Dendrimer-tesaglitazar konjugat izaziva fenotipski pomak mikroglije i pojačava -amiloidnu fagocitozu† 3. dio

D-Tesa povećava ekspresiju enzima odgovornih za uklanjanje patogenih proteina

Enzim za razgradnju inzulina (Ide) i matriksna metaloproteaza 9 (MMP9) su enzimi koje luče mikroglija i koji razgrađuju ekstracelularni -amiloid i -sinuklein.71,72 Tretman D-Tesom značajno je povećao ekspresiju Ide 3.1- puta (p < 0.001) sa trendom povećanja ekspresije MMP9 (1.8-povećavanje, p=0.057) u poređenju sa kontrolama koje su tretirane samo LPS (sl. 6A i B).

Posljednjih godina, sve više studija pokazuje da postoji bliska veza između enzima koji razgrađuju inzulin i pamćenja. Ovo otkriće nam pruža vrijedne tragove za dalje istraživanje mehanizma formiranja i održavanja pamćenja.

Enzim koji razgrađuje inzulin je važan enzim, čija je glavna funkcija razgradnja inzulina kako bi se održala ravnoteža šećera u krvi. Međutim, nedavne studije su pokazale da enzim koji razgrađuje inzulin ne igra samo metaboličku ulogu, već i direktno utječe na rast i popravak neurona u mozgu, te igra važnu ulogu u održavanju pamćenja.

Mnoge studije su pokazale da što je viši nivo enzima koji razgrađuje inzulin, to je bolje pamćenje. To je zato što enzimi koji razgrađuju inzulin mogu potaknuti rast i popravak neurona, čime se poboljšava sposobnost učenja i pamćenja mozga. Osim toga, enzimi koji razgrađuju inzulin također mogu promovirati vezu između neurona, čime se poboljšava povezanost i zadržavanje pamćenja.

Važna uloga enzima koji razgrađuju inzulin u pamćenju široko se koristi u području kliničke medicine. Istraživači su otkrili da udisanjem enzima koji razgrađuju inzulin, ne samo da se može poboljšati pamćenje, već se mogu poboljšati i kognitivne sposobnosti i simptomi depresije.

Ukratko, veza između enzima koji razgrađuju inzulin i pamćenja je vrlo važno polje koje nam pruža vrijedne tragove za proučavanje biološkog mehanizma pamćenja. Buduća istraživanja će dalje istraživati ​​funkciju i ulogu enzima koji razgrađuju inzulin, pomoći će nam da bolje razumijemo formiranje i mehanizam skladištenja pamćenja i pružiti bolju osnovu za poboljšanje sposobnosti učenja i pamćenja ljudskog mozga. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer Cistanche može regulisati i ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta, koji su veoma važni za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche također može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljnu ishranu i energiju, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite na saznajte načine da poboljšate svoje pamćenje

Slobodna Tesa je značajno povećala ekspresijuIde 2- puta (p=0.011), a neznatno povećala MMP92- puta (p=0.35) (slika 6A i B). M2 mikroglija u neurodegenerativnim bolestima može ukloniti -amiloid, -sinuklein i druge patogene proteine ​​putem enzimske degradacije ili fagocitoze, a D-Tesa pojačava regulaciju proteina uključenih u ove procese (tj. Ide i MMP9).71–73

Ideekspresija je smanjena u AD i PD patologiji i poznato je da je pojačana PPAR agonistima, što je u skladu s našim rezultatima.

71,72 Funkcionalno, pokazalo se da samo 2-putostruko povećanje nivoa Ide smanjuje akumulaciju -amiloida i neuronsku smrt in vivo.74,75 Stoga, 3-putostruko povećanje Ide uočeno od strane D-Tesa, i 2-putostruko povećanje Ide od strane freeTese moglo bi biti terapeutski efikasno in vivo.

D-Tesa povećava fagocitozu -amiloida

CD36 je mikroglijalni hvatač receptor koji olakšava fagocitozu i degradaciju -amiloida.73 Njegova regulacija u AD dovodi do smanjenog uklanjanja -amiloida, ali se pojačava aktivacijom PPAR-a.

I D-Tesa i slobodna Tesa značajno povećavaju nivoe ekspresije CD36 u poređenju sa ćelijama izloženim samo LPS (p < 0.0001 naspram p < 0,005 za D-Tesu i slobodnu Tesu , respektivno), ali je D-Tesa bila mnogo efikasnija od slobodne Tesa (6- puta povećanje u odnosu na 2.8- puta povećanje za D-Tesa i slobodnu Tesa, respektivno, p < 0,0005) (slika 6C ).

