Detekcija i karakterizacija mineralo-organskih nanočestica u ljudskim bubrezima

Tsui-Yin Wong^1,2,*, Cheng-Yeu Wu^1,2,3,* et al

Ektopična kalcifikacija je povezana s raznim ljudskim bolestima, uključujući aterosklerozu, rak,hroničnobubregbolest, idijabetesamellitus. Iako su mineralne nanočestice otkrivene u kalcificiranim krvnim sudovima, priroda i uloga ovih čestica u ljudskom tijelu ostaju nejasne. Ovdje po prvi put pokazujemo tog čovjekabubregtkiva dobijena iz završne fazehroničnobubregbolestili pacijenti sa karcinomom bubrega sadrže okrugle, multilamelarne mineralne čestice od 50 do 1500 nm, dok se čestice ne primećuju kod zdravih kontrola. Mineralne čestice se nalaze uglavnom u ekstracelularnom matriksu koji okružuje uvijene tubule, Henleove sabirne kanale i petlje, kao i unutar citoplazme ćelija koje ocrtavaju tubule, a sastoje se od polikristalnog kalcijum fosfata sličnog mineralu koji se nalazi u kostima i ektopičnim kalcifikacijama. Thebubregmineralne nanočestice sadrže nekoliko serumskih proteina koji inhibiraju ektopičnu kalcifikaciju u tjelesnim tekućinama, uključujući albumin, fetuin-A i apolipoprotein A1. Budući da se mineralne organske nanočestice nalaze ne samo unutar kalcificiranih naslaga već iu područjima bez mikroskopskih kalcifikacija, naša zapažanja pokazuju da nanočestice mogu predstavljati prekursore kalcifikacije i bubrežnih kamenaca kod ljudi.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ektopična kalcifikacija je povezana s aterosklerozom, rakom,hroničnobubregbolesti dijabetes melitus1–3. Najnovija istraživanja pokazuju da ateroskleroza ihroničnobubregbolestpacijenti sa znacima vaskularne kalcifikacije pokazuju povećan rizik morbiditeta i mortaliteta, što sugerira da je ektopična kalcifikacija štetna za ljudsko zdravlje1,3. Neželjena kalcifikacija se također opaža kod starijih osoba i većina ljudi starijih od 60 godina pokazuje znakove vaskularne kalcifikacije4. Iz ovih razloga, dešifrovanje faktora koji izazivaju ektopičnu kalcifikacija i razvoj efikasnog lečenja predstavljaju važne ciljeve.

Ektopična kalcifikacija se može definirati kao neravnoteža između inhibitora i induktora kalcifikacije u tijelu. Inhibitori kalcifikacije uključuju serumske proteine ​​kao što su albumin, fetuin-A, osteopontin i matriksni GLA protein, kao i mala jedinjenja kao što je pirofosfat, dok hiperfosfatemija i upala predstavljaju glavne induktore kalcifikacije5–7. Nedavne studije pokazuju da induktori kalcifikacije aktiviraju ćelijski proces sličan formiranju kostiju tokom vaskularne kalcifikacije7,8. Matriksne vezikule slične onima koje induciraju mineralizaciju u kostima u razvoju također su otkrivene u kalcificiranim mekim tkivima7–9. Ove matriksne vezikule vjerovatno oslobađaju vaskularne glatke mišićne ćelije koje se diferenciraju u ćelije slične osteoblastima, koje induciraju kalcifikacija7.

Mineralne nanočestice (NP) otkrivene su u mekim tkivima i pokazuju znakove ektopične kalcifikacije. Price et al. otkrili su da serum pacova tretiranih ili bisfosfonat etidronatom ili vitaminom D sadrži mineralno-proteinske komplekse koji sadrže inhibitore kalcifikacije fetuin-A i matriks GLA protein10,11. Slično, Jahnen-Dechent et al. primijetio je da se mineralni kompleksi koji sadrže fetuin-A, koji se nazivaju čestice kalciproteina (CPP), mogu otkriti u ascitičnoj tekućini pacijenata s kalcificirajućim peritonitisom12. Nedavna studija Bertazza et al. pokazalo je prisustvo mineralnih NP u aortnim zaliscima i koronarnim arterijama i kod pacijenata sa aterosklerotskom i reumatskom groznicom13. Dok su se studije o formiranju mineralnih čestica obično fokusirale na ljudski kardiovaskularni sistem, ostaje nejasno da li se čestice mogu naći u drugim tkivima i da li ti entiteti igraju ulogu u zdravlju ili bolesti.

Ranije smo primijetili da se mineralno-organski NPS spontano formira u ljudskim i životinjskim tjelesnim tekućinama14–28. Ovi mineralni NP su prvobitno opisani kao nanobakterije (NB) i vjerovalo se da nisu samo najmanje ćelije na Zemlji29, već i mogući prenosivi uzročnici brojnih bolesti, uključujući Alchajmerovu bolest, aterosklerozu, rak,bubregkamenformiranje, policističnibubregbolesti prostatitis30–32. Međutim, naši rezultati su pokazali da je NB u stvari neživi mineralni NP koji oponašaju uobičajene bakterije u smislu njihove morfologije, rasta, proliferacije i subkulture15,18,22. Ostaje da se ispita mogućnost da se mineralne čestice slične tzv.

