mogu biti povezani sa povećanim oksidativnim stresom: Da bismo razumjeli funkcionalnu važnost povišenog BH4 u serumu, istražili smo sposobnost induciranja ROS uzoraka seruma pacijenata sa CFS-om sa OI (n=10). DCFDA-infuzirane mikroglijalne ćelije tretirane su 1:2 razrijeđenim uzorcima seruma iz 10 CFS + OI i 10 kontrola usklađenih po dobi/polu tokom 90 minuta, nakon čega je mjerena proizvodnja ROS pomoću čitača fluorescentnih ploča (npr. Em { {12}} nm/535 nm) kao što je opisano u odjeljku o materijalima i metodama. Kao što smo ranije izvijestili [18], analiza histograma je pokazala da su kapaciteti za proizvodnju ROS uzoraka seruma CFS + OI bili značajno veći od kontrolnih uzoraka seruma (Slika 5A) [t1,18=2.541; p < 0,05 (=0.0205)]. Pošto su sve tačke podataka u obe grupe bile normalno raspoređene (Slika 5B), izvršili smo parametarski test da bismo proučavali značajnost srednje vrednosti između grupa. Zanimljivo je da je statistička analiza Pearsonove korelacije u ovoj kohorti otkrila da postoji umjereno pozitivna korelacija između nivoa BH4 i proizvodnje ROS, što sugerira da bi povišeni nivoi BH4 u uzorcima seruma CFS + OI mogli biti povezani s povećanim oksidativnim odgovorom (Slika 5C).

Uzeto zajedno, naš trenutni rukopis naglašava da su pacijenti sa CFS povezani sa povišenim nivoima BH4 u serumu i da je povećana regulacija značajnije uočena kod pacijenata sa CFS sa OI. Štaviše, povišeni BH4 može biti povezan s odgovorom na oksidativni stres naglašavajući potencijalnu ulogu metabolizma BH4 u patogenezi CFS i CFS sa OI (Slika 5D).

3. Diskusija

Biosinteza tetrahidrobiopterina (BH4) je strogo reguliran metabolički proces u zdravlju, a njegova abnormalna ekspresija povezana je s nizom bolesti. Njegov nedostatak dovodi do metaboličkog deficita metabolizma aminokiselina [19,20], poremećaja regulacije dopamina [21] i poremećaja protoka krvi [22,23] i povezan je s hipertenzijom, dijabetesom, aterosklerozom, starenjem i drugih metaboličkih poremećaja. S druge strane, pojačana biosinteza BH4 ometa proizvodnju mitohondrijalne energije [24], inducira oksidativni stres [25] i povećava oštećenje autofagije [26]. Povišen BH4 je takođe povezan sa smanjenjem krvnog pritiska [27] indukcijom vazodilatativnog odgovora putem aktivacije endotelnog NOS [28]. Stoga, pojačana biosinteza BH4 može direktno promovirati smanjenje krvnog tlaka ili hipotenzije. Studija sugerira da nedostatak BH4 smanjuje hipotenziju izazvanu LPS-om kod miševa [23]. Do sada, uloga metabolizma BH4 nije istraživana kod pacijenata sa CFS, posebno kod pacijenata sa CFS sa OI. Stoga je naš cilj bio procijeniti serumsku ekspresiju BH4 u ovoj populaciji pacijenata. Iznenađujuće, naša ELISA analiza je otkrila da su uzorci seruma pacijenata sa CFS imali značajno više nivoe BH4 u poređenju sa zdravim kontrolnim subjektima koji su odgovarali dobi i spolu. Shodno tome, Spearmanova statistika korelacije je pokazala da ne postoji značajna korelacija povećanja BH4 u odnosu na dob i spol, što poništava mogućnost oštećenja biosinteze BH4 zbog starosti ili spola kod ovih pacijenata.

Zatim smo primijetili da su uzorci seruma pacijenata sa CFS + OI također pokazali snažno povišenje BH4 u poređenju sa uzorcima seruma kontrolnih grupa koje odgovaraju dobi i spolu. Naša kumulativna statistika u koloni je otkrila da je 7 od 10 pacijenata sa CFS + OI imalo izuzetno visoke nivoe BH4, što sugerira da bi povišenje BH4 u serumu moglo biti povezano s patogenezom OI. Rezultat je dodatno potkrijepljen kada je podskupina pacijenata sa CFS + OI sa polineuropatijom malih vlakana (SFN) također pokazala visoku ekspresiju BH4 u svojim uzorcima seruma u poređenju sa kontrolnom skupinom koja odgovara dobi i polu. Zanimljivo je da je poređenje nivoa BH4 u serumu između samo CFS i CFS pacijenata sa OI pokazalo da postoje značajno povišeni nivoi BH4 kod pacijenata sa OI.