Naši rezultati su u skladu s prethodnim studijama s pioglitazonom (još jednim PPAR agonistom) koje su pokazale da se povećana mikroglijalna fagocitoza -amiloida javlja putem PPAR i CD36-zavisnog mehanizma.73

Da bismo istražili da li je povećanje regulacije CD36 od D-Tesatreatment-a u korelaciji s povećanom fagocitnom sposobnošću ovih stanica, izveli smo test funkcionalne fagocitoze -amiloida. 73

Ukratko, nakon tretiranja ćelija kao što smo uradili u prethodnim in vitro testovima, naneli smo fluorescentno obeleženi -amiloid1–42 na ćelije na dva sata, isprali ćelije, a zatim izvršili protočnu citometriju da bismo istražili stepen ćelijskog preuzimanja -amiloida. D-Tesa je povećao i procenat ćelija koje su fagocitirale -amiloid i prosečnu količinu -amiloida internalizovanog po ćeliji (sl. 7A i B).

Nasuprot tome, slobodna Tesa nije dala poboljšanja u fagocitozi -amiloida. Superiorni efekti D-Tese u odnosu na Tesa se vjerovatno mogu pripisati poboljšanoj ćelijskoj internalizaciji omogućenoj konjugacijom dendrimera.

Ovo je u skladu s prethodnim radom koji je pokazao da je preko 95% BV2 ćelija tretiranih fluorescentno označenim G4-PAMAM-OH internaliziralo dendrimer u roku od trideset minuta i nastavilo da internalizira dendrimer najmanje 24 sata.76

Slično tome, konjugacija male molekule minociklina sa fluorescentno označenim G4-PAMAM-OH pokazala je da je 99% BV2 ćelija internaliziralo fluorescentno označeni konjugat dendrimer-lijek u roku od 3 sata.26 Oni su također pokazali da konjugat smanjuje superiorne nivoe azotoksida besplatnom lijeku nakon tretiranja BV2 stanica LPS-om, u skladu s našim rezultatima.

Ćelije tretirane sa D-Tesaphagocytosed 1.9-put više -amiloida nego LPS-tretirane kontrolne ćelije (p < 0.001), što je uporedivo sa 2.5- puta povećanjem -amiloidne fagocitoze primarnih mikroglijalnih ćelija pacova tretiranih pioglitazonom o kojima su izveštavali Yamanaka i saradnici.73 Nešto veći stepen -amiloidne fagocitoze u prethodnoj studiji mogao bi biti ili zato što nisu tretirali svoje ćelije zajedno sa LPS-om kao što smo mi, ili zato što primarna mikroglija eksprimuje PPAR na viši nivo od BV2 ćelija korištenih u ovoj studiji.77

Kao takva, doza D-Tesa niža od one procijenjene iz in vitro eksperimenata u našoj studiji vjerovatno može biti efikasna in vivo studija i ljudi, budući da je poznato da BV2 ćelije eksprimiraju PPAR na nižim razinama od primarne mikroglije.77

Mikroglija je uključena u mnoge neurodegenerativne bolesti, a BBB je spriječio mnoge lijekove koji mogu modifikovati fenotip mikroglije od proupalnog, neurotoksičnog M1 fenotipa u protuupalni, neuroprotektivni M2 fenotip da dosegnu terapeutske nivoe u mozgu.56 14,15

Na primjer, dva PPAR agonista, pioglitazon i rosiglitazon, ispitani su kroz klinička ispitivanja faze III za Alchajmerovu bolest zbog njihove sposobnosti da mijenjaju fenotip mikroglije, ali vjerovatno nisu uspjeli zbog lošeg transporta kroz BBB.13,14 Dakle, postoji klinički interes za promjenu fenotip mikroglije u neurodegenerativnim bolestima.

Takav pristup zahtijeva isporuku lijeka u mikrogliju u dovoljnim količinama da izazove odgovor. U tom cilju, pokazalo se da G4-OH-PAMAM dendrimeri isporučuju lijekove u mikrogliju na mnogim životinjskim modelima nakon sistemske injekcije, i kao rezultat toga, trenutno se procjenjuju u kliničkim ispitivanjima za liječenje ccTLD (NCT03500627) i teškog COVID-a -19 povezana upala (NCT04458298).18–28

Kako bismo kombinovali blagotvorne efekte promjene mikroglijalnog fenotipa sa sposobnošću isporuke lijekova u mikrogliju, konjugirali smo tesaglitazar (PPAR/dvostruki agonist) na G4-OH-PAMAMdendrimer (sl. 1–3). Pokazali smo da je D-Tesa sposobna da promijeni fenotip M1 mikroglije prema M2 fenotipu (sl. 4 i 5), što rezultira smanjenjem lučenja štetnih reaktivnih vrsta kisika.