U ovoj studiji razvili smo nanomaterijalni pristup za otkrivanje i analizu minerala-organskih NP-ova kod oboljelih ljudi.bubregmaramice. Pokazali smo da tkiva bubrega u završnoj fazi hronične bolesti bubrega i pacijenata sa karcinomom bubrega sadrže multilamelarne mineralne NP slične biomimetičkim mineralnim česticama koje se spontano talože u tjelesnim tekućinama in vitro. Naši rezultati otkrivaju kritične spoznaje o biohemijskom sastavu, mehanizmu formiranja i biološkoj funkciji ovih minerala-organskih čestica i bacaju svjetlo na mehanizme ektopične kalcifikacije i iniciranja bolesti u ljudskom tijelu.

Rezultati

Pregledali smo bubrežno tkivo hirurški uklonjeno od ljudskih pacijenata sa završnom stadijumom hronične bolesti bubrega (n=2) ili karcinomom bubrega (n=18; vidi tabelu 1; za uzorke karcinoma bubrega fokusirali smo se na ne -kancerogeni dio tkiva). Kao zdrave kontrole, proučavali smo biopsije bubrega dobijene od pacijenata sa traumom ili hematomom, ali koji ranije nisu imali abnormalnu funkciju bubrega (n=2; Tabela 1).

Bubrežno tkivo zdravih osoba pokazalo je normalne histološke karakteristike i nije uočena ektopična kalcifikacija nakon bojenja po von Kossi (slika 1A, B). S druge strane, tkiva bubrega dobijena od oboljelih osoba i obojena hematoksilinom i eozinom (H&E) pokazala su dokaze o oštećenju tkiva (sl. 2A–C, označeno strelicama), a 80 posto pregledanih bolesnih tkiva pokazalo je mineralizirane naslage kako je otkriveno. von Kossa bojenjem (sl. 1C–T, sl. 2E, F, kalcifikacija je vidljiva kao crni materijal označen crnim strelicama; vidi i tabelu 1). Kalcificirane naslage su uočene u korteksu i meduli, uključujući ekstracelularni prostor koji okružuje distalne uvijene tubule, proksimalne uvijene tubule, sabirne kanale i Henleove petlje, kao i citoplazmu ćelija koje ocrtavaju tubule i kanale (sl. 1C–T i sl. 2E, F). U bubrežnom tjelešcu nije otkrivena kalcifikacija (slika 2D).

Da bismo ispitali prirodu mineralnih precipitata, pripremili smo ultratanke preseke bubrega za posmatranje transmisijskom elektronskom mikroskopom (TEM). U uzorcima koji sadrže mikroskopske mineralne naslage, mineralne čestice ili granule otkrivene su u citoplazmi bubrežnih epitelnih ćelija, u ekstracelularnom matriksu ispod bazalne membrane, iu lumenu proksimalnih i distalnih uvijenih tubula (sl. 3A, B, čestice su uvećane u panelima A1–A4 i B1–B4). Mineralni NP su također uočeni unutar ćelija koje oblažu Henleove petlje i sabirne kanale (sl. 3C, D, uvećano na panelima C1, C2 i D1). Neke čestice su pronađene unutar intracelularnih vezikula u bubrežnim ćelijama (slika 3A, paneli A1 i A2). Pristup elektronskom mikroskopijom koji se ovdje koristi također nam je omogućio da vizualiziramo unutrašnjost mineralnih čestica; neke čestice su nosile prstenove guste elektronima koji su se naizmenično slagali sa laganim, elektron-lucentnim slojevima (slika 3A, paneli A3 i A4, slika 3C, panel C1). Nekoliko krvnih sudova, kao što su vasa recta rents (ravne arterije bubrega), okruženi smo velikim brojem mineralnih NP (slika 3D, tabla D1). Mineralni NP su stoga pronađeni na različitim lokacijama u svim ljudskim bubrežnim tkivima i pokazuju znakove ektopične kalcifikacije, dok čestice nisu nađene u zdravoj kontrolisanoj kontroli.