Kako povišen BH4 doprinosi patogenezi ME/CFS? Postoji više puteva pomoću kojih bi povišeni BH4 mogao direktno doprinijeti patogenezi ME/CFS (Slika 5D). Prvo, prijavljeno je da regulacija BH4 uzrokuje mitohondrijalno oštećenje energetskog metabolizma putem inhibicije kompleksa I i IV lanca transporta elektrona, što rezultira smanjenjem potencijala mitohondrijalne membrane, oslobađanjem citokroma C i apoptozom [24]. Izloženost BH4 također uzrokuje oksidativni stres [29]. Iako fiziološki BH4 podržava endotelnu proizvodnju NO aktivacijom eNOS-a, oksidacija BH4 superoksidom ga odvaja od eNOS-a, što uzrokuje oksidativni stres u srčanom tkivu i utiče na kardiovaskularno zdravlje (Slika 5C). U prilog tome, naši rezultati su pokazali da povišeni nivoi BH4 u uzorcima seruma CFS + OI imaju pozitivnu korelaciju sa sposobnostima induciranja ROS. Štaviše, BH4 također aktivira mete rapamicin kompleks1 (mTORC1) kinaze kod sisara kako bi narušio autofagiju. Ranije smo izvijestili da bi aktivacija mTORC1 i naknadno oštećenje autofagije mogli biti povezani s ME/CFS patogenezom. Prijavljeno je da i mTORC{16}}zavisno oštećenje autofagije [18] i mitohondrijski nedostatak energetskog metabolizma [30] doprinose patogenezi ME/CFS. Prema tome, povišenje nivoa BH4 u uzorcima seruma pacijenata sa ME/CFS može izazvati oksidativni stres i povećati odvajanje eNOS-a, praćeno kardiovaskularnim stresom, hipotenzijom, mitohondrijalnom toksičnošću i oštećenjem autofagije kod pacijenata sa CFS.

4. Materijali i metode

Pribavljanje uzorka: Nabavka uzorka, deidentifikacija i plan skladištenja su razmatrani prije [18]. Ukratko, uzorci krvi i podaci iz upitnika prikupljeni su pod nadzorom dr. Daniela Petersona (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, SAD) (Western IRB) #20201812. Uzorci krvi su centrifugirani, a uzorci seruma su alikvoti i zatim odmah zamrznuti na -80 ◦C. Svaki uzorak je dobio jedinstveni identifikacioni broj i evidentiran u svesku i Microsoft Excel sa datumom i potpisom prema protokolu koji je odobrila IRB. Uzorci su zatim dostavljeni u naš istraživački centar u Wisconsinu na suhom ledu preko noći. Po prijemu, uzorci su odmah obrađeni i analizirani. Upitnici i neidentifikovani klinički podaci pohranjeni su u sigurnoj bazi podataka Redcap servera s ograničenim pristupom kojom upravlja istraživačko osoblje i klinički saradnik u Sierra Internal Medicine. Evidencija pacijenata je vođena prema smjernicama politike privatnosti koje je postavila Sierra Internal Medicine. Podgrupe pacijenata sa ME/CFS u grupama OI i OI + SFN ustanovljene su korištenjem slijepog pregleda, a klinička PI potvrdila je postlaboratorijsku analizu. Četiri pacijenta od raka slijepo su uključena u ovu analizu i poslužila je kao kontrola pozitivna na bolest.

Dijagnostički kriteriji za OI uključivali su relevantne nalaze (rezultate tablice nagiba srca) iz pregleda kliničke karte. Osim toga, u vrijeme uzimanja krvi, klinički saradnik je završio NASA-inu mršavu analizu. SFN dijagnoza je postavljena pregledom kliničke karte i histološkim pregledom biopsije kože punchom sakupljene iz pretibijalne regije. Biopsije kože su nezavisno procenjene u Općoj bolnici Massachusetts za morfometrijsku kvantitaciju epidermalnih nervnih završetaka radi proučavanja gustine neurita površine kože.