Nadalje, pokazali smo da mikroglije tretirane sa D-Tesom povećavaju ekspresiju enzima koji razgrađuju patološke proteine ​​kao što su -sinuklein i -amiloid, kao i regulaciju fagocitoze -amiloida u funkcionalnom testu (sl. 6 i 7).

Iako ne predstavljamo podatke koji pokazuju sposobnost D-Tese da zaobiđe BBB i akumulira u mikrogliji, ranije smo pokazali da G4-OH-PAMAM konjugati lijeka sa sličnim opterećenjem lijeka, veličinom i zeta potencijalom mogu proći kroz oslabljen BBB i akumulacija inmikroglije nakon intravenske primjene.26,36,52

Ovi rezultati podržavaju dalji razvoj D-Tese za liječenje višestrukih neuroloških bolesti. Dok se u ovom radu fokusiramo na Alchajmerovu i Parkinsonovu bolest, D-Tesa ima potencijal za kliničko prevođenje više neuroloških poremećaja. Zbog slične uloge mikroglije u patologiji višestrukih neurodegenerativnih bolesti, PPAR agonist pioglitazon je također istražen oris koji se trenutno istražuje u kliničkim ispitivanjima faze II za Parkinsonovu bolest,78 ALS,79 adrenomijeloneuropatiju(NCT03864523), multiplu sklerozu310N280 rezolucija intracerebralnog krvarenja (NCT00827892).

Ako i ova klinička ispitivanja ne uspiju zbog loše isporuke pioglitazona preko BBB-a, D-Tesa bi mogla prevladati ovu prepreku isporuke i liječiti pacijente s ovim bolestima.

Druge grupe su koristile nanočestice da poboljšaju isporuku agonista PPAR do makrofaga, ali nisu pokušale da isporuče ove agoniste u mikrogliju. Osinski i saradnici su pokazali da su liposomi napunjeni Tesa-om uglavnom preuzimani od strane makrofaga u visceralnoj bijeloj masti u muškom modelu gojaznosti s nedostatkom leptina.80

Dodatno su pokazali da liposomi napunjeni Tesa-om nisu promijenili ekspresiju M1 markera Mcp-1, ali su povećali ekspresiju M2 markera Arg1, dok je tretman slobodnom Tesa smanjio ukupan broj M1 makrofaga i ekspresiju Mcp{{6 }}, i nije povećao izraz Arg1.

Nakashiro et al. korištene poli(mliječna-ko-glikolna kiselina) (PLGA) nanočestice za isporuku pioglitazona (PPAR agonista) makrofagima u kontekstu ateroskleroze.81

In vivo, oni su pokazali da PLGA-pioglitazon smanjuje nivoe imunih ćelija u krvi. Primarni makrofagi izvedeni iz koštane srži tretirani LPS i interferonom, otkrili su da PLGA-pioglitazon povećava IL-4 i IL-10 (M2 markere) i ne smanjuje nivoe IL-6 ili TNF.

Njihovi nalazi su slični našim; M2 markeri su povećani tretmanom agonistom nanočestica-PPAR, dok se nivoi IL-6 i TNF-a nisu smanjivali. Di Mascolo i dr. koristio nanočestice PLGA-polivinil alkohola za isporuku rosiglitazona (još jedan PPAR agonist).82

In vitro su pokazali da njihovi kompleksi nanočestica-lijek smanjuju ekspresiju iNOS, TNF- i IL-1 u makrofagima koji potiču iz koštane srži. Oni su svoje ćelije prethodno tretirali lijekom nanočestica prije stimulacije LPS-om, dok smo mi prethodno tretirali ćelije LPS-om prije tretmana sa D-Tesom, što bi mogao biti razlog zašto nismo primijetili smanjenje TNF-a i IL-1, iako smo također primijetili smanjenje iNOS ekspresije.

Zaključak

Trenutno ne postoji terapija koja mijenja patologiju za mnoge neurodegenerativne bolesti, a kako populacija stari, prevalencija i troškovi liječenja ovih bolesti će nastaviti rasti, naglašavajući hitnu potrebu za razvojem rješenja. Nedavno je proinflamatorna M1 mikroglija kritična u patologiji višestrukih neurodegenerativnih bolesti.

Posljedično, sposobnost isporučivanja lijeka kroz krvno-moždanu barijeru koji može inducirati promjenu fenotipa 'M1 do M2' u mikrogliji ima terapeutski potencijal za više bolesti, posebno za Alchajmerovu i Parkinsonovu bolest.

D-Tesa je dizajnirana da isporuči lijek koji inducira 'M1 do M2' u mikrogliju nakon sistemske primjene kako bi se smanjilo mikroglijalno lučenje neurotoksičnih supstanci, dok je također izazvalo protuupalno stanje koje povećava degradaciju i fagocitozu patogenih proteina u mozgu. Uspješno smo sintetizirali D-Tesu koristeći visoko efikasan pristup kemijskoj kemiji.