Čini se da su mineralne čestice pronađene u tkivima bubrega vrlo slične mineralo-organskim NP opisanim kako se spontano formiraju u tjelesnim tekućinama u našim prethodnim studijama15,17 (i koje smo nazvali bionima24). Da bismo potvrdili ovu mogućnost, pripremili smo mineralne organske NP (ili bione) koristeći metodu precipitacije kao što smo prethodno opisali15. Ova metoda se sastoji od dodavanja precipitirajućih jona kao što su kalcijum i fosfat u medijum za ćelijsku kulturu (Dulbeccov modifikovani Eagleov medijum ili DMEM) koji sadrži telesnu tečnost poput ljudskog seruma (HS), nakon čega sledi inkubacija u uslovima ćelijske kulture (videti Metode). Čestice proizvedene na ovaj način (HS-NPS) bile su sferične ili elipsoidne i pokazivale su glatku ili kristalnu mineralnu površinu (sl. 4A-E), slično česticama opisanim ranije u tjelesnim tekućinama22,23, kao i u humanom ascitesu12 i kalcificirane arterije13. Mineralne čestice bile su vrlo slične mineralnim NP ili granulama uočenim u tkivima bubrega u smislu njihove ukupne morfologije, višeslojne strukture i površinskih karakteristika (Slika 4F–J). Veličina čestica dobijenih iz HS i granula bubrega takođe je bila uporediva, varirajući od 50 do 1500 nm u prečniku (sl. 4A–E,F–J). Kao što je gore navedeno, neke bubrežne granule su bile okružene lipidnom membranom, što je moguće da predstavlja intracelularne vezikule tereta ili vezikule ekstracelularne membrane (Slika 4H,I, membrane su označene strelicama); takve membranske strukture nisu bile prisutne u HS-NP uzorcima pripremljenim in vitro (sl. 4A–E). Ova zapažanja sugeriraju da su granule bubrega slične mineralo-organskim NP sastavljenim u serumu.

Koristeći analizu difrakcije elektrona odabrane površine, uočili smo da se mineralna faza HS-NP pripremljenih in vitro sastoji od polikristalnog nanomaterijala (slika 4E, umetnuti; primijetite slabe koncentrične prstenove). Slični rezultati su dobijeni za granule bubrega (slika 4J, umetak) i za kosti i ektopične kalcifikacije kao što je opisano u prethodnim studijama33,35.

Proučavali smo hemijski sastav HS-NP i bubrežnih granula primenom energetski disperzivne rendgenske spektroskopije (EDX). HS-NP su pokazali glavne pikove ugljenika (C), kalcijuma (Ca), kiseonika (O) i fosfora (P) (slika 4K), u skladu sa prisustvom minerala kalcijum fosfata. Nizak pik silicijuma (Si) je takođe primećen u HS-NP (slika 4K), verovatno predstavljajući manji sastojak čestice. Granule bubrega također su pokazale vrhove ugljika, kalcijuma, kiseonika i fosfora, što ukazuje na mineral kalcijum fosfata, zajedno sa dodatnim pikovima silicijuma i gvožđa (Fe) (slika 4L). Pikovi uranijuma (U) pripisani su uranil acetatu koji se koristi kao kontrastni reagens tokom pripreme uzorka (prisustvo uranijuma u nekim uzorcima mineralnih čestica poput granula bubrega i njegovo odsustvo u kontrolnom tkivu na slici 4M može se pripisati visokoj afinitet uranijuma prema fosfatu, kao što je ranije objavljeno35). Kontrolni EDX spektri bubrežnog tkiva koji okružuje čestice pokazali su vrhove ugljenika i kiseonika (slika 4M), što sugeriše da su kalcijum i fosfor pronađeni uglavnom u mineralnim česticama.

Kalcijum:fosfor (Ca:P) odnos HS-NP i granula bubrega varirao je od 0.65 do 1.18. Ovi omjeri se razlikuju od teorijske vrijednosti od 1,67 uočene za stehiometrijski hidroksiapatit, ali su još uvijek unutar raspona koji smo ranije vidjeli za kristale kalcijum fosfata i apatita uočene pri različitim stupnjevima kristalizacije15. Zajedno, ovi nalazi potvrđuju da se granule bubrega sastoje od NP-a kalcijum fosfata.

Utvrđeno je da različiti proteini inhibiraju ektopičnu kalcifikacija na sistemski način u tijelu36,37. Osim toga, vjeruje se da proteinska korona pronađena na površini sintetičkih NP određuje biodistribuciju i efekte čestica na ćelije in vivo38,39. S druge strane, sastav proteina mineralo-organskih NP-ova koji se nalaze u ljudskim bubrežnim tkivima ostaje nepotpuno shvaćen. Ranije smo otkrili da albumin, fetuin-A i apolipoprotein-A1 (apo-A1) predstavljaju glavne proteine ​​koji stupaju u interakciju s mineralo-organskim NP-ovima koji se formiraju u tjelesnim tekućinama17,20. Ovdje smo koristili označavanje imunog zlata da ispitamo prisutnost i ultrastrukturnu lokaciju ovih proteina unutar granula bubrega.

Koristili smo poliklonska antitijela protiv humanog serumskog albumina (HSA), humanog serumskog fetuina-A (HSF), humanog apo-1A i cijelog HS da bismo ispitali prisustvo serumskih proteina u HS-NP i granulama bubrega. Specifičnost poliklonskih antitijela (pripremljenih kako je ranije opisano25) potvrđena je korištenjem Western blotinga (slika 5). Svako od poliklonskih antitela pozitivno je reagovalo sa HS-NP pripremljenim in vitro, kao i sa mineralnim granulama pronađenim u tkivima ljudskog bubrega (sl. 6A,B, paneli A1–A3 i B1–B3; crne tačke). Antitijela su reagovala uglavnom sa elektron-gustim slojevima ili tamnim jezgrom HS-NP-a i granulama bubrega (Slika 6A, B), što ukazuje da ova tamna područja mogu sadržavati više nivoe proteina u poređenju sa elektron-lucentnim područjima. Negativne kontrole izvedene bez primarnog antitela nisu dale nikakvu reakciju (sl. 6A, B, paneli A4 i B4, kontrola). Zaključili smo da granule bubrega predstavljaju mineralo-organske NP slične HS-NP na osnovu ne samo njihove morfologije i mineralnog sastava već i njihovog vezivanja za glavne inhibitore kalcifikacije prisutnih u serumu.