BH4 kompetitivna ELISA: Nivo BH4 je izmjeren i kvantificiran u uzorcima seruma pacijenata sa ME-CFS i zdravih kontrola odgovarajuće dobi prema uputama proizvođača (kompetitivni ELISA komplet za humani BH4; Dobavljač: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, SAD; Cat # MBS733839). Komplet je validiran u našoj laboratoriji (Perkin Elmer Victor X3 multimodalni čitač ploča, Perkin Elmer, Waltham, MA, SAD) i imao je standardnu ​​krivu (R2=0.98) i osjetljivost od samo 1 ng/mL koncentracija u odnosu na pozitivnu kontrolu. Ukratko, uzorci seruma su razrijeđeni razblaživačem za analizu (ili 1× PBS), a zatim pipetirani na mikroploču koja je prethodno obložena poliklonskim anti-BH4 antitijelom. Nakon 30 minuta inkubacije sa uzorkom, BH4-HRP konjugat je dodat na ploču i inkubiran još 1 h na 37 ◦C. Preostali uzorci seruma su dekantirani i isprani na ploči sa 1× puferom za ispiranje (alternativno, sa 1× PBS-T) tri puta po pet minuta koristeći višekanalnu pipetu. Nakon ispiranja, svaka jažica je reagovala sa TMB supstratom 10 minuta u mraku. Do razvoja boje dolazi nakon 10 minuta inkubacije supstrata uz mućkanje. BH4-HRP konjugat će se nadmetati sa serumom BH4 da se veže za obloženo primarno antitijelo. Stoga, što je više seruma BH4 u uzorku, to bi se manje vezivanja BH4-HRP-a pojavilo i na taj način stvorilo manje boje. Ukupno 66 uzoraka seruma (34 kontrolna + 32 ME-CFS pacijenta) je prikupljeno (detalji u odjeljku "nabavka uzoraka") uz odgovarajuće institucionalne regulatorne smjernice i analizirano pod GLP uslovima. Distribucija uzorka bila je nasumična, a test je bio dvostruko slijep, kao što je opisano u odjeljku "Opravdanje veličine uzorka".

Opravdanje veličine uzorka i statistička analiza: Veličina uzorka je opravdana korištenjem sljedeće jednačine. Veličina uzorka {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z je z rezultat, koji je 1,28 za snagu 0.8. p je udio stanovništva; za interval pouzdanosti od 95%, p će biti {{20}}.95. ε je granica greške, koja je 0,05. Stoga, da bi se postigla značajnost razlike srednje vrijednosti između grupa pri p < 0,05, uključeno je ukupno n=32 uzoraka po grupi. Za poređenje između kontrolnih i pacijenata sa CFS + OI, uključeno je n=10 uzoraka po grupi. Slična veličina uzorka je uključena prilikom poređenja kontrolnih i kontrolnih +OI + SFN grupa. Proračun veličine uzorka je izveden na osnovu ε=0.05 i p=0.99. Usvojen je neparametarski Mann-Whitney U test da se testira značajnost srednje vrijednosti između dvije grupe kad god su dvije grupe pokazale identične i normalne raspodjele podataka; inače je izveden parametarski nespareni t-test. Za uparene analize između grupa, izveden je parametarski upareni t-test ako su tačke podataka iz obje grupe bile normalno raspoređene; u suprotnom, izvršen je Wilcoxonov rang test da bi se procijenila značajnost između grupa. Dvosmjerna ANOVA sa post hoc Bonferronijem ili Tukeyjem je primijenjena da se testira značajnost srednje vrijednosti u više od dvije grupe uzimajući u obzir pol (muško ili žensko) i zdravlje (zdravo ili CFS) kao efektore. Sve statističke analize su obavljene u softveru GraphPad Prism verzija 9.5.1 (733) (Boston, MA 02110, SAD).

ROS analiza:HMC3 ljudske embrionalne mikroglijalne ćelije su uzgajane i pasirane sa kompletnim DMEM medijumom. Ukratko, HMC3 ćelije su postavljene u ploču sa 96 jažica za ROS fluorometrijsku studiju. Ćelije su uzgajane do 75-80% konfluencije i inkubirane sa DCFDA sondom (Cat# ab113851; Abcam, Cambridge, UK) 45 minuta na 37 ◦C u mraku. Standardna podloga je zamijenjena sa 100 µL (1:2 razrjeđenje=50 µL seruma + 50 µL medija) medija obogaćenog serumom tokom 90 minuta da bi se postigla optimalna vrijednost fluorescencije. Na kraju perioda inkubacije, medij je aspiriran, a zatim je izmjerena ekscitacija-emisija koristeći setove filtera od 485 nm i 535 nm u čitaču ploča PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, SAD).