Lijek je vezan za dendrimer preko esterske veze koja se može cijepati intracelularno u lizosomskim uvjetima, pri čemu se otprilike 60% Tesa oslobađa u prvih 48 sati pod lizosomskim uvjetima.

Pokazalo se da je D-Tesa bolja od Tesa in vitro u izazivanju promjene M1 u M2a/M2b/M2cfenotip, što je rezultiralo smanjenom sekrecijom dušikovog oksida, povećanom ekspresijom enzima -sinukleina i -amiloida i povećanom fagocitozom -amiloida.

Dakle, D-Tesa kombinuje korisna svojstva isporuke dendrimera, sa svojstvima prebacivanja M1 na M2 Tesa. Zbog zajedničke uloge mikroglije i zajedničke terapijske koristi izazivanja promjene fenotipa M1 u M2, D-Tesa ima potencijal za liječenje mnogih neuroloških poremećaja kada se primjenjuje u pravom stadiju progresije bolesti.

Doprinosi autora

LD, AS, KL, RS, SK i RMK su koncipirali eksperimente. LD, AS i RS su izvršili sintezu i karakterizaciju konjugata dendrimer-lijek. LD, KL i JJ su izveli eksperimente na ćelijama. LD andK. L. je izvršio statistiku. LD i AS su napisali rukopis, a svi autori uredili rukopis.

Sukobi interesa

RMK i SK su izumitelji korištenja dendrimera sa hidroksil-terminiranim dendrimerom za ciljanu isporuku u mikrogliju kod neuroloških bolesti, kao i patente koji se odnose na dendrimer tehnologiju opisanu u ovom radu.

Oni su suosnivači kompanija Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. i RiniSight Inc., koje su kompanije koje vode klinički razvoj platforme. SK i RMK su članovi odbora AshvatthaTherapeutics Inc. RS je trenutno zaposlen u AshvatthaTherapeutics i posjeduje dionice u kompaniji; the workR. S. koji je izveo za ovaj rad urađen je prije nego što se pridružio Asvatthi. Sukobom interesa upravlja Univerzitet JohnsHopkins.

Priznanja

Željeli bismo zahvaliti Elizabeth Smith Khoury na korisnim raspravama o in vitro eksperimentima. Ovaj projekat je finansirao Patz Distinguished Professorship Endowment iz JohnsHopkinsa i NICHD-a (broj granta HD076901) (RMK). Zahvaljujemo se Wilmer Core Grant-u za istraživanje vida, mikroskop i osnovni modul (broj granta EY001865) za pristup protočnom citometru Sony.

Zahvaljujemo Servier Medical Arts-u na korištenju njihove kolekcije slika (http://smart.servier.com/) koja je licencirana pod Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense, koja je modificirana da napravi grafički sažetak.

Reference

1 CL Gooch, E. Pracht i AR Borenstein, Teret neurološke bolesti u Sjedinjenim Državama: sažeti izvještaj i poziv na akciju, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf i K. Zhong, cijev za razvoj lijekova za Alchajmerovu bolest: malo kandidata, česti neuspjesi, Alchajmerova rez. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng i J.-S. Kang, Istorija i napredak hipoteza i kliničkih ispitivanja za Alchajmerovu bolest, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto i S. Pritzkow, Pogrešno savijanje proteina, agregacija i konformacijski sojevi kod neurodegenerativnih bolesti, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry i C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang i W. Le, Diferencijalne uloge M1 i M2 mikroglije u neurodegenerativnim bolestima, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter i B. Stevens, Microglia se pojavljuje kao glavni akter u bolesti mozga, Nat. med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., TREM2-APOE put pokreće transkripcijski fenotip disfunkcionalne mikroglije u neurodegenerativnim bolestima, Imunitet, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., Učinci pioglitazona slični antidepresivima u modelu miša s kroničnim blagim stresom povezani su s PPAR-posredovanom promjenom fenotipa mikroglijalne aktivacije, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarizacija mikroglije na fenotip M2 na način ovisan o receptoru koji je aktiviran proliferatorom peroksizoma, gama ovisan o smanjenju aksonalne ozljede uzrokovane traumatskom ozljedom mozga kod miševa, J. Neurotrauma, 2018, 30303030302323.

11 W. Cai, et al., Receptor aktiviran proliferatorom peroksizoma (PPAR): Glavni čuvar kapije kod povreda i popravke CNS-a, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Upotreba glitazona povezana sa smanjenim rizikom od Parkinsonove bolesti, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com