Imunofluorescentna mikroskopija je zatim korištena da se potvrdi prisustvo mineralnih granula koje sadrže HSA i HSF u oboljelim ljudskim bubrezima. Koristeći ovu tehniku, pokazala su ljudska tkiva bubrega

pozitivno bojenje za dva proteina u različitim područjima, uključujući intersticijum koji okružuje bubrežne tubule, kao i citoplazmu ćelija koje ocrtavaju tubule (slika 7A, paneli A1 i A2). Agregati proteina koji sadrže i albumin i fetuin-A takođe su primećeni u ovim oblastima, iako u manjim količinama u poređenju sa bojenjem pojedinačnih proteina (slika 7A i panel A3, spojeno bojenje u žuto). Primetili smo da se bojenje proteina detektovano imunofluorescencijom usko preklapa sa obrascem ektopične kalcifikacije primećene korišćenjem von Kossa bojenja (slika 7A,B, kalcifikacija je vidljiva kao crni materijal označen strelicama u B). Ovi rezultati pružaju dalju podršku prisutnosti mineralo-organskih čestica u ispitivanom tkivu bubrega ljudi.

Diskusija

Iako je postignut napredak u našem razumijevanju interakcija između sintetičkih NP-a i ljudskih ćelija, znamo znatno manje o efektima mineralo-organskih NP-a koji se spontano formiraju u tjelesnim tekućinama. Naše prethodne studije su pokazale da se ove čestice formiraju u biološkim tečnostima kada koncentracije kalcijuma i fosfata pređu zasićenje15,16. Također smo primijetili da su te čestice internalizirane od strane imunoloških stanica, ali da samo velike čestice izazivaju proinflamatorne imunološke reakcije23. Međutim, do sada nije ispitivana distribucija ovih čestica u ljudskim tkivima i da li imaju bilo kakvu fiziološku ili patološku ulogu u tijelu.

U ovoj studiji, po prvi put smo otkrili mineralo-organske NP u bubrezima ljudskih pacijenata koji boluju od bolesti bubrega u završnoj fazi ili raka bubrega. Otkriveni mineralo-organski NP sadrže slabo kristalizirani kalcijum fosfat sličan mineralu kostiju, kao i albumin, fetuin-A i apo-A1 koji djeluju kao sistemski inhibitori kalcifikacije u tjelesnim tekućinama. Naši rezultati su u skladu sa prethodnim izveštajima koji su opisivali prisustvo mineralno-proteinskih kompleksa u vaskularnim tkivima i telesnim tečnostima12,13,34,40. Budući da su čestice koje smo uočili pronađene u područjima koja ne sadrže mikroskopske kalcifikacije, naša zapažanja sugeriraju da čestice mogu predstavljati prekursore ektopične kalcifikacije u ljudskim tkivima. S obzirom na mogućnost da mineralo-organski NP mogu postupno rasti u veličini i podvrgnuti konverziji čestica u film pod povoljnim uvjetima kao što je opisano u našim prethodnim studijama15,18, ovdje predstavljena zapažanja sugeriraju da mineralni prekursori mogu dovesti do stvaranja većih mineralne naslage in vivo, kao što su Randallov plak i kamen u bubregu.

Naša zapažanja da se mineralne ektopične kalcifikacije i mineralo-organski NP nalaze u različitim anatomskim strukturama bubrega u skladu su s prethodnim nalazima ektopičnih kalcifikacija u ovom organu41. Opažanja Evana i saradnika su pokazala da mineralizacija u bubrezima pacijenata sa nefrolitijazom može početi i da se javlja pretežno u intersticijskom tkivu Henleovih petlji40,42. Ovi autori su primijetili da mineralne naslage koje se formiraju u ovom području mogu stršiti iz bazalne strane urotela i dovesti do stvaranja kamenca u bubregu. Naša zapažanja sugeriraju da, pored Henleovih petlji, druga područja bubrega mogu sadržavati mineralne NP-ove koji mogu na kraju evoluirati i formirati velike mineralne naslage u ljudskim bubrezima. Također istražujemo mogućnost da se mineralni NP koji se formiraju u cirkulaciji mogu translocirati u bubrežna tkiva i izazvati ektopičnu kalcizaciju i stvaranje kamenca u bubrezima.