Doprinosi autora:AR je osmislio ideju, dizajnirao, izvršio istraživanje i napisao rukopis. CGG je izvršio istraživanje i napisao rukopis. RW je pomogao u prikupljanju uzoraka krvi i vođenju kartona pacijenata. DP je klinički PI, koji je bio zadužen za prikupljanje biouzoraka, upitnika i odobrenje IRB-a. Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

finansiranje:Ovaj rad je podržala Simmaron Research Inc., neprofitna istraživačka organizacija 501C, Incline Village, NV 89451, kao rezultat sredstava od Ramsay Award 2023 za AR od strane Solve ME inicijative i Fondacije Hesse Sibylla, Quebec, QC, Kanada.

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:Nijedan dio ovog istraživačkog članka, uključujući slike i tekstove, nije ranije objavljen ili reproduciran u bilo kojoj knjizi, članku ili drugoj objavljenoj literaturi. Slike su originalne i nisu kopirane iz bilo kojeg drugog izvora. Ovo nije kliničko ispitivanje, već institucionalna opservacijska studija. Prikupljanje biouzoraka, smjernice za upitnike, vođenje evidencije i generiranje jedinstvenih identifikacijskih brojeva obavio je Western IRB, protokol #20201812 (Trenutni datum obnove # 21.7.23).

Izjava o informiranom pristanku:Svi autori dali su saglasnost za objavljivanje ovog preglednog članka.

Izjava o dostupnosti podataka:Ne postoji elektronski list sa podacima koji je povezan sa ovim radom. Nema podataka u elektronskom spremištu.

Sukobi interesa:AR, CGG, RW i DP zaposleni su Simmaron Research INC, 501C neprofitne istraživačke organizacije. Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Skraćenice

ME/CFS=Mijalgični encefalomijelitis ili sindrom hroničnog umora; OI=Ortostatska intolerancija; SFN=polineuropatija malih vlakana; BH4=tetrahidrobiopterin; eNOS=endotelna azot oksid sintaza; NE=Dušikov oksid. ROS=Reaktivne vrste kiseonika. ME/CFS=Mijalgični encefalomijelitis ili sindrom hroničnog umora; OI=Ortostatska intolerancija; SFN=polineuropatija malih vlakana; BH4=tetrahidrobiopterin; eNOS=endotelna azot oksid sintaza; NE=Dušikov oksid; i ROS=Reaktivne vrste kiseonika.