Nekoliko bubrežnih granula otkrivenih u ovoj studiji nalazi se unutar intracelularnih ili ekstracelularnih vezikula (Slika 4H, I) i one su slične matriksnim vezikulama za koje je pokazano da induciraju kalcifikacije u kostima i zubima7,8. Nedavno smo primijetili da vezikule izolirane iz ljudskog i životinjskog seruma induciraju stvaranje mineralnih NP i mikroskopskih precipitata in vitro25. Schlieper et al.34 su također primijetili da su mineralne čestice pronađene u arterijama povezane sa membranskim strukturama i predložili da matriksne vezikule ili apoptotska tijela mogu predstavljati nukleatore mineralnih čestica u ovim tkivima. Slično, Khan et al. izvijestili su da su naslage kalcijum fosfata pronađene u bubrezima ljudskih pacijenata s idiopatskim bubrežnim kamencima povezane s kolagenim vlaknima i matriksnim vezikulama9. Ovi rezultati sugeriraju da se mineralo-organski NP otkriveni u tkivima bubrega mogu formirati putem mehanizma koji uključuje membranske vezikule, što je situacija analogna onoj koja se vidi u aterosklerotskim arterijama7,8. S druge strane, nedavna studija je pokazala da ektopična kalcifikacija pronađena u arterijama dojke kod žena nije povezana s osteogenim ili apoptotičkim ćelijskim markerima43, što sugerira da mehanizam kalcifikacije može biti specifičan za organ ili biološki kontekst koji je uključen. Osim toga, mineralo-organski NP-ovi poput onih koji su ovdje opisani, ljudska bubrežna tkiva također mogu nastati zbog neuspjeha u održavanju fizioloških koncentracija jona (npr. kalcijuma i fosfata) i inhibitora kalcifikacije (npr. albumin, fetuin-A i apo -A1) u ljudskim telesnim tečnostima.

Naši rezultati sugeriraju da sloj guste elektronom i jezgro mineralno-organskih NP-a mogu sadržavati više razine proteina i organskih molekula u poređenju sa elektron-lucentnim područjima čestica (Slika 6A, B). Čini se da su ovi slojevi gusti elektronima mineralizirani kao što se vidi po kristalnoj prirodi ovog materijala pod TEM (vidi sliku 4A–J). Drugi autori, uključujući Ryall41 i Evan et al.44, su predložili da elektron-lucentni sloj može predstavljati minerale, dok slojevi gusti elektronom mogu odgovarati organskim molekulima. Ova tumačenja mogu biti barem djelomično posljedica načina na koji su uzorci obrađeni i ispitani u svakoj studiji, kao i prirode korištenog početnog tkiva.

Osim što igraju ulogu u ektopičnoj kalcifikaciji, minerali-organske čestice mogu izazvati upalu u tkivima bubrega. Nedavno smo pokazali da dok mineralo-organski NP ne uspijevaju inducirati lučenje proinflamatornog interleukina-1 od strane ljudskih makrofaga, mineralni agregati veći od 1 μm mogu to učiniti23. Pokazalo se da se oslobađanje interleukina-1 kao odgovor na kristalne materijale oslanja na aktivaciju intracelularnih molekularnih kompleksa nazvanih inflamazomi45-47. Osim toga, mineralne čestice otkrivene su u bubrezima u kojima se nalaze tumori i povezanost između raka i upale je sada dobro prepoznata48. Ostaje da se istraži mogućnost da agregirane mineralne čestice mogu aktivirati inflamazom i doprinijeti razvoju upale i raka u bubrezima ili drugim tkivima.

Osim ektopične kalcifikacije, ovdje opisane mineralne granule mogu sudjelovati u drugim procesima bolesti. Na primjer, ranije smo predložili da se mineralni NP-ovi mogu vezati za različite proteine ​​u tjelesnim tekućinama i iscrpiti ove organske molekule iz tjelesnih tekućina20,26. S druge strane, ljudsko tijelo može spriječiti stvaranje i akumulaciju mineralnih NP-a u normalnim okolnostima oslanjajući se na prisustvo inhibitora kalcifikacije i retikuloendotelnog sistema (tj. makrofaga). Mineralni NP se stoga mogu akumulirati samo kada je sistemska ili lokalna homeostaza kalcija poremećena i kada su zaštitni mehanizmi otkazali u ljudskom tijelu.

Predlažemo da se ovdje razvijeni nanomaterijalni pristup može koristiti za proučavanje formiranja mineralo-organskih NP u životinjskim i ljudskim tkivima. Na primjer, antitijela stvorena protiv proteina inhibitora kalcifikacije kao što su albumin, fetuin-A i apo-A1 mogu se koristiti u kombinaciji s mineralnom analizom za otkrivanje i karakterizaciju formiranja mineralo-organskih NP u tkivima životinjskih modela. Rezultati dobijeni ovim pristupom mogu se primijeniti na klinička mjerenja na ljudskim tjelesnim tekućinama kako bi se identificirali biološki parametri koji odražavaju stanje formiranja mineralnih čestica i ektopične kalcifikacije u tijelu. Očekujemo da ovo znanje može dovesti do razvoja novih terapijskih strategija za prevenciju i liječenje ljudskih bolesti i stanja povezanih s ektopičnom kalcifikacijama.

Metode

Bubrežno tkivo.Korištenje ljudskih tkiva i eksperimente izvedene u ovoj studiji odobrio je Institucionalni odbor za reviziju Memorijalne bolnice Chang Gung; metode i eksperimenti su izvedeni u skladu sa odobrenim smjernicama. Od pacijenata je dobijen pismeni informirani pristanak. Kontrolno zdravo bubrežno tkivo dobijeno je iz biopsija pacijenata sa traumom i hematomom bez istorije bolesti bubrega (n=2); bubrežno tkivo je takođe dobijeno od pacijenata sa karcinomom bubrega (n=20) i pacijenata sa završnom stadijumom bolesti bubrega (n=2) čiji su bubrezi uklonjeni ili podvrgnuti biopsiji tokom operacije transplantacije (Tabela 1). Za tkiva raka bubrega, nekancerozni dio tkiva je seciran i analiziran u ovoj studiji.

Histološka analiza.Bubrežna tkiva su postavljena na parafinske blokove. Blokovi su isečeni i kriške tkiva zagrejane na vrućoj ploči na 70 stepeni 30 minuta da bi se uklonio parafin. Sekcije su uronjene u svježi rastvor ksilena tri puta po 15 minuta da bi se potpuno uklonio preostali parafin. Sekcije su rehidrirane sa 95 posto, 80 posto i 70 posto etanolom svaki put po 5 minuta. Rehidrirani uzorci su ispirani dvostruko destilovanom vodom (ddH2O) 5 min. Ćelijska jezgra su obojena hematoksilinom 8 minuta. Boja je uklonjena sa uzoraka toplom vodom 10 minuta. Uzorci bubrega su isprani u ddH2O i potopljeni 10 puta u 95 postotni etanol. Uzorci tretirani etanolom su obojeni eozinom Y 1 min. Uzorci su dehidrirani sa 95 posto i 100 posto etanolom svaki put po 10 minuta, nakon čega je slijedio korak dehidracije u ksilenu u trajanju od 10 minuta. Konačni dehidrirani uzorci bubrega postavljeni su na staklene pločice sa 50 posto glicerola i promatrani pod svjetlosnim mikroskopom opremljenim digitalnom kamerom.

Deparafinizirani i rehidrirani uzorci pripremljeni su kako je opisano za H&E bojenje. Rehidrirani rezovi su obojeni srebrnim nitratom (5 posto), nakon čega je uslijedilo izlaganje UV svjetlu u trajanju od 20 minuta. Rastvor je ispran sa ddH2O 15 min. Presjeci su obojeni natrijum tiosulfatom (5 posto) u trajanju od 5 minuta, nakon čega je slijedilo ispiranje sa ddH2O tokom 15 minuta. Sekcije su obojene nuklearnom brzom crvenom bojom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) 5 minuta. Obojeni uzorci su dehidrirani sukcesivno sa 95 posto i 100 posto etanolom svaki po 10 minuta, prije dehidracije u ksilenu u trajanju od 10 minuta. Uzorci bubrega su postavljeni na stakalce i pregledani kako je gore opisano.

Elektronska mikroskopija i EDX analiza.Uzorci bubrega su izrezani na male komadiće debljine manje od 1 mm pomoću LGPS disekcionog mikroskopa (Olympus, Tokyo, Japan). Tkiva su fiksirana sa 2,5 posto glutaraldehida i 1 posto paraformaldehida u 0.1 M kakodilatnom puferu na 4 stepena preko noći. Fiksni uzorci su isprani tri puta sa 0.1 M kakodilatnim puferom u 8 posto saharoze (pH 7,2) na ledu 10 minuta. Oprana tkiva su inkubirana u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) koji sadrži 1 procenat osmijum tetroksida i 1,5 procenata kalijum ferocijanida tokom 2 sata na ledu. Tkiva su tri puta isprana sa ddH2O na ledu po 10 minuta. Isprana tkiva su obojena na ledu sa 1% uranil acetata u ddH2O tokom 1h, prije nego što su tri puta isprana sa ddH2O na ledu. Tkiva bubrega su dehidrirana sa 30, 50, 70, 80 i 90 posto etanola svaki put po 10 minuta, osim kada je etanol dostigao 70 posto, u kom slučaju su uzorci čuvani na 4 stepena preko noći. Tkiva su obojena sa 1 posto fosfovolframske kiseline u 95 posto etanolu 15 minuta, prije dehidracije sa 95 posto etanola tijekom 5 minuta. Uzorci su uronjeni u propilen oksid na 40, 57, 67 i 100 posto u etanolu svaki put po 10 minuta, nakon čega je slijedilo još jedno uranjanje u 100 posto propilen oksid na 5 minuta. Tkiva bubrega su infiltrirana sa 50, 70 i 100 posto Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) svaki put po 1 sat. Eponate 812-ugrađeni uzorci bubrega pripremljeni su inkubacijom dvaput u 100 posto eponate. Ugrađeni uzorci su inkubirani u pećnici na 60 stepeni preko noći kako bi se omogućila polimerizacija smole.