Reference

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, SW; Lee, SH; Sin, CG Sistematski pregled i meta-analiza prevalencije sindroma hroničnog umora/mijalgijskog encefalomijelitisa (CFS/ME). J. Transl. Med. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Sin, C.-G. Pregled prevalencije hroničnog umora u svijetu. J. Korean Med. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BiH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Fiziološka procjena ortostatske netolerancije kod sindroma kroničnog umora. J. Transl. Med. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Bateman, L.; Bested, AC; Bonilla, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, ME; Dowell, TG; Felsenstein, D. Mijalgični encefalomijelitis/sindrom hroničnog umora: Osnove dijagnoze i upravljanja. In Mayo Clinic Proceedings; Elsevier: Amsterdam, Holandija, 2021; str. 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Staršinova, AA; Dori, A.; Zinčenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Definicija neuropatije malih vlakana, dijagnoza i liječenje. Neurol. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Branch, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Kompleksni sindromi kronične boli, umora i kognitivnog oštećenja povezani s autoimunom disautonomijom i neuropatijom malih vlakana. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Ne, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et al. Naslage amiloida na koži i gubitak nervnih vlakana kao markeri nastanka i progresije neuropatije kod nasljedne transtiretinske amiloidoze. EUR. J. Neurol. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Metabolizam tetrahidrobiopterina: Njegova važnost u monoaminergičkim neuronima i neurološkim poremećajima. Chem. Rec. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Xia, T.; Grey, DW; Shiman, R. Regulacija fenilalanin hidroksilaze jetre štakora. III. Kontrola katalize pomoću (6R)-tetrahidrobiopterina i fenilalanina. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Tirozin hidroksilaza (TH), njen kofaktor tetrahidrobiopterin (BH4), drugi enzimi srodni kateholaminima i njihovi ljudski geni o lijekovima i genskim terapijama Parkinsonove bolesti (PD): Istorijski pregled i perspektive. J. Neural Transm. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahidrobiopterin povećava aktivnost triptofan hidroksilaze u kriškama rafe štakora. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Shu, C.; Yang, T.; Zhou, S.; Yuan, H.; Chen, AF Tetrahidrobiopterinska regulacija redoks funkcije eNOS. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahidrobiopterin poboljšava oštećenje vazodilatacije zavisne od endotela uzrokovano starenjem kroz povećanje proizvodnje dušikovog oksida. Atherosclerosis 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Fang, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA Efekti suplementacije BH4 nakon produžene ishemije u skeletnim mišićima. Microsurgery 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Yang, Y.-M.; Huang, A.; Kaley, G.; Sun, D. eNOS odvajanje i endotelna disfunkcija u ostarjelim krvnim žilama. Am. J. Physiol.-Heart Circ. Physiol. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Karbach, S.; Wenzel, P.; Waisman, A.; Munzel, T.; Daiber, A. Odvajanje eNOS-a u kardiovaskularnim bolestima - uloga oksidativnog stresa i upale. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Wu, G.; Muller-Delp, JM Efekti starenja i vježbanja na odvajanje eNOS-a u arteriolama otpornosti skeletnih mišića. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. Povišeni ATG13 u serumu pacijenata sa ME/CFS stimuliše odgovor na oksidativni stres u mikroglijalnim ćelijama putem aktivacije receptora za napredne krajnje proizvode glikacije (RAGE). Mol. Cell. Neurosci. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahidrobiopterin i nasljedne hiperfenilalaninemije. Turk. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hiperprolaktinemija, alat u kontroli liječenja nedostatka tetrahidrobiopterina: Endokrine studije kod oboljele djevojčice. Pediatr. Res. 1998, 43, 472–477. [CrossRef]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Jinnah, H. Nedostatak tetrahidrobiopterina i gubitak dopamina u genetskom mišjem modelu Lesch-Nyhanove bolesti. J. Naslijediti. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Li, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrison, DG Nedostatak tetrahidrobiopterina i odvajanje sintaze dušikovog oksida doprinose aterosklerozi izazvanoj poremećenim protokom. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Nedostatak tetrahidrobiopterina endotelnih stanica smanjuje vaskularnu disfunkciju i hipotenziju izazvanu LPS-om. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Ne, H.; Kim, SW; Hwang, O. Tetrahidrobiopterin uzrokuje mitohondrijalnu disfunkciju u dopaminergičkim stanicama: implikacije za Parkinsonovu bolest. Neurochem. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Moon, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Posebna ranjivost mezencefalnih dopaminergičkih neurona pacova na tetrahidrobiopterin: Relevantnost za Parkinsonovu bolest. Neurobiol. Dis. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Yang, S.; Kim, JW; Sohn, S.; Chung, JH; Hong, YH; Lee, DH; Ahn, JK; et al. Indukcija autofagije nedostatkom tetrahidrobiopterina. Autofagija 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et al. Tetrahidrobiopterin: Nova antihipertenzivna terapija. J. Hum. Hipertenzije. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahidrobiopterin: Regulator endotelne sintaze dušikovog oksida u vaskularnim bolestima. Trends Cardiovasc. Med. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Feng, Y.; Feng, Y.; Gu, L.; Liu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Kritična uloga metabolizma tetrahidrobiopterina (BH4) u moduliranju radioosjetljivosti: BH4/NOS osovina kao anđeo ili đavo. Front. Oncol. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Mandarano, AH; Maya, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Pacijenti sa mijalgijskim encefalomijelitisom/sindromom kroničnog umora pokazuju izmijenjen metabolizam T stanica i povezanost citokina. J. Clin. Investig. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Odricanje od odgovornosti/Napomena izdavača:Izjave, mišljenja i podaci sadržani u svim publikacijama su isključivo oni pojedinačnih autora i saradnika, a ne MDPI i/ili urednika(a). MDPI i/ili urednik(i) se odriču odgovornosti za bilo kakvu povredu ljudi ili imovine koja je rezultat ideja, metoda, uputstava ili proizvoda navedenih u sadržaju.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】