Oprane HS-NP pelete dobijene kao što je gore navedeno su fiksirane sa glutaraldehidom (2,5 posto) i paraformaldehidom (1 posto) u ddH2O tokom 4 sata na 4 stepena. Fiksne pelete su isprane sa ddH2O tri puta po 10 minuta svaki put. Pelete su dehidrirane uzastopnim inkubacijama u 30, 50, 70, 80, 90, 95 i 100 posto etanola, svaki put po 10 minuta, osim kada je etanol dostigao 70 posto, u kojem su pelete čuvane na 4 stepena preko noći. Ostale otopine etanola su stavljene u kontakt sa peletima samo 10 minuta. Dehidrirane pelete su infiltrirane sa LR bijelim embedding medijumom (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) koristeći različite omjere etanola i LR medija (3:1, 1:1 i 1:3) u trajanju od 30 minuta. Pelete su infiltrirane svježim LR medijumom (100 posto) preko noći prije polimerizacije. Pelete infiltrirane sa LR medijumom inkubirane su u pećnici na 60 stepeni 2 dana da bi se omogućila polimerizacija smole. Blokovi bubrega i HS-NP su sečeni kako bi se dobile kriške debljine 70-100 nm pomoću Reichert Ultracut S mikrotoma (Leica, Wetzlar, Njemačka). Presjeci tkiva su obojeni sa 4 posto uranil acetata prije vizualizacije pod JEM 1230 transmisionim elektronskim mikroskopom (JEOL, Tokio, Japan) koji radi na 100 kV. Difrakcijski uzorci elektrona su dobijeni korištenjem istog sistema. Niklovane rešetke su korištene kao potpora.

Za EDX analizu, tanki rezovi bubrežnog tkiva su obojeni uranil acetatom i isprani ddH2O kao što je gore navedeno, nakon čega je uslijedilo sušenje u elektronskom eksikatorskom kabinetu. Uzorci su posmatrani pod JEM 2100 transmisionim elektronskim mikroskopom visoke rezolucije (JEOL) koji radi na 120 kV. EDX spektri su dobijeni u tri primjerka korištenjem INCA Energy EDS sistema (Oxford Instruments, Abingdon, UK). Uočeni su tanki preseci HS-NP bez bojenja.

Priprema mineralo-organskih NP.Sve početne otopine su podešene na pH 7,4 i sterilizirane filtracijom kroz 0.2μm membrane prije upotrebe. HS je dobiven od zdravih ljudskih dobrovoljaca korištenjem konvencionalne tehnike venepunkcije. Korištenje ljudskih bioloških tekućina u ovoj studiji odobrio je Institucionalni odbor za reviziju Memorijalne bolnice Linko Chang Gung i dobijen je pismeni informirani pristanak od volontera. HS-NP su pripremljeni dodavanjem po 3 mM CaCl2 i Na2HPO4 u DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) koji sadrži 10 posto HS, nakon čega je uslijedila inkubacija u trajanju od jedne sedmice u uslovima ćelijske kulture (37 stepeni, 5 posto CO2, vlažni vazduh). Čestice su peletirane centrifugiranjem na 16,000 ×g 15 minuta na 4 stepena i isprane dva puta sa HEPES puferom (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) koristeći isti postupak centrifugiranja.

SDS-PAGE i Western blotting.SDS-PAGE i Western blot analiza izvedena je u suštini kao i prije15. Ukratko, 0.2 ug (slika 5A,D) ili 1.2 ug (slika 5B,C) HS proteina, 47 ug (sl. 5A,B,D) ili 590ug HS-NP proteina (slika 5C), 0.1 ug HSA (sl. 5A–D) i 0.6ug (sl. 5A, C, D) ili {{23} }.15 ug HSF-a (slika 5B) je otopljeno u 5× "puferu za punjenje" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 posto SDS, 0,05 posto bromofenol plavog, 50 posto glicerola, 12,5 posto - merkaptoetanol) do konačne koncentracije od 1×, prije zagrijavanja na 95 stupnjeva u trajanju od 5 minuta i odvajanja pod denaturacijskim i redukcijskim uvjetima na 10 posto SDS-PAGE koristeći mini-gel sistem (Hoefer, Holliston, MA). NP kontrola (korišćena u traci 1 na slici 5A-D) sastojala se od mineralnih NP pripremljenih dodavanjem 3 mM CaCl2 i Na2HPO4 svaki u DMEM (konačni volumen od 1ml), nakon čega je usledila inkubacija tokom jednog dana u uslovima ćelijske kulture; čestice su peletirane centrifugiranjem na 16,000 × g tokom 15 minuta, isprane dva puta sa HEPES puferom i resuspendirane u 50 ul HEPES pufera. Alikvot od 20ul resuspendiranih čestica je obrađen za SDS-PAGE kao što je gore navedeno. PVDF membrane su blokirane 1 sat u 5 posto (w/v) odmašćenom mlijeku na sobnoj temperaturi. Primarna antitijela generirana u kući kao što je prije opisano25 korištena su u razrjeđenju od 1:1,000 (-apo-A1 i -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , ili 1:6, 000 ( -HSA). Korišteno je sekundarno antitijelo kozjeg anti-zečjeg hrena konjugirano s peroksidazom prema uputama proizvođača (Millipore, Billerica, MA). Mrlje su otkrivene upotrebom poboljšane hemiluminiscencije (Amersham Biosciences, Amersham, UK) i autoradiografskih filmova.

Immunogold labeling.Pripremljeni su uzorci za TEM posmatranje. HS-NP blokovi su podijeljeni na kriške debljine manje od 70 nm. Sekcije uzoraka na rešetkama su blokirane sa 1 posto ribljeg želatina (Sigma) u 0.1 M HEPES puferu (pH 8,0) tokom 25 minuta. Rešetke su inkubirane sa sledećim primarnim antitelima: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Negativna kontrola nije sadržavala primarno antitijelo (1 posto ribljeg želatina u HEPES puferu). Inkubirane sekcije su ispirane HEPES puferom 15 minuta. Isprani dijelovi blokirani su 1 posto ribljeg želatina u HEPES puferu 20 minuta. Uzorci su tretirani sekundarnim 5-nm-zlato-konjugatom kozji anti-zečji IgG 1h. Uzorci su ispirani HEPES puferom 10 min, prije ispiranja sa ddH2O 10 min. TEM posmatranja su obavljena kao gore.

Fluorescentna mikroskopija.Histološka stakalca bubrežnog tkiva pripremljena kao gore su blokirana sa 1 procentom goveđeg serumskog albumina tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Stakalca su inkubirana sa primarnim poliklonskim antitelima u razblaženju 1:4,000. Nakon koraka ispiranja, uzorci su inkubirani sa sekundarnim antitijelima kozji anti-zečji-FITC (492/520nm) i kozji anti-zečji-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) u 1:100 za 1h. Kompleksi su ispirani sa PBST tokom 15 minuta. Fluorescentna boja 4′,6-diamidino{19}}fenilindol (DAPI) korištena je pri 10 ug/ml tokom 15 minuta. Uzorci obojeni DAPI su dehidrirani sa 95 i 100 posto etanolom svaki po 10 minuta, nakon čega je uslijedila dehidracija u ksilenu još 10 minuta. Dehidrirani uzorci bubrega su montirani sa Vectashield fluorescentnim H-1000 medijumom (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i posmatrani su pod konfokalnim mikroskopom (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Njemačka) opremljenim Spot Flex kamerom.

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Reference

1. Giachelli, CM Ektopična kalcifikacija: prikupljanje čvrstih činjenica o mineralizaciji mekog tkiva. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).

2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaskularna kalcifikacija: mehanizmi i kliničke posljedice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).

3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Kalcifikacija kod ateroskleroze. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).

4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM Obrasci i faktori rizika za sistemsku kalcificiranu aterosklerozu. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).

5. Ketteler, M. et al. Nedostaci proteina regulacije kalcija kod pacijenata na dijalizi: novi koncept kardiovaskularne kalcifikacije kod uremije. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).

6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Ciljanje vaskularne kalcifikacije: omekšavanje tvrde mete. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).

7. Kapustin, AN & Shanahan, CM Regulacija kalcija matriksnih vezikula iz vaskularnih glatkih mišića. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).

8. Doherty, TM et al. Kalcifikacija kod ateroskleroze: biologija kostiju i kronična upala na arterijskoj raskrsnici. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).

9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Povezivanje Randallovih plakova sa kolagenim vlaknima i membranskim vezikulama. J Urol 187, 1094–1100 (2012).

10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Biohemijska karakterizacija serumskog fetuin-mineralnog kompleksa. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).

11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN Nivoi fetuin-mineralnog kompleksa u serumu koreliraju sa kalcifikacijama arterija kod pacova. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).

12. Heiss, A. et al. Hijerarhijska uloga fetuina-A i kiselih serumskih proteina u formiranju i stabilizaciji čestica kalcijum fosfata. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).

13. Bertazzo, S. et al. Nanoanalitička elektronska mikroskopija otkriva temeljne uvide u kalcifikacija ljudskog kardiovaskularnog tkiva. Nat Mater 12, 576–583 (2013).

14. Martel, J. & Young, JD Navodne nanobakterije u ljudskoj krvi kao nanočestice kalcijum karbonata. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).

15. Young, JD et al. Pretpostavljene nanobakterije predstavljaju fiziološke ostatke i nusproizvode kulture normalne homeostaze kalcija. Plos One 4, e4417 (2009).

16. Young, JD et al. Karakterizacija granulacija kalcijuma i apatita u serumu kao pleomorfnih mineralo-proteinskih kompleksa i kao prekursora navodnih nanobakterija. Plos One 4, e5421 (2009).

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-mineralni kompleksi koji liče na granule kalcijuma u serumu i navodne nanobakterije: demonstracija koncepta dvostruke inhibicije-zasijavanja. Plos One 4, e8058 (2009).

18. Young, JD & Martel, J. Uspon i pad nanobakterija. Sci Am 302, 52–59 (2010).

19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD Kritička procjena gama ozračenog seruma koji se koristi kao hranilica u kulturi i demonstracija navodnih nanobakterija i kalcificirajućih nanočestica. Plos One 5, e10343 (2010).

20. Martel, J. et al. Sveobuhvatna proteomska analiza mineralnih nanočestica dobijenih iz tečnosti ljudskog tela i analiziranih tečnom hromatografijom-tandem masenom spektrometrijom. Anal Biochem 418, 111–125 (2